בידוד ואפיון המיקרוביוטה הטבעית של מודל נמטודה Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מאפשר תובנות חדשות על המיקרוביוטה הטבעית של C.elegans. במקביל, ניתן להשתמש במיקרובים המבודדים בניסויי מעבדה מבוקרים כדי לאפיין אינטראקציות בין מיקרוביוטה למארח ואת הביולוגיה של C.elegans. פרוטוקול זה מתמקד בבידוד מיקרובים הקשורים ל-C.elegans בטבע, ולכן הם המפתח להבנת הביולוגיה של מארח מודל חשוב זה בהקשר טבעי יותר.

זה יהיה מועיל להכיר את המראה של Caenorhabditis לעומת נמטודות אחרות. צנרת תחת היקף הניתוח יכולה להיות בתחילה מאתגרת, אך תרגול יעזור. התחילו באיסוף דגימות סביבתיות כמו קומפוסט או פירות רקובים בשקיות פלסטיק נפרדות, צינורות או מיכלים נקיים.

פזרו באופן שווה את חלקי הדגימות הסביבתיות שנאספו בצלחת פטרי סטרילית ריקה באורך תשעה סנטימטרים והוסיפו כ-20 מיליליטר של מדיום צמיג סטרילי כדי לכסות את הדגימה במדיום. תחת מיקרוסקופ הניתוח, חפש נמטודות Caenorhabditis בהתאם להנחיות לבידוד Caenorhabditis elegans ונמטודות קשורות. באמצעות פיפטה של 20 עד 100 מיקרוליטר, לאסוף את הכמות הקטנה ביותר האפשרית של נוזל המכיל את נמטודות Caenorhabditis מהצלחת ולהעביר אותו לצלחת פטרי שלושה סנטימטרים המכילה אחד עד שלושה מיליליטר של M9T סטרילי.

כדי לבסס אוכלוסיית תולעים, ניתן להעביר את התולעים הבודדות לצלחת עם מדיום גידול נמטודה או NGM. כדי לשטוף את הנמטודות ולהסיר את המיקרובים הנמצאים מחוץ לנמטודות, דגרו אותם ב-M9T למשך 10 עד 15 דקות. הוציאו את הכמות הקטנה ביותר האפשרית של נוזל המכיל את הנמטודות והעבירו אותו לצלחת פטרי סטרילית חדשה באורך שלושה סנטימטרים המכילה מיליליטר אחד עד שלושה מיליליטר של M9T טרי.

לזיהוי בלתי משוחד של מיקרובים הקשורים לנמטודה, הכינו צלחת 96 באר עם כשלושה חרוזים סטריליים בקוטר מילימטר אחד והוסיפו תערובת של 19.5 מיקרוליטר של חיץ PCR ו-0.5 מיקרוליטר של פרוטאינאז K לכל באר. מעבירים נמטודה שטופה אחת לכל באר עם כמה שפחות נוזלים. לשבור את הנמטודות המועברות באמצעות הומוגנייזר חרוז במשך שלוש דקות ב 30 הרץ צנטריפוגה את הצלחות או צינורות ב 8, 000 G במשך 10 שניות בטמפרטורת החדר כדי לקבל את הנוזל לתחתית.

כדי לזהות C.elegans, חממו את הדגימות במחזור PCR למשך שעה אחת בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס ו-15 דקות ב-95 מעלות צלזיוס כדי לבודד דנ"א של נמטודות בודדות, או השתמשו בערכות מסחריות כדי לבודד דנ"א של אוכלוסיות תולעים. הקפיאו את הדנ"א המבודד בטמפרטורה של מינוס 20 מעלות צלזיוס לאחסון לטווח ארוך. השתמש בדנ"א ובזוג הפריימרים NLP 30 קדימה ו- NLP 30 לאחור ולייצר מוצר PCR של זוג בסיסים 154.

כדי לבודד את החיידקים, הכינו צלחת בת 96 בארות עם כשלושה חרוזים סטריליים של מילימטר אחד, 20 מיקרוליטרים של חיץ M9 לכל באר, ופיפטה נמטודה אחת שטופה לכל באר עם כמה שפחות נוזלים. שברו את הנמטודות כפי שהודגם לפני השימוש בהומוגנייזר חרוזים, ולאחר מכן צנטריפוגה קצרה של הצלחת כדי להביא את הנוזל לתחתית. לאחר שתסיימו, אספו את המתלים ודללו אותו באופן סדרתי ביחס של אחד עד 10.

צלחת עד 100 מיקרוליטר של המתלה המדולל על לוחות אגר של תשעה סנטימטרים. לאחר מכן לדגור את הצלחות ב 15 עד 20 מעלות צלזיוס במשך 24 עד 48 שעות. כדי להשיג את תרבית החיידקים הטהורה, בחרו מושבה אחת מצלחת הדגירה באמצעות לולאה סטרילית או קיסם ופזרו אותה על צלחת אגר חדשה המכילה את אותו מדיום אגר המשמש במהלך הטיהור.

הקפידו להשתמש רק ב-1/3 מהצלחת. לאחר מכן עקרו לולאה הניתנת לשימוש חוזר או השתמשו בלולאה סטרילית חדשה וגררו אותה דרך הפס הראשון כדי ליצור פס שני על חלק נוסף של 1/3 מלוח הדגימה. חזור עליו על ידי גרירת לולאה דרך הפס השני ויצירת הפס השלישי כדי להשיג את צמיחת המושבה הבודדת.

לדגור את הצלחת באותם תנאי גידול המשמשים לבידוד, ובמידת הצורך, לחזור על שלב הטיהור. לגדל את המושבות הטהורות במדיום נוזלי באמצעות אותה טמפרטורה ותנאי גדילה. לאחר מכן, אפיינו את החיידקים על ידי חילוץ הדנ"א החיידקי מתרביות נוזליות טהורות המגבירות את הרנ"א הריבוזומלי 16S באמצעות 27 פריימרים הפוכים קדימה ו-1495 וביצוע ה-PCR כמתואר בטקסט.

כאשר דגימות הפירות והקומפוסט שנאספו חולקו בצלחות פטרי ושקעו במדיום נוזלי או צמיג, זה גרם לתולעים לעזוב את חומר המצע ולשחות אל פני השטח של המדיום. המיקרובים בודדו כמושבות בודדות טהורות, והטיהור מילא תפקיד חיוני מכיוון שחלק מהחיידקים הקשורים ל-C.elegans יכולים ליצור ביופילמים או לצבור בקלות, וכתוצאה מכך נוצרו תרביות מרובות מינים. ה-PCR באמצעות פריימרים ספציפיים של C.elegans, כלומר NLP 30 קדימה ו-NLP 30 לאחור, הביא להגברה של מכפלת זוג בסיסים של 154 עבור C.elegans.

הדנ"א שבודד מתולעים בודדות הביא לרצועות PCR חלשות, ואילו מיצוי דנ"א מאוכלוסיות התולעים שכללו לפחות 50 תולעים הניב כמות גדולה יותר ופסים ברורים יותר. ההצלחה של C.elegans ספציפי PCR אושרה על ידי הרצת הדנ"א של זן מעבדה כלומר N2 כבקרה חיובית בו זמנית עם הדנ"א של הנמטודות המבודדות חיידקים נמצאים בכל מקום. לפיכך, חיוני לעבוד בתנאים סטריליים כדי להבטיח כי אותם חיידקים מבודדים קשורים באמת עם התולעת בטבע.

המיקרובים המבודדים יכולים לשמש לחקר אינטראקציות בין מיקרוביוטה לפונדקאי או את תפקידם של מיקרובים בביולוגיה של המארח, לדוגמה, הזדקנות, התפתחות או חסינות בניסויי מעבדה מבוקרים. מיקרובים המבודדים בטכניקה זו משמשים כיום את קהילת C.elegans כדי לשפר את ההבנה של מגוון המיקרוביוטה על כושר המארח או תפקידם של מיקרובים על חסינות.