שימוש בהדמיית in vivo לבדיקת פנוטיפים של מורפוגנזה בזנים מוטנטיים של קנדידה אלביקנס במהלך זיהום פעיל בפונדקאי של יונקים

המורפוגנזה של קנדידה אלביקנס מופעלת על ידי מספר עצום של אותות סביבתיים. על-ידי חקירת מורפוגנזה in vivo, אנו קובעים כיצד האורגניזם משתלב ומגיב לכל האותות הסביבתיים האלה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מאפשרת לנו לחקור מורפוגנזה בהיעדר הטיה או ממצאים שעשויים להיות מוצגים באמצעות מערכות מודל במבחנה.

מעט מאוד אנשים יש ניסיון עם זריקות intradermal. אני ממליץ בחום למישהו חדש בטכניקה זו ליצור קשר עם הווטרינר של משאבי בעלי החיים שלו לקבלת עזרה בלמידה. מי שידגים את ההליך יהיה רוהאן וואקאדה, פוסט-דוקטורנט מקבוצת המעבדה שלנו.

התחילו בהכנת בעל החיים לחיסון על ידי האכלת צ'או נטול כלורופיל במשך שבעה ימים לפחות לפני החיסון. יום אחד לפני ההזרקה, קח דאב של תאי אלביקנס מקנדה ממושבה אחת באמצעות קיסם. לחסן 25 מיליליטר של YPD ולחזור על תהליך זה מספר פעמים כדי לקבל תאים מכמה מושבות שונות.

דגירה של התרבית למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס באינקובטור שייקר מסלולי ב-175 סל"ד. צנטריפוגה מיליליטר אחד של תרבית במשך שתי דקות ב 500 x גרם, ולאחר מכן לשטוף את השמרים שלוש פעמים עם מיליליטר אחד של DPBS סטרילי. יש להשעות את הכדור במיליליטר אחד של DPBS סטרילי ולדלל את התרבית ב-1 עד 100.

לספור את התאים באמצעות hemocytometer ובהתאם להתאים את צפיפות התא. לאחר מכן, צור את האינוקולום להזרקה על ידי ערבוב נפחים שווים של הזן המוזכר והניסיוני. באמצעות צמר גפן, יש למרוח קרם דפילציה ללא מרשם בנדיבות על פני השטח הפנימיים והחיצוניים של שתי האוזניים של חיה מורדמת.

לאחר שתיים עד שלוש דקות, נגבו בעדינות את האוזן עם גזה יבשה ואחריה רפידות גזה רוויות במים סטריליים כדי להסיר ביסודיות שאריות קרם דפילציה. לאחר עיקור פני השטח של האוזניים עם 70% אתנול, מערבבים היטב את האינוקולום על ידי היפוך הבקבוקון מספר פעמים או מערבולת אותו. ציירו 20 עד 30 מיקרוליטרים של אינוקולום לתוך מזרק אינסולין.

החזיקו את המחט במצב זקוף וטפחו על המזרק בעדינות כדי לוודא שכל האוויר בחבית נמצא בחלק העליון. יש לפלוט בזהירות אוויר ועודפי אינוקולום בחזרה לצינור האינוקולום או לצינור פסולת, כך שהבוכנה תהיה בסימן 10 מיקרוליטר. יש למרוח ללא מרשם סרט עור דו-צדדי על צינור פלסטיק חרוטי קטן או בעל תחתית עגולה ולעטוף את האוזן על פני הקלטת, תוך הימנעות מהסרת חרוט האף בהרדמה.

שמירה על מחט המזרק כמעט במקביל לעור והימנעות מכל ורידים גדולים, להחדיר את קצה המחט לתוך השכבה החיצונית ביותר של העור עד השיקוע הוא רק מכוסה לאט לאט להזריק את inoculum intradermally. הזרקה תוך-עורית טובה תעלה בועה קטנה בעור. יש לשמור את המחט במקומה למשך 15 עד 20 שניות לפני הסרתה מהאוזן כדי למזער את הדליפה.

בהתאם לפרוטוקולים המוסדיים, סמנו את הכלוב בתוויות ביו-האזר המציינות כי בעלי החיים בכלוב נגועים בקנדידה אלביקנס. באמצעות אותן תרביות שטופות ששימשו להכנת האינוקולום, יוצרות דילול של 1 עד 50 תאים ב-RPMI 1640, בתוספת 10% חום וסרום בקר עוברי פעיל ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם רטט במשך ארבע שעות. בחן את הדגימה באמצעות מיקרוסקופ.

סופרים לפחות 100 תאים, ורושמים את מספר תאי השמרים והתאים הננימים עבור כל זן. סובבו את מטרת מרחק העבודה הארוך למקומה והניחו טיפה של נוזל טבילה על העדשה. הנמיכו את העדשה כדי למנוע נזק אפשרי בעת הנחת הכיסוי.

מניחים את הכיסוי מספר 1.5 מחליקים מעל פתח הבמה ומדביקים אותו למקומו. הרם את המטרה כך שנוזל הטבילה יהיה במגע הן עם העדשה האובייקטיבית והן עם החלקת הכיסוי. אבטחו חרוט אף הרדמה על במת המיקרוסקופ באופן כזה שהוא יכסה את האף של החיה במלואה כאשר היא נמצאת במצב הדמיה.

מקם את אפו של עכבר מורדם לתוך חרוט האף. הניחו טיפת מים סטריליים על הכיסוי מעל העדשה האובייקטיבית. התאם את חרוט האף בהרדמה ומקם את העכבר כך שאוזנו של העכבר תהיה מעל טיפת המים.

קח תלוש כיסוי נוסף והנח את קצה הכיסוי במקביל לגוף העכבר כאשר הקצה נוגע בעכבר במקום שבו האוזן פוגשת את הראש. באמצעות תנועת ציר, הורידו את הקצה החופשי של הכיסוי אל שלב המיקרוסקופ. כאשר החלקת הכיסוי מגיעה כנגד שלב המיקרוסקופ, היא תשטח את האוזן.

הדביקו את הכיסוי העליון כדי להחזיק מספיק לחץ כדי לשמור על האוזן שטוחה ולהימנע מלתפוס את שיער העכבר או שפמו בקלטת. אלא אם כן נעשה שימוש במיקרוסקופ עם תא סביבתי, לכסות באופן רופף את גוף העכבר עם וילון סטרילי כדי לשמור על סביבה תרמית רגילה. באמצעות אור לבן, הדמיית שדה רחב, התאמת מישור המיקוד לרקמת האוזן והתמקדות בתאי הדם האדומים הנעים בכלי הדם.

כדי לקבל יחס אות לרעש חזק מספיק כך שניתן יהיה לקבוע מורפולוגיה עבור כל התאים בשדה הראייה, התאם את עוצמת הלייזר או את מהירות ההדמיה. כדי למנוע נזק לרקמות, השתמש בעוצמת הלייזר הנמוכה ביותר האפשרית. בחרו שדה ראייה עם היווצרות נימה ברורה בזן המוזכר ושבו רוב האורגניזמים מפוזרים מספיק כדי שניתן יהיה לקבוע את המורפולוגיה שלהם.

הגדר את מישור המיקוד העליון והתחתון עבור ערימת Z. כיסוי כל עומק האזור הנגוע אינו הכרחי, אך יש לזכור כי אורגניזמים בחלק העליון או התחתון של נפח התמונה בדרך כלל אינם נכללים בניתוח. רכשו תמונות Z-stack, צבע מדומה בכל ערוץ כדי להבחין בין כל זן ולכסות את הערוצים.

שמור את התמונות. השתמש בתוכנת הדמיה כדי לבצע הקרנה מרבית של מחסנית Z לתמונה דו-ממדית. ספרו כל אורגניזם שנראה בתמונות ההקרנה המרביות לפי סוג זן ומורפולוגיה.

הזן המוזכר יוצר במהירות חוטים במבחנה. ואילו EFG1 Null לא הצליח ליצור את החוטים. EFG1 Null מציג פגם נימה משמעותי in vivo גם כן.

כ-9% מתאי EFG1 Null גדלו כחוטים in vivo. באופן דומה, הזן המוטנטי CYR1 Null הראה פגם נימה במבחנה בהשוואה לזן שאליו התייחסו. לעומת זאת, 53% מהתאים המוטנטיים של CYR1 Null גדלו כחוטים in vivo.

החוטים שנוצרו על ידי מוטנט CYR1 Null היו קצרים יותר מהזן המוזכר. חשוב לשמור על המחט במקביל לעור במהלך החיסון. המטרה היא למקם את האינוקולום ממש מתחת לשכבה החיצונית של העור.

ניתן להשתמש בטכניקה זו גם עם זני עכברים המבטאים חלבון פלואורסצנטי בתאים מארחים בעלי עניין, מה שמאפשר לנו לחקור אינטראקציות של פתוגנים מארחים in vivo.