כימות ניסיוני של אינטראקציות בין מערכות העברת תרופות ותאים במבחנה: מדריך להערכת ננו-רפואה פרה-קלינית
September 28th, 2022
תהליך עבודה מודגם לכימות מוחלט של אינטראקציות בין נשא תרופה לתאים באמצעות ציטומטריה של זרימה כדי לאפשר הערכה רציונלית טובה יותר של מערכות אספקת תרופות חדשות. זרימת עבודה זו חלה על ספקי סמים מכל סוג שהוא.
פרוטוקול זה מספק נתונים כמותיים על האופן שבו מערכות נשאים מתקשרות עם תאים. נתונים כמותיים הם המפתח להנדסה ואופטימיזציה. זה מאפשר לנו לעבור משאלות ביולוגיות של כן או לא, לכמה שאלות.
טכניקה זו שימושית להמרת תוצאות מביצועי נשא תרופה פרה-קליניים, שהיו איכותיים, לתוצאות כמותיות. וזה עובד גם כשאתה מאפיין את הנשא שלך במערכת שונה ממה שאתה מאפיין את התאים שלך. זה יכול לקחת כמה איטרציות כדי למצוא את דילול הנשא האופטימלי שנמצא בטווח הליניארי או הכמותי של הצד הננו.
קח את הזמן שלך למציאת התנאים הנכונים. כדי להתחיל, הרכב את תא הזרימה על מודול הלייזר. לאט לאט לשטוף את תא הזרימה בקצב של 0.1 מיליליטר לשנייה עם מיליליטר אחד של מים מזוקקים.
אם נוצרות בועות בתוך תא הזרימה, יש לסגת חלקית מההשעיה כדי למזג את הבועה עם ממשק האוויר-נוזל לפני שתמשיך. לאחר מכן נעל את כל מודול הלייזר במקומו בתוך המכשיר. הפעל את המצלמה בערך באמצע ההדחה.
הקפד לאשר כי פסולת המוביל נשטף החוצה. בחר לכידה כדי לפתוח את לשונית הגדרות הלכידה ולחץ על התחל מצלמה. כונן את המערכת עם מיליליטר אחד של אוויר.
אם נשאים סטטיים כלשהם נראים על המסך, נקה את תא הזרימה בהתאם להוראות היצרן. הכן את הנשאים לניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים, על ידי וידוא שהנשאים תלויים היטב באמצעות סוניקציה או מערבולת, בהתאם למערכת הנשאים המעורבת. לדלל את הנשאים במים כדי להכין לפחות 0.6 עד מיליליטר אחד של כל דגימה עם ריכוז המוביל בין 1x10 לשביעי ו 1x10 עד התשיעי נשאים למיליליטר.
הוציאו את מודול הלייזר והניחו אותו זקוף. שחרר את דגימת המוביל הראשונה לתוך מזרק מיליליטר אחד וחבר את המזרק לכניסת הצינור. לאחר מכן טען בזהירות את הדגימה לתא הזרימה.
אם נוצרות בועות בתוך תא הזרימה, חזור על המתלה באופן חלקי כדי למזג את הבועה עם ממשק האוויר-נוזל לפני שתמשיך. ודא שתא הזרימה כולו מלא בנוזל, ולאחר מכן השהה את הטעינה. כוונן את מיקוד המצלמה במידת הצורך כדי לדמיין ספקים בודדים.
בצע כוונוני מיקוד גסים באמצעות הידית המסתובבת בצד ימין של המכשיר. בצע התאמות עדינות יותר על-ידי בחירה בכרטיסיה 'חומרה'. שנה את המיקוד על-ידי התאמת מחוון המיקוד.
כדי להבטיח שאין עודף משקל, בחר את רמת המצלמה האופטימלית על-ידי התאמת המחוון בתוך לשונית הצילום. אם המכשיר מצויד באביזר זה, טען את המזרק המכיל את דגימת המוביל לתוך משאבת המזרק. תחת הכרטיסייה SOP, בחר מדידה רגילה כדי לבצע חמש לכידות של 30 שניות כל אחת.
הזן את שם קובץ הבסיס, ואם תרצה, הוסף מידע נוסף לדוגמה על ידי לחיצה על הלחצן המתקדם שיפתח דיאלוג מודאלי עם אפשרויות שונות. לחץ על צור והפעל סקריפט והמתן עד שיופיע חלון קופץ המבקש בבקשה דוגמה מוקדמת. אם אתה משתמש במשאבת המזרק, בחר את הכרטיסייה חומרה ולאחר מכן את הכרטיסייה משאבת מזרק.
קבעו את קצב העירוי הרצוי ולחצו על infuse. אם אינך משתמש במשאבת המזרק, קדם את הדגימה באופן ידני. בחלון הקופץ, בחר אישור כדי להתחיל ללכוד.
לאחר כל אחת מחמש הלכידות, כאשר הדגימה המתקדמת מופיעה שוב, בדוק שהדגימה עדיין נעה בתא הזרימה. לאחר מכן בחר אישור כדי להמשיך עם הלכידה הבאה. בכרטיסיה תהליך, התאם את מחוון סף הזיהוי בין ארבע לשמונה כדי לזהות נכונה ספקים נפרדים הנראים על המסך.
אתה יכול להתאים את רווח המסך כדי לסייע בהדמיה, זה לא ישפיע על הניתוח במורד הזרם. בחלון המוקפץ, לחץ על אישור כדי ליזום ניתוח מעקב. עקוב אחר התקדמות הניתוח על ידי לחיצה על הניתוח בכרטיסיית ניתוח אחת.
לאחר סיום הניתוח, חפש בקשה להגדרות ייצוא שתופיע. ודא שהאפשרות 'כלול מסמך PDF וכלול סיכום ניסוי' נבחרה. בחר תבניות ייצוא אחרות כרצונך.
במקטע התוצאות של ייצוא נתוני PDF, כדי להבטיח שהריכוז שנמדד אמין, ודא שריכוז המוביל הנמדד הוא בין 1x10 לשביעי ובין 1x10 לתשיעי למיליליטר ובדוק אם יש הודעות שגיאה או הודעות אזהרה מתחת לתוצאת מדידת הריכוז. חזור על ההליך פעמיים או יותר עם דילולים שונים מהמלאי, וודא שהריכוז של כל דגימה נמצא בטווח הליניארי של המכשיר. חשב את ריכוז נושאת המניות כמתואר בכתב היד של הטקסט.
הכן את תמיסת הפלואורוכרום המצומדת החופשית או נוגדנים כמתואר בכתב היד של הטקסט. חשב את ריכוז תמיסת המניות מהריכוז, המשקל המולקולרי ומספר אבוגדרו כפי שמוצג במשוואה. לאחר מכן בצע דילול סדרתי של הצבע במדלל המוביל כדי ליצור דגימות עקומה סטנדרטיות.
לאחר מכן הוסף את דגימת המוביל ללוח המדידה ומדוד פלואורסצנטיות באמצעות קורא microplate. צור את העקומה הסטנדרטית כמתואר בכתב היד של הטקסט. חשב את עוצמת הפלואורסצנציה המוחלטת לכל נשא על ידי חלוקת הפלואורסצנציה בתפזורת בריכוז הנשא.
הגדר את ציטומטר הזרימה לניסוי הסופי בתא המוביל על ידי קביעת הגדרות מתח PMT אופטימליות בערוצים הרלוונטיים. הפעל דגימת בקרה שלילית שבה התאים אינם מודגרים עם נשאים כדי לקבוע את פלואורסצנציה ברקע. הכן והשהה מחדש את חרוזי כמות הציטומטריה של הזרימה.
השתמש באותו מאגר המשמש לדגימות התאים. אם אוכלוסיות החרוזים מסופקות בנפרד, משכו אותן יחד. הפעל את חרוז הכמות של ציטומטריה של זרימה ואת דגימות התאים הנשאים כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנטיות לכל תא.
הפעל את חרוזי הכמות של ציטומטר הזרימה כדי ליצור עקומה סטנדרטית, תוך המרת עוצמת הפלואורסצנט המוחלטת ל- MFI. השתמש באפשרות זו כדי לחשב את ה- MFI התיאורטי של הספקים כמתואר בכתב היד של הטקסט. הפעל את דגימות נשא התא כדי לקבוע את עוצמת הפלואורסצנט לכל תא של כל דגימה.
לבסוף, חשב את מספר הנשאים לתא עבור כל דגימה על ידי הפחתת פלואורסצנטיות הרקע מהפלואורסצנציה הנמדדת של הדגימה, ולאחר מכן חלוקה בפלואורסצנציה לכל חלקיק. עבור חלקיקי קליפת חומצה פולימתקרילית בגודל 633 ננומטר, הריכוז והעוצמה הפלואורסצנטית לכל נשא היו ניתנים לכימות ישיר באמצעות זרם הציטומטר. לעומת זאת, ננו-חלקיקים של תחמוצת ברזל סופר-פאראמגנטית של 100 ננומטר היו קטנים מכדי לזהותם בנפרד ונותחו באמצעות זרם התפזורת.
חרוזי כמות מסומנים שימשו במשך מספר ימים ליצירת עקומות סטנדרטיות על ציטומטר זרימה. המתאם בין ה-MFI שנמדד לבין ערך ה-MESF של חרוזי הכמות היה ליניארי ודומה באופן נרחב בין התאריכים שנמדדו. ניסויים במסלול הזמן באמצעות תאי HeLa המסומנים בפלואורסצנט עם כמוסות חומצה פולימתקרילית של 235 ננומטר מאפס עד 24 שעות הראו עלייה ב- MFI לאורך זמן, מה שמצביע על כך שהכמוסות היו קשורות לתאי HeLa.
ההבדל בתגובה התאית לכאורה לנשאים היה בולט, תלוי בכימות יחסי או מוחלט. הכימות המוחלט היה בלתי תלוי בעוצמת התיוג ולכן דומה יותר. טכניקות אלה הן הבסיס לניתוח מעמיק יותר ולהשוואה של ביצועי החלקיקים.
אנו נרגשים מהשימוש בטכניקות אלה כדי ליצור פרמטרים של מודלים מתמטיים שיאפשרו לנו לאפיין את ביצועי החלקיקים ללא תלות בניסוי מסוים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מספק תהליך עבודה לכימות מוחלט של אינטראקציות בין נשאי תרופות ותאים באמצעות ציטומטריה של זרימה. הוא מאפשר הערכה רציונלית של מערכות מסירת תרופות חדשניות ויכול לשמש לסוגים שונים של נשאי תרופות.
מרכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- מערכות מסירת תרופות
- אינטראקציות תאיות
- ניתוח כמותי
רקע
- נתונים כמותיים הם חיוניים להנדסה ולאופטימיזציה של נשאי תרופות.
- גישה זו מעבירה את ההתמקדות משאלות ביולוגיות בינאריות להערכות כמותיות.
- היא מאפשרת את ההמרה של תוצאות פרה-קליניות איכותיות לנתונים כמותיים.
- הטכניקה יכולה לשמש אפילו כאשר מאפיינים נשאים ותאים במערכות שונות.
מטרת המחקר
- לספק שיטה לכימות אינטראקציות בין נשאי תרופות לתאים.
- להעמיק את ההבנה של ביצועי נשאי תרופות.
- להקל על אופטימיזציה של מערכות מסירת תרופות.
שיטות ששימשו
- ציטומטריה של זרימה לכימות אינטראקציות.
- בדיקות איטרטיביות כדי לקבוע את הדילול האופטימלי של הנשאים.
- אפיון של נשאים ותאים במערכות נפרדות.
- ניתוח תוצאות כדי לוודא שהן נמצאות בטווחים ליניאריים.
תוצאות עיקריות
- הוכח תהליך עבודה לכימות אינטראקציות.
- זוהו תנאים אופטימליים לאפיון נשאים.
- סופקו תובנות כמותיות לגבי ביצועי נשאי תרופות.
- אפשר מעבר מניתוח איכותי לניתוח כמותי.
מסקנות
- תהליך העבודה משפר את ההערכה של מערכות מסירת תרופות.
- נתונים כמותיים הם חיוניים עבור הנדסה עתידית של נשאי תרופות.
- שיטה זו ניתנת להתאמה לסוגים שונים של נשאי תרופות.
שאלות נפוצות
Chapters in this video
0:05
Introduction
0:45
Preparation
1:58
Measurement
3:53
Analysis
5:11
Determination of the Absolute Fluorescence Intensity per Carrier
5:56
Cell Experiment
7:08
Results: A Two-Stream Methodology to Convert Relative, Semiquantitative Flow Cytometry Cell-Carrier Association Data into Absolute Quantification
8:17
Conclusion
