מכניסטימולציה של אורגניזמים רב-תאיים באמצעות מערכת דחיסה מיקרופלואידית בעלת תפוקה גבוהה
December 23rd, 2022
הפרוטוקול הנוכחי מתאר תכנון, ייצור ואפיון של מערכת מיקרופלואידית המסוגלת ליישר, לשתק ולדחוס במדויק מאות עוברי Drosophila melanogaster עם התערבות מינימלית של המשתמש. מערכת זו מאפשרת הדמיה ברזולוציה גבוהה ושחזור של דגימות לניתוח לאחר גירוי וניתן לשנות את קנה המידה שלה כך שיתאים למערכות ביולוגיות רב-תאיות אחרות.
פרוטוקול זה מסביר כיצד לייצר ולהשתמש בטכנולוגיות מיקרופלואידיקה כדי למנף את היתרונות הניסיוניים בתפוקת הדגימות, בטיפול אוטומטי וביכולת להפעיל לחץ מכני באופן מדויק תוך הדמיה בו-זמנית של דגימות. טכניקה זו ממזערת את הטיפול הידני באורגניזמים ביולוגיים רב-תאיים, כגון עוברים ואורגנואידים, לצורך אימוביליזציה, יישור והדמיה חיה. היא גם מאפשרת ליישם להם דחיסה מכנית לצורך לימודי מכנוביולוגיה.
ייצור תבניות עם תכונות יחס גובה-רוחב גבוה עבור שבב מיקרופלואידי זה יכול להיות מאתגר עם טכניקות מיקרו-פבריקציה קונבנציונליות. הטיפים המוסברים במאמר וידאו זה יכולים להתגבר על אתגרים אלה. כדי להתחיל, לנקות את רקיק הסיליקון הראשון עם אצטון, ולאחר מכן עם אלכוהול איזופרופיל.
מניחים את פרוסת הסיליקון על פלטה חמה של 250 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. להתייבשות לאפות. מצפים את פרוסת הסיליקון בהקסמתיל-דיסילוקסן בתנור אדים ראשוני.
הניחו בקבוק של SU-8 2100 Photoresist בתנור של 60 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות כדי להפחית את צמיגותו. יוצקים מיליליטר אחד של הפוטורסיסט המחומם עבור כל סנטימטר של פרוסת הסיליקון המונחת על הפלטה החמה עד שה- Photoresist מכסה את רוב פני השטח. החל תחילה סיבוב מקדים ב-250 סיבובים לדקה למשך 30 שניות, ולאחר מכן ב-350 סיבובים לדקה למשך 30 שניות נוספות, שניהם עם האצה של 100 סל"ד לשנייה.
לאחר מכן, החל תחילה סיבוב במהירות של 500 סיבובים לדקה למשך 15 שניות עם האצה של 100 סל"ד לשנייה, ולאחר מכן ב-1, 450 סיבובים לדקה למשך 30 שניות עם האצה של 300 סל"ד לשנייה. הסירו את חרוז הקצה עם ספוגית נקייה לחדר, והתיזו אצטון על הוופל כדי להסיר פגמים ולקדם ציפוי אחיד. חשוף את פרוסת הסיליקון לאור UV מרובע של 350 מילי-ג'ול לסנטימטר דרך מסכת הצילום.
בעזרת מיישרת המגע, יש למרוח את האפייה לאחר החשיפה על פרוסת הסיליקון ולהניח לה להתקרר לטמפרטורת החדר. הניחו את הכוס בתוך גדולה יותר, ומלאו את הכוס הגדולה יותר בפתרון מפתח חדש. מניחים רשת מתכת על הכוס.
מניחים את פרוסת הסיליקון על רשת המתכת במהופך. השאירו את פרוסת הסיליקון שקועה במפתח במשך 30 דקות עם מערבל מופעל. מעבירים את פרוסת הסיליקון לתוך סוניק אמבטיה קולי מלא מפתח טרי במשך שעה אחת ב 40 קילוהרץ.
לאחר מכן הוציאו את הוופל מהכוס, ושטפו אותו בתמיסת מפתח חדשה. הכן את פתרון ה-PDMS שנרפא מראש על-ידי ערבוב בסיס ה-PDMS עם חומר הריפוי ביחס של 10 ל-1. דגה את התערובת על ידי הכנסתה לצנטריפוגה למשך 500 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.
שפכו את ה-PDMS שנרפא מראש על פרוסת סיליקון, והוציאו אותה שוב. לבסוף, הכניסו את ה-PDMS הלא מעובד לתנור של 60 מעלות צלזיוס לריפוי. השתמש באזמל כדי לחתוך את גבולות אזור PDMS שנרפא המתאים לגיאומטריה של השבב המיקרופלואידי.
נקב את חורי הכניסה והיציאה ב- PDMS באמצעות ניקוב ביופסיה, או מחט עם קצה קהה. הניחו את ה-PDMS על מגלשת הזכוכית כאשר המשטח המעוצב שלה פונה לכיוון מגלשת הזכוכית לאחר טיפול בפלזמה כדי לאטום את המיקרו-ערוצים באמצעות הדבקה קוולנטית. לאפשר לזבובים בוגרים של Oregon-R להטיל ביצים על צלחות אגר מיץ תפוחים, ולאסוף את הצלחות בזמן ההתפתחותי הרצוי לאחר הטלת הביצים לניסוי הנתון.
הציפו את האגר בשטיפת ביצי עוברים, והתסיסו בעדינות את העוברים במכחול כדי לנתק אותם מהאגר. מעבירים את העוברים לתמיסת אקונומיקה של 50% למשך 90 שניות, תוך ערבוב מדי פעם. מסננים את העוברים דרך מסננת רקמה, ושוטפים היטב את תמיסת האקונומיקה במים.
העבירו את העוברים לצלחת פטרי מזכוכית 90 מילימטר עם מספיק שטיפת ביצי עוברים כדי לכסות את העוברים במלואם. לבחון את העוברים עם טרנסילומינציה במיקרוסקופ מנתח, ולבחור עוברים בשלב ההתפתחותי הרצוי להעמסה לתוך המכשיר המיקרופלואידי. הגדירו את כל שבעת המיקרו-ערוצים של העוברים על ידי מילוים ב-0.4 מיקרומטר של IPA מסונן דרך פתח הכניסה הראשי של העובר.
החלף את ה- IPA ב- 0.4 מיקרומטר של מים מסוננים שעברו דה-יוניזציה. לאחר מכן החלף את מי ה- DI בתמיסת שטיפת ביצים לעובר. אספו כ-100 עוברים שנבחרו מראש מצלחת פטרי הזכוכית באמצעות פיפטה מזכוכית.
לאחר מכן, הכניסו את העוברים ליציאת כניסת העובר, והפעילו כשלושה לחצים שליליים של PSI על כניסת הגז באמצעות משאבת ואקום ניידת כדי לפתוח את המיקרו-ערוצים של העובר. לאחר מכן הטה את השבב המיקרופלואידי כלפי מטה כדי שהעוברים יתיישרו באופן אוטומטי ויתמקמו במיקרו-ערוצים של העוברים. אם כניסות המיקרו-ערוצים של העובר נסתמות על-ידי מספר עוברים הנכנסים בו-זמנית, הטה את השבב המיקרופלואידי כלפי מעלה, ולאחר מכן שוב כלפי מטה כדי לנקות את הסתימה.
בהתבסס על התפוקה הנדרשת, הכניסו עד 300 עוברים למיקרו-ערוצים של העוברים. לאחר השלמת טעינת העובר, הסר את הוואקום כדי לשתק את העוברים. לאחר מכן הטה את השבב המיקרו-נוזלי בחזרה למצב האופקי.
חבר מקור לחץ חיובי נייד עם מד לחץ לכניסת הגז כדי להפעיל שלוש דחיסת PSI. אם ייערכו ניסויי הדמיה חיים על העוברים המגורה מכנית, הניחו את השבב המיקרופלואידי על מחזיק שקופית זכוכית סטנדרטי בשלב מיקרוסקופ כאשר כניסת הגז מחוברת למקור הלחץ. בחנו את העוברים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בתוך התעלות המיקרופלואידיות.
לאחר השלמת ניסוי הדחיסה, ניתן לאסוף את העוברים לניתוח במורד הזרם. כדי לעשות זאת, ראשית, להחיל את הוואקום על כניסת הגז כדי לשחרר את העוברים. לאחר מכן הטה את השבב המיקרופלואידי כלפי מעלה כדי שהעוברים ינועו כלפי מטה לכיוון יציאת ההחדרה של העובר.
לאסוף את העוברים מן השבב microfluidic באמצעות פיפטה זכוכית. הפונקציונליות של המכשיר המיקרופלואידי נקבעה באופן ניסיוני על ידי טעינת עוברי דרוזופילה לתעלות הדחיסה והפעלת לחץ חיובי על תעלות הגז. העוברים אינם חווים דחיסה משמעותית תחת ואקום, או במצבי לחץ ניטרליים.
הם דחוסים כאשר מופעל לחץ חיובי. מדידות של רוחב העובר הפוחת תחת מיקרוסקופ מדגימות כיצד ניתן להשתמש בלחץ הגז כדי להשיג רמת דחיסת מטרה. התקנים מיקרופלואידיים המיוצרים בדרך זו מאפשרים גירוי כימי של דגימות משותקות.
הגירוי מאפשר הדמיה מרחבית גבוהה. שאלה בסיסית בביולוגיה התפתחותית היא כיצד כוחות מכניים מווסתים ביטוי חלבונים וגנים במהלך ההתפתחות? טכנולוגיה זו מאפשרת לנו ליישם גירוי מכני על מספר רב של עוברים בבת אחת, כך שנוכל לבודד כמויות מספיקות של חלבון ורנ"א כדי לבצע פרוטאומיקה השוואתית, או ניסויי תעתיק.
זה יאפשר לחוקרים ללמוד יותר על החלבונים והגנים הרגישים לכוחות מכניים.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
סקירה
פרוטוקול זה מסביר את התכנון והשימוש במערכת מיקרו-נוזלית להתיישר וקיבוע עוברים של Drosophila melanogaster. הוא מאפשר הדמיה ברזולוציה גבוהה ושחזור דגימות תוך צמצום טיפול ידני.
רכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מיקרו-נוזליקה
- מכאנוביולוגיה
- הדמיה של עוברים
רקע
- טכנולוגיות מיקרו-נוזליקה משפרות את תפוקת הדגימות ואת הטיפול האוטומטי.
- יישום מדויק של לחץ מכני חיוני למחקרים במכאנוביולוגיה.
- טכניקות מיקרו-ייצור קונבנציונליות יכולות להיות מאתגרות למאפיינים עם יחס גובה גבוה.
- פרוטוקול זה מספק טיפים להתגברות על אתגרים אלו.
מטרת המחקר
- לייצר מערכת מיקרו-נוזלית לקיבוע ויישור עוברים.
- לאפשר הדמיה חיה של אורגניזמים רב-תאיים.
- ליישם דחיסה מכנית לניתוח מכאנוביולוגי.
שיטות בשימוש
- ניקוי פרוסות סיליקון באצטון ואלכוהול איזופרופילי.
- ייצור תבניות עבור שבבים מיקרו-נוזליים.
- יישור וקיבוע עוברים.
- הדמיה ברזולוציה גבוהה במהלך יישום לחץ מכני.
תוצאות עיקריות
- יישור וקיבוע מוצלח של מאות עוברים.
- הוכח יכולת הדמיה ברזולוציה גבוהה.
- יישום יעיל של דחיסה מכנית לניתוח.
- אומתה יכולת ההתאמה למערכות ביולוגיות רב-תאיות אחרות.
מסקנות
- המערכת המיקרו-נוזלית מפחיתה באופן משמעותי את הטיפול הידני.
- היא משפרת את היכולת לחקור מכאנוביולוגיה בעוברים.
- גישה זו ניתנת להתאמה למגוון אורגניזמים רב-תאיים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-throughput microfluidic compression systems enable scalable mechanostimulation of multicellular organisms, addressing a critical bottleneck in mechanobiology and developmental biology research. This technology enhances predictive confidence in gene and protein expression studies by allowing precise, parallelized mechanical perturbation and quantitative analysis. Its integration supports robust target validation and de-risking at early discovery and preclinical inflection points in biopharma pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of mechanosensitive pathways in whole-organism models.
- Supports functional target validation by correlating mechanical stimuli with gene and protein expression changes.
- Facilitates predictive confidence in mechanistic hypotheses through high-throughput, quantitative outputs.
Screening & Assay Development
- Prepares validated, immobilized biological systems for downstream screening workflows.
- Standardizes mechanical stimulation protocols to ensure reproducibility and quantitative comparability.
- Enables scalable sample processing for omics-based assay development and compound evaluation.
Translational & Preclinical Research
- Aligns mechanostimulation outputs with disease-relevant gene and protein expression profiles.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling large-scale, parallel sample analysis.
- Provides mechanistic de-risking for translational biomarker identification in multicellular systems.
Pipeline & Workflow Integration
This microfluidic compression system fits from early discovery through preclinical research, enabling hypothesis testing, pathway clarification, and high-throughput sample preparation for omics analyses.
- Discovery Biology: Facilitates null hypothesis testing by enabling controlled mechanical perturbation and quantitative readouts.
- Screening: Delivers reproducible, scalable sample immobilization and stimulation for assay readiness.
- Analytics: Provides quantitative measurements of mechanical response, supporting comparative condition analysis.
- Translational Research: Bridges discovery and preclinical stages by supporting large-scale, mechanistically informed biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable, adaptable platform for diverse multicellular model systems and experimental designs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes and automates sample handling, improving reproducibility and throughput.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by supporting robust, quantitative mechanobiology data generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of mechanistically validated targets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfluidics fabrication and mechanobiology experimental design.
- Needs access to high-resolution imaging and pressure-controlled microfluidic instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data analysis workflows.
- Adaptable geometry allows use across various multicellular model systems.
- Sample throughput and device scalability are limited by fabrication and handling infrastructure.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:56
Preparation of the Silicon Wafer Mold
3:31
Fabrication of the Microfluidic Chip
4:39
Preparation of the Fruit Fly Embryos
5:47
Applying Mechanical Stimulation to Fruit Fly Embryos Using the Microfluidic Chip
8:19
Results: Experimental Measurement of Embryo Compression Level
8:58
Conclusion
