Name: ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 2 s
Description: חקור את מנגנון האוטופגיה בגוף השומן של זחלי Drosophila melanogaster באמצעות הדגימה בחלבוני GFP-Atg8a. השיטה מאפשרת ניתוח השפעת מוטציות על תהליכי האוטופגיה בתגובה למחסור בחומרי מזון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה ל-THFC ול-BDSC על אספקת זני הזבובים. ד"ר טונג צ'או נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32030027, 91754103, 92157201) וקרנות מחקר בסיסיות עבור האוניברסיטאות המרכזיות. אנו מודים למתקן הליבה של המכון למדעי החיים (LSI) על מתן השירותים.

1. מעבר דרוזופילה והטלת ביצים
<ol><li>הכניסו 3 זכרים (גנוטיפ hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a) ו-15 נקבות (גנוטיפ y' w* Mu FRT19A/ FM7, Kr GFP ) זבובים בוגרים (ראו טבלת חומרים) לבקבוקון תרבית ( עם קמח תירס /מולסה/אגר סטנדרטי ב-25°C) להזדווגות. הערה: יש להגדיר בקבוקוני תרבית מרובים של אותו צלב כדי להבטיח מספיק זחלים לניסויים נוספים. זן הזבוב הזכר עם גנוטיפ hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a נושא אתר FRT בכרומוזום X ליד הצנטרומר (FRT19A). זה גם מבטא FLP על הלם חום ב 37 ° C. טרנסגן עם ביטוי RFP בכל מקום מוכנס לכרומוזום X. GFP-Atg8a מתבטא תחת שליטה של cgGal4 בגוף שומן הזחל22. נקבת זן הזבוב עם גנוטיפ y' w* Mu FRT19A / FM7, Kr GFP נושאת מוטציה קטלנית (Mu) ו-FRT19A על כרומוזום X. תוכנית המעבר המפורטת מוצגת באיור 1.</li>
	<li>להטלת ביצים מעבירים את הזבובים לבקבוקון תרבית חדש. בשעה 48 לאחר ההקדמה, הקש על בקבוקון ההזדווגות עד שהזבובים יהיו המומים ויפיל על המדיה שבבסיס הבקבוקון.<ol><li>נתקו את בקבוקון ה"הזדווגות" וכסו את פיו בבקבוקון הפוך מנותק במדיה טרייה (בקבוקון תרבית טרי). לאחר מכן, העבירו את הזבובים לבקבוקון התרבית הטרי על ידי היפוך והקשה על הבקבוקונים.</li>
		<li>חברו את בקבוקון התרבית הטרי (עם הזבובים המועברים) והשליכו את בקבוקון התרבות הישן. הניחו את בקבוקון התרבית הטרי הזה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס להטלת ביצים על המצע הטרי. הערה: חימום מקדים של בקבוקוני התרבית הטריים ל-25 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות לפני תהליך העברת הזבובים יסייע לזבובים להסתגל לסביבה החדשה במהירות ויזרז את הטלת הביצים.</li>
	</ol></li>
	<li>הוציאו את הזבובים לאחר 6 שעות של הטלת ביצים. אם יש צורך לחזור על הניסויים, העבירו את הזבובים הללו לבקבוקון תרבית אחר (כמתואר בשלב 1.2). אחרת, השליכו את הזבובים על ידי השלכתם לבקבוק המכיל 75% אתנול).<ol><li>לדגור על הבקבוקון עם עוברים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת כדי לגרום לביטוי FLP. לאחר מכן, הניחו אותם באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס ואפשרו לעוברים להמשיך להתפתח. הערה: היווצרות מוצלחת של שיבוטים מוטנטיים יכולה להיות מאושרת לאחר מכן באמצעות הדמיה. היעדר אותות RFP מסמן את השיבוטים המוטנטים.</li>
	</ol></li>
</ol>2. רעב חומצות אמינו גורם לאוטופגיה
<ol><li>בעזרת מרית מעבדה, גרפו את המדיה המכילה את הזחלים המתפתחים לתוך צלחת פטרי 75 שעות לאחר הטלת הביצים. מוסיפים 3 מ"ל של 1x PBS לצלחת ומפרידים בעדינות את מצע התרבית ואת הזחלים באמצעות מלקחיים ארוכים. בחר 10 עד 15 זחלי כוכב שלישי מוקדם. הערה: יש לבחור בקפידה את זחלי הכוכב השלישי המוקדם. השלב ההתפתחותי של הזחלים הוא קריטי להצלחת פרוטוקול זה. בשל משך הטלת הביצים המוגבל, רוב הזחלים בבקבוקון התרבית צפויים להיות בשלב האינסטאר השלישי בתחילת 75 שעות הדגירה. עם זאת, מתכוני מדיה תרבותיים שונים עשויים להוביל לשינויים בתזמון ההתפתחותי של הזחלים. הקריטריונים להבחנה בין זחלי כוכב שלישי מוקדם הם אורך הגוף, נוכחות של ספירקלים קדמיים ואחוריים, כמו גם ווים mandibular של מנגנון הפה23.</li>
	<li>מלא את הבארות של צלחת ספוט שקע זכוכית 9 בארות (ראה טבלת חומרים) עם 1x PBS. מניחים את הזחלים המופרדים בבארות באמצעות מלקחיים ארוכים ושוטפים היטב את הזחלים כדי להסיר את כל שאריות המדיה.</li>
	<li>קח 5 מ"ל של תמיסת 20% סוכרוז (ב- PBS 1x) בבקבוקון ריק והנח את הזחלים הנקיים של הכוכב השלישי בתמיסה זו באמצעות מלקחיים ארוכים. לדגור בקבוקון זה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס במשך 6 שעות לפני הקציר אותם לנתיחה. הערה: תמיסת 20% סוכרוז (ב-1x PBS) משמשת כמדיום הרעבה חסר חומצות אמינו.</li>
</ol>3. דיסקציה שלישית של זחלי אינסטאר ועיבוד רקמות דגימה
<ol><li>לחדד שני זוגות של #5 מלקחיים (ראה טבלה של חומרים) באופן שווה משני הצדדים עם אבן השחזה.</li>
	<li>הוסף 400 μL של 1x PBS לכל באר של צלחת שקע זכוכית 9 בארות ולהעביר את הזחלים לתוך הבארות עם מלקחיים ארוכים. מניחים זחל אחד בבאר כאשר הצד הגבי (הצד עם קנה הנשימה) פונה כלפי מעלה.<ol><li>אחוז את הקוטיקולה של הזחל עם שני #5 מלקחיים באמצע גזע הזחל וקרע בעדינות את הקוטיקולות. גופי השומן החשופים, יחד עם רקמות פנימיות אחרות של הזחל, עדיין יהיו מחוברים לפגר הזחל. משוך מספיק כדי לחשוף את האיברים הפנימיים ככל האפשר. חזור על שלב זה עבור כל הזחלים. הערה: לכל זחל יש שתי חתיכות גדולות של גוף שומן לאורך גזע הגוף. רקמת גוף השומן היא חד-שכבה לבנה, אטומה ושטוחה שניתן להבחין בה בקלות תחת מיקרוסקופ דיסקציה24.</li>
	</ol></li>
	<li>מעבירים את פגר הזחל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה בנפח 1.5 מ"ל המכיל 500 μL של 4% פרפורמלדהיד (PFA). יש לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורה של 25°C מבלי לנער את הצינורות. אזהרה: 4% PFA רעיל. יש ללבוש כפפות ומסכות להגנה. הערה: מומלץ להכין 4% PFA במאגר PBS אחד. אבקת PFA אינה מתמוססת ב-PBS אחד באופן מיידי. לפיכך, התערובת חייבת להיות מודגרת ב 65 ° C באינקובטור לילה או מזועזע לסירוגין במשך 45 דקות ב 25 °C (75 °F).</li>
	<li>לאחר דגירה של 30 דקות של הפגר עם 4% PFA, פיפטה החוצה את תמיסת PFA, להוסיף 500 μL של 1x PBS לתוך הצינור, ולנער בעדינות את הצינור על מסובב שטוח במשך 10 דקות לפני השלכת תמיסת PBS 1x (חזור על 3x).</li>
	<li>בעזרת מלקחיים ארוכים, מעבירים את פגר הזחל הקבוע והשטוף לבאר בצלחת ספוט 9 שקעים מלאה ב- PBS 1x. באמצעות #5 מלקחיים, להסיר את כל רקמות הגוף ללא שומן.</li>
	<li>השתמש במלקחיים #5 כדי להרכיב את חתיכות גוף השומן על מגלשת מיקרוסקופ באמצעות 80% גליצרול כאמצעי הרכבה ולהניח כיסוי על גבי. הערה: לפני ההרכבה, בדוק את ה- pH של 80% גליצרול (באמצעות ניירות pH, pH = 7 הוא אופטימלי) כדי להגן על אות GFP. אמצעי הרכבה (ראה טבלת חומרים) עם DAPI בגליצרול 80% יסייעו בהדמיה של גרעיני תאי גוף שומן. שקופיות אלה יציבות במשך שבוע אחד כאשר מאוחסן בחושך ב 4 °C (75 °F).</li>
</ol>

<ol><li>Yorimitsu, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy%3A+Molecular+machinery+for+self-eating%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+%26+Differentiation%22%5BJournal%5D)">Autophagy: Molecular machinery for self-eating.</a> Cell Death & Differentiation. 12 (2), 1542-1552 (2005).</li>
<li>Jin, S., White, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+autophagy+in+cancer%3A+Management+of+metabolic+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Role of autophagy in cancer: Management of metabolic stress.</a> Autophagy. 3 (1), 28-31 (2007).</li>
<li>Mizushima, N., Levine, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+in+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22New+England+Journal+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Autophagy in human diseases.</a> New England Journal of Medicine. 383 (16), 1564-1576 (2020).</li>
<li>Mizushima, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+fights+disease+through+cellular+self-digestion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Autophagy fights disease through cellular self-digestion.</a> Nature. 451 (7182), 1069-1075 (2008).</li>
<li>Yang, Z., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eaten+alive%3A+A+history+of+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Eaten alive: A history of macroautophagy.</a> Nature Cell Biology. 12 (9), 814-822 (2010).</li>
<li>Lamb, C. A., Yoshimori, T., Tooze, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+autophagosome%3A+Origins+unknown%2C+biogenesis+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The autophagosome: Origins unknown, biogenesis complex.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 14 (12), 759-774 (2013).</li>
<li>Klionsky, D. J., Eskelinen, E. L., Deretic, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagosomes%2C+phagosomes%2C+autolysosomes%2C+phagolysosomes%2C+autophagolysosomes...Wait%2CI%27mconfused%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Autophagosomes, phagosomes, autolysosomes, phagolysosomes, autophagolysosomes...Wait,I'mconfused.</a> Autophagy. 10 (4), 549-551 (2014).</li>
<li>Zhang, S., Hama, Y., Mizushima, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolution+of+autophagy+proteins-Diversification+in+eukaryotes+and+potential+ancestors+in+prokaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">The evolution of autophagy proteins-Diversification in eukaryotes and potential ancestors in prokaryotes.</a> Journal of Cell Science. 134 (13), (2021).</li>
<li>Scott, R. C., Schuldiner, O., Neufeld, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+and+regulation+of+starvation-induced+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Role and regulation of starvation-induced autophagy in the Drosophila fat body.</a> Developmental Cell. 7 (2), 167-178 (2004).</li>
<li>Liu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+protein+import+regulates+cytosolic+protein+homeostasis+and+neuronal+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial protein import regulates cytosolic protein homeostasis and neuronal integrity.</a> Autophagy. 14 (8), 1293-1309 (2018).</li>
<li>Ichimura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ubiquitin-like+system+mediates+protein+lipidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A ubiquitin-like system mediates protein lipidation.</a> Nature. 408 (6811), 488-492 (2000).</li>
<li>Rusten, T. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Programmed+autophagy+in+the+Drosophila+fat+body+is+induced+by+ecdysone+through+regulation+of+the+PI3K+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">Programmed autophagy in the Drosophila fat body is induced by ecdysone through regulation of the PI3K pathway.</a> Developmental Cell. 7 (2), 179-192 (2004).</li>
<li>Nishida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+Atg5%2FAtg7-independent+alternative+macroautophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Discovery of Atg5/Atg7-independent alternative macroautophagy.</a> Nature. 461 (7264), 654-658 (2009).</li>
<li>Ravikumar, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mammalian+autophagy+in+physiology+and+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">Regulation of mammalian autophagy in physiology and pathophysiology.</a> Physiological Reviews. 90 (4), 1383-1435 (2010).</li>
<li>Xie, Z., Nair, U., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atg8+controls+phagophore+expansion+during+autophagosome+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Atg8 controls phagophore expansion during autophagosome formation.</a> Molecular Biology of the Cell. 19 (8), 3290-3298 (2008).</li>
<li>Shintani, T., Klionsky, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cargo+proteins+facilitate+the+formation+of+transport+vesicles+in+the+cytoplasm+to+vacuole+targeting+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Cargo proteins facilitate the formation of transport vesicles in the cytoplasm to vacuole targeting pathway.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (29), 29889-29894 (2004).</li>
<li>Russell, R. C., Yuan, H. X., Guan, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+regulation+by+nutrient+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Autophagy regulation by nutrient signaling.</a> Cell Research. 24 (1), 42-57 (2014).</li>
<li>Nagy, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+and+why+to+study+autophagy+in+Drosophila%3A+It%27s+more+than+just+a+garbage+chute%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">How and why to study autophagy in Drosophila: It's more than just a garbage chute.</a> Methods. 75, 151-161 (2015).</li>
<li>Golic, K. G., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+FLP+recombinase+of+yeast+catalyzes+site-specific+recombination+in+the+Drosophila+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The FLP recombinase of yeast catalyzes site-specific recombination in the Drosophila genome.</a> Cell. 59 (3), 499-509 (1989).</li>
<li>Senecoff, J. F., Cox, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directionality+in+FLP+protein-promoted+site-specific+recombination+is+mediated+by+DNA-DNA+pairing%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Directionality in FLP protein-promoted site-specific recombination is mediated by DNA-DNA pairing.</a> Journal of Biological Chemistry. 261 (16), 7380-7386 (1986).</li>
<li>Germani, F., Bergantinos, C., Johnston, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mosaic+analysis+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mosaic analysis in Drosophila.</a> Genetics. 208 (2), 473-490 (2018).</li>
<li>Zappia, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F%2FDp+inactivation+in+fat+body+cells+triggers+systemic+metabolic+changes%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">E2F/Dp inactivation in fat body cells triggers systemic metabolic changes.</a> eLife. 10, 67753(2021).</li>
<li>Demerec, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDemerec%2C+M+%22Biology+of+Drosophila%22">Biology of Drosophila</a>. , Hafner Pub. Co. New York, NJ. (1965).</li>
<li>Rizki, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+larval+fat+body+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Wilhelm+Roux%27s+Archives+of+Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila larval fat body surfaces.</a> Wilhelm Roux's Archives of Developmental Biology. 192 (1), 1-7 (1983).</li>
<li>Szeto, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ALIS+are+stress-induced+protein+storage+compartments+for+substrates+of+the+proteasome+and+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Autophagy%22%5BJournal%5D)">ALIS are stress-induced protein storage compartments for substrates of the proteasome and autophagy.</a> Autophagy. 2 (3), 189-199 (2006).</li>
<li>Renna, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+inducers+of+autophagy+that+enhance+the+clearance+of+mutant+proteins+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Chemical inducers of autophagy that enhance the clearance of mutant proteins in neurodegenerative diseases.</a> Journal of Biological Chemistry. 285 (15), 11061-11067 (2010).</li>
<li>Guo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large-scale+RNA+interference+screen+identifies+genes+that+regulate+autophagy+at+different+stages%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A large-scale RNA interference screen identifies genes that regulate autophagy at different stages.</a> Scientific Reports. 8, 1-15 (2018).</li>
<li>Tian, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+antibody+for+analysis+of+autophagy+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">An antibody for analysis of autophagy induction.</a> Nature Methods. 17 (2), 232-239 (2020).</li>
<li>Nezis, I. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+autophagy+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Selective autophagy in Drosophila.</a> International Journal of Cell Biology. 2012, 146767(2012).</li>
<li>Chu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+materials+for+monitoring+mitochondrial+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Materials%22%5BJournal%5D)">Fluorescent materials for monitoring mitochondrial biology.</a> Materials. 14 (15), 4180(2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השיטות (1) ליצור זבובים הנושאים שיבוטים מוטנטיים בגופי שומן הזחל, (2) לגרום לאוטופגיה באמצעות רעב חומצות אמינו, ו-(3) לנתח את גופי השומן של הזחל. על מנת לייצר שיבוטים בהצלחה בגופי שומן הזחל, יש לבצע את השלבים הקריטיים הבאים בחריצות. (1) תזמון מדויק של שוק החום הוא קריטי מכיוון שרקומבינציה מיטוטית מתרחשת רק כאשר הרקמה עוברת מיטוזה, ו-(2) גם טמפרטורת הלם החום וגם משך הזמן קריטיים לגרימת ביטוי FLP. מומלץ אמבט מים סטנדרטי של 37 מעלות צלזיוס להלם חום של שעה אחת. בהתחשב באפשרות המוגברת למוות עוברי/זחל ...

אוטופגיה היא תהליך "אכילה עצמית" המושרה על ידי לחצים שונים, כולל רעב חומצות אמינו1. מקרואוטופגיה (להלן אוטופגיה) היא הסוג הנחקר ביותר של אוטופגיה וממלאת תפקיד שאין לו תחליף בשמירה על הומאוסטזיס תאי2. תקלה של אוטופגיה קשורה למספר מחלות אנושיות3. בנוסף, חלק מהגנים הקשורים לאוטופגיה הם מטרות פוטנציאליות לטיפול במחלות שונות4. 
אוטופגיה מוסדרת בצורה מתוחכמת ביותר5. בעת הרעב, קרומי הבידוד מבודדים חומרים ציטופלזמיים ליצירת אוטופגוזומים בעלי קרום כפול6. לאחר מכן אוטופגוזומים מתמזגים עם אנדוזומים וליזוזומים ליצירת אמפיזומים ואוטוליזוזומים. בעזרת אנזימים הידרוליטיים ליזוזומליים, התוכן הציטופלזמי שנבלע מתפרק, והחומרים המזינים ממוחזרים7. 
אוטופגיה היא תהליך שימור אבולוציוני8. Drosophila melanogaster הוא מודל נהדר לחקר תהליך autophagy in vivo. רעב חומצות אמינו גורם בקלות לאוטופגיה ברקמת גוף שומן הזבובים, אנלוגיה של כבד אנושי ורקמת שומן9. פגמים באוטופגיה משבשים את דפוסי הפונקטה המובהקים של מספר חלבונים הקשורים לאוטופגיה, כגון Atg8, Atg9, Atg18, Syx17, Rab7, LAMP1 ו-p62, בין היתר10. לכן, ניתוח הדפוסים של סמני אוטופגיה אלה יסייע להבחין בהתרחשות של פגמים אוטופגיים ואת שלב אוטופגיה פגום. לדוגמה, החלבון דמוי האוביקוויטין Atg8 הוא סמן האוטופגיההנפוץ ביותר 11. ב- Drosophila melanogaster, זנים טרנסגניים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) המתויג Atg8a פותחו בהצלחה12. GFP-Atg8a מפוזר בציטוזול ובגרעינים בתאים המוזנים. לאחר הרעבה, GFP-Atg8a מעובד ושונה על ידי פוספטידיל-אתנולאמין (PE) ויוצר פונקטה, אשר מסמנת את קרומי הבידוד ואת האוטופגוזומים המפותחים במלואם13,14. באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ישיר, ניתן לראות בקלות את השראת האוטופגיה כעלייה בהיווצרות GFP-Atg8 puncta15. Atg8a puncta לא ייווצר בתגובה לרעב בנוכחות פגם בהתחלת אוטופגיה. מכיוון ש-GFP-Atg8a יכול להיות מרווה-מעוכל על ידי ה-pH הנמוך באוטוליזוזומים, GFP-Atg8a puncta עשוי לעלות במספרים אם אוטופגיה נחסמת בשלבים מאוחרים16.
מכיוון שאוטופגיה רגישה מאוד לזמינות תזונתית17, הבדלים קלים בתנאי התרבית מובילים לעתים קרובות לשינויים בפנוטיפים. לכן, לאנליזה של שבטים, שיטה המנתחת תאים מוטנטיים לעומת תאי ביקורת מסוג בר באותה רקמה, יש יתרון גדול בניתוח פגמים אוטופגיים18. תוך ניצול של רקומבינציה ספציפית לאתר בתיווך FLPASE/FLPASE (FLP/FRT) בין כרומוזומים הומולוגיים, זבובים הנושאים רקמות פסיפס מיוצרים בקלות19,20. התאים מסוג פרא המקיפים את התאים המוטנטיים יוצרים בקרה פנימית מושלמת כדי למנוע הבדלים אינדיבידואליים21.
המחקר הנוכחי מתאר כיצד לגרום לאוטופגיה על ידי רעב חומצות אמינו וליצור רקמות גוף של שומן פסיפס המבטא GFP-Atg8a. פרוטוקולים אלה יכולים לשמש לניתוח הבדלים באוטופגיה בין שיבוטים מוטנטיים.

<table><tbody><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>#5 מלקחיים</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td></td></tr><tr><td>9 חבישות צלחת ספוט</td><td>PYREX</td><td>7220-85</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Nikon</td><td>SMZ1500</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A100854-0100</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A610440-0500</td><td>הרכב של תמיסת PBS 1x</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A600445-0500</td><td>הרכב של תמיסת PBS 1x</td></tr><tr><td>מרית מעבדה</td><td>פישר</td><td>14-375-10</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים ארוכים</td><td>R' DEER RST-14</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מיקרוסקופ זכוכית</td><td>CITOTEST</td><td>80340-1130</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>CITOTEST</td><td>80302-2104</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sangon Biotech</td><td>A501727-0500</td><td>הרכב של תמיסת PBS 1x</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sangon Biotech</td><td>A610476-0005</td><td>הרכב של תמיסת PBS 1x</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>קורנינג</td><td>430166</td><td></td></tr><tr><td>קמח תירס סטנדרטי / מולסה / מזון</td><td></td><td></td> זבוב אגר <td>טונג מעבדה תוצרת</td></tr><tr><td>מעבדה סטריאו מיקרוסקופ</td><td>ניקון</td><td>SMZ745</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סינופארם מגיב כימי ושות', בע"מ</td><td></td><td></td>10021418</tr><tr><td>מדיום הרכבה נגד דהייה של Vectashield עם DAPI</td><td>Vectorlabratory</td><td>H-1200-10</td><td>הרכבה מומלצת בינונית</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזקה>מניות זבוב</חזקות></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>y'w* Iso FRT19A</td><td></td><td></td><td>Tong Lab's fly stocks</td></tr><tr><td>y'w* Mu1FRT19A/FM7, Kr GFP</td><td></td><td></td><td>מלאי הזבובים של מעבדת טונג</td></tr><tr><td>y'w* Mu2 FRT19A/FM7,Kr GFP</td><td></td><td></td><td>מלאי הזבובים של מעבדת טונג</td></tr><tr><td>hsFLP ubiRFP FRT19A; cgGal4 UAS-GFP-Atg8a</td><td></td><td></td><td>מלאי הזבובים של מעבדת טונג</td></tr></tbody></table>

ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל drosophila melanogaster

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

אוטופגיה היא תהליך של עיכול עצמי תאי. הוא מעביר מטען לליזוזומים לפירוק בתגובה ללחצים שונים, כולל רעב. תקלה של אוטופגיה קשורה להזדקנות ומחלות אנושיות מרובות. מנגנון האוטופגיה שמור מאוד - משמרים ועד בני אדם. גוף שומן הזחל של Drosophila melanogaster, אנלוגי לכבד חולייתנים ולרקמת שומן, מספק מודל ייחודי לניטור אוטופגיה in vivo. אוטופגיה יכולה להיגרם בקלות על ידי רעב תזונתי בגוף שומן הזחל. רוב הגנים הקשורים לאוטופגיה נשמרים בדרוזופילה. פותחו זנים רבים של זבובים טרנסגניים המבטאים סמני אוטופגיה מתויגים, המאפשרים ניטור של שלבים שונים בתהליך האוטופגיה. ניתוח השבטים מאפשר השוואה קרובה של סמני אוטופגיה בתאים בעלי גנוטיפים שונים באותה פיסת רקמה. הפרוטוקול הנוכחי מפרט נהלים עבור (1) יצירת שיבוטים סומטיים בגוף שומן הזחל, (2) גרימת אוטופגיה באמצעות רעב חומצות אמינו, ו-(3) ניתוח גוף שומן הזחל, במטרה ליצור מודל לניתוח הבדלים באוטופגיה באמצעות סמן אוטופגוזום (GFP-Atg8a) וניתוח שבטים.

בתנאים מוזנים, החלבון דמוי האוביקוויטין המתויג GFP, GFP-Atg8a, מפוזר בתוך התאים. עם רעב, הוא יוצר פונקטה ירוקה ומתייג אוטופגוזומים. ברגע שאוטופגוזומים מתמזגים עם ליזוזומים, GFP מרוה באוטוליזוזומים החומציים, והפונקטה הירוקה נעלמת. אם אוטופגיה אינה מושרית או שההבשלה האוטופגוזומית מואצת, מספר ה-GFP puncta צפוי להיות נמוך. עם זאת, אם האיחוי בין אוטופגוזומים וליזוזומים נחסם או שה- pH של האוטוליזוזום הופך לבסיסי, המספר ו / או הגודל של GFP puncta צפוי להיות גבוה.
בפרוטוקול המוצג כאן, מערכת FLP/FRT מש...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את השראת האוטופגיה בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster באמצעות דלדול חומרי מזון ומנתח שינויים באוטופגיה באמצעות זני זבובים טרנסגניים.

ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגרום לאוטופגיה בגוף השומן של זחל Drosophila melanogaster באמצעות דלדול חומצות אמינו וכיצד לנתח את ההבדלים באוטופגיה בין שיבוטים מוטנטיים. מכיוון שאוטופגיה רגישה מאוד לזמינות תזונתית בתנאי תרבית, לאנליזה של שבטים, שיטה המנתחת תאים מוטנטיים לעומת תאים מסוג בר באותה רקמה, יש יתרון בניתוח פגמים באוטופגיה. התחילו בהחדרת שלושה זכרים ו-15 נקבות זבובים בוגרים לבקבוקון תרבית עם קמח תירס סטנדרטי או מולסה או אגר דרוזופילה מדיה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס להזדווגות.48 שעות לאחר הזירוז, הקש על בקבוקון ההזדווגות עד שהזבובים יהיו המומים וצנח על המדיה שבבסיס הבקבוקון. נתקו את בקבוקון ההזדווגות וכסו את פיו בבקבוקון תרבית הפוך מנותק במדיה טרייה. לאחר מכן הפכו והקישו על הבקבוקונים כדי להעביר את הזבובים לבקבוקון התרבית הטרי.חברו את בקבוקון התרבית הטרי והשליכו את הבקבוקון הישן. מניחים את בקבוקון התרבית הטרייה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס להטלת ביצים על המצע הטרי. הוציאו את הזבובים לאחר שש שעות של הטלת ביצים והשליכו את הזבובים על ידי השלכתם לבקבוק המכיל 75% אתנול.לדגור על הבקבוקון עם עוברים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לגרום לביטוי פליפאז. לאחר מכן, הניחו אותם באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס ואפשרו לעוברים להמשיך להתפתח. בעזרת מרית מעבדה, גרפו את המדיה המכילה את הזחלים המתפתחים לתוך צלחת פטרי 75 שעות לאחר הטלת הביצים.הוסיפו 1X PBS לתבשיל והפרידו בעדינות את מצע התרבית ואת הזחלים באמצעות מלקחיים ארוכים. לאחר מכן בחר 10 עד 15 זחלי כוכב שלישי מוקדם. מלאו את הבארות של צלחת ספוט שקע זכוכית בעלת תשע בארות עם PBS 1X והניחו את הזחלים המופרדים של הכוכב השלישי בבארות באמצעות מלקחיים ארוכים.לשטוף את הזחלים ביסודיות כדי להסיר את כל שאריות התקשורת. קח חמישה מיליליטר של תמיסת 20% סוכרוז בבקבוקון ריק ושים את הזחלים הנקיים של כוכב שלישי בתמיסה זו באמצעות מלקחיים ארוכים. דגרו על בקבוקון זה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס במשך שש שעות לפני הקציר לנתיחה.הוסף 1X PBS לכל באר של צלחת שקע זכוכית תשע בארות ולהעביר את הזחלים לתוך הבארות עם מלקחיים ארוכים. מניחים זחל אחד בבאר כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. אחזו בקוטיקולה של הזחל עם שתי מלקחיים 5 במרכז גזע הזחל וקרעו בעדינות את הקוטיקולות.גופי השומן החשופים, יחד עם רקמות פנימיות אחרות של הזחל, עדיין יהיו מחוברים לפגר הזחל. משוך מספיק כדי לחשוף את האיברים הפנימיים ככל האפשר. חזור על שלב זה עבור כל הזחלים.מעבירים את פגר הזחל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכיל 500 מיקרוליטר של 4% PFA ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס מבלי לטלטל את הצינורות. לאחר 30 דקות, פיפטה החוצה את פתרון PFA. הוסף 500 מיקרוליטר של 1X PBS לתוך הצינור.נערו בעדינות את הצינור על מסובב שטוח למשך 10 דקות ולאחר מכן השליכו את תמיסת 1X PBS. חזור על פעולה זו שלוש פעמים. בעזרת מלקחיים ארוכים, מעבירים את פגר הזחל הקבוע והשטוף לבאר בצלחת תשעת שקעי הדיכאון המלאה ב-1X PBS.הסר את כל רקמות הגוף ללא שומן עם 5 מלקחיים. לבסוף, הרכיבו את חלקי גוף השומן על מגלשת מיקרוסקופ באמצעות 80% גליצרול כאמצעי הרכבה והניחו כיסוי על גבי. מוטנט אחד ומוטנט שני הם שני מוטנטים קטלניים עצמאיים על כרומוזום X וזבובי FRT 19A צהובים לבנים איזוגניים משמשים כאן כבקרה.תבניות GFP-Atg8a נותחו בקבוצת הביקורת, מוטנטית אחת או מוטנטית בשני גופי שומן של זחלי פסיפס, ושיבוטים מוטנטיים או שיבוטים של קבוצת ביקורת סומנו באופן שלילי על ידי RFP. בשיבוטים של הביקורת, הדפוסים של GFP-Atg8a Puncta היו דומים לאלה שבתאים החיוביים של RFP שמסביב. בשיבוטים מוטנטיים אחד, ה-GFP-Atg8a Puncta הופחתו במידה ניכרת.ובשני שיבוטים מוטנטיים, המספרים והגודל של GFP-Atg8a Puncta גדלו. השלב ההתפתחותי של הזחלים הוא קריטי כאן. יש לשנות את זמן ההתפתחות ואת משך הרעב בהתאם למתכוני התרבית של כל מעבדה.הליך זה יכול להיות מיושם כדי לחקור אוטופגיה סלקטיבית. לדוגמה, ניתן לנטר מיטופגיה בגופי שומן זבובים על ידי הצמדת חלבון פלואורסצנטי לרצף מיקוד מיטוכונדריאלי.

analyzing-starvation-induced-autophagy-drosophila-melanogaster-larval

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הגורם המגביל בשימוש של...

אחד תסיסנית אומטידיום Dissection והדמיה

אנו מציגים שיטות ביוכימיות ומיקרוסקופיות חזקות...

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

מעגל ההאכלה בזחלי melanogaster דרוזופילה משמש מודל פשוט אך רב עוצמה המאפשר שינויים בשער האכלה להיות מתואמים עם שינויים במעגלים העצביים stomatogastric. מעגל זה מורכב מתאי עצב סרוטונין המרכזיים ששולחים תחזיות לפי הווים כמו גם המעי הקדמי.

ניתוח פונקציונלי של מעגל האכלת הזחל ב דרוזופילה</i

כאן אנו מציגים שיטה למדידת רמות שומן האורגניזם ב instar השלישי (L3) בשלב הזחל של תסיסנית. שיטה זו מנצלת את הצפיפות נמוכה יחסית של רקמת שומן להבדיל בין זחלים עם ממאגרי שומן שונים. ניתוח מבוסס ציפה הוא כלי רב ערך עבור לסינון מהיר, לשחזור, וחסכוני.

שיטה מבוססת חוק ארכימדס של קביעת רמות שומן<em&gt; תסיסנית</em

זוהי דיאטה שומן גבוהה האכלה פרוטוקול לזירוז ההשמנה דרוזופילה, דוגמנית על הבנת המנגנונים המולקולריים יסודי מעורב lipotoxicity. הוא גם מספק assay triacylglyceride של תפוקה גבוהה למדידת הצטברות שומן דרוזופילה ואת פוטנציאל אחרים מודלים (חרק) בתנאים תזונתיים, סביבתיים, גנטי או פיזיולוגיים שונים.

בשומן האכלה ואת וזמינותו Triacylglyceride תפוקה גבוהה בדרוזופילה Melanogaster

אנו מציגים פרוטוקול למדידת צריכת החמצן ואת acidification חוץ-תאית במוח זחל ומבוגרים melanogaster דרוזופילה . מנתח חילוף החומרים מנוצל עם פרוטוקול מותאם וממוטב. מיקרו-רקמת ריסון הינם המכריעים של פרוטוקול זה, היו עיצבת ויצרת במיוחד לשימוש שלהם ניתוח זה.

ניתוח מטבולית של melanogaster דרוזופילה Larval ושכל למבוגרים

פיתחנו זרימת עבודה פשוטה וישימה לחלץ נתונים כמותיים במחקרים ביולוגיים תא המבוססות על ידי קרינה פלואורסצנטית-הדמיה של צבירת חלבון, שטף autophagic במערכת העצבים המרכזית דגמי דרוזופילה הקשורים ניוון מוחיים.

ביולוגיה של התא כמותית של הקשורים ניוון מוחיים ב דרוזופילה דרך ניתוח לא משוחדת של חלבונים מתויגות Fluorescently באמצעות ImageJ

פרוטוקול זה מתאר וזמינותו של phagocytosis ויוו ב מבוגרים דרוזופילה melanogaster לכמת פגוציט הכרה ואישור של זיהומים חיידקים.

הערכת התגובה החיסונית הסלולר של זבוב הפירות, דרוזופילה melanogaster, שימוש ב Vivo Phagocytosis Assay

להלן פרוטוקול המאפשר כימות צבעוני של כמות המזון הנאכל בתוך פרק זמן מוגדר על ידי זחלי מלנוגאסטר דרוזופילה שנחשפו לדיאטות באיכות מקרונוטריאנטית שונה. מבחנים אלה מתבצעים בהקשר של מסך תרמוגנטי עצבי.

כימות צריכת מקרונוטריאנטים במסך עצבי תרמוגנטי באמצעות זחלי דרוזופילה

מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה (SRS) מאפשרת הדמיה סלקטיבית ונטולת תווית של moieties כימיים ספציפיים והיא שימשה ביעילות כדי לדמות מולקולות השומנים ב vivo. כאן, אנו מספקים היכרות קצרה עם העיקרון של מיקרוסקופיה SRS ומתארים שיטות לשימוש בו באחסון השומנים הדמיה ב Caenorhabditis elegans.

הדמיה ללא תווית של דינמיקת אחסון השומנים באלגנים של Caenorhabditis באמצעות מיקרוסקופיית פיזור ראמאן מגורה

פרוטוקול זה מתאר בדיקה התנהגותית לרישום התנהגות חיפוש המעוררת סוכר באמצעות Drosophila melanogaster. הבדיקה יכולה לשמש לחקר התנהגויות הקשורות להאכלה וליקוט מזון, כמו גם את המנגנונים העצביים הבסיסיים.

מעקב אחר התנהגות חיפוש מקומי בדרוזופילה

חקור את מנגנון האוטופגיה בגוף השומן של זחלי Drosophila melanogaster באמצעות הדגימה בחלבוני GFP-Atg8a. השיטה מאפשרת ניתוח השפעת מוטציות על תהליכי האוטופגיה בתגובה למחסור בחומרי מזון.

ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster

גלה סרטונים נוספים