ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגרום לאוטופגיה בגוף השומן של זחל Drosophila melanogaster באמצעות דלדול חומצות אמינו וכיצד לנתח את ההבדלים באוטופגיה בין שיבוטים מוטנטיים. מכיוון שאוטופגיה רגישה מאוד לזמינות תזונתית בתנאי תרבית, לאנליזה של שבטים, שיטה המנתחת תאים מוטנטיים לעומת תאים מסוג בר באותה רקמה, יש יתרון בניתוח פגמים באוטופגיה. התחילו בהחדרת שלושה זכרים ו-15 נקבות זבובים בוגרים לבקבוקון תרבית עם קמח תירס סטנדרטי או מולסה או אגר דרוזופילה מדיה בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס להזדווגות.

48 שעות לאחר הזירוז, הקש על בקבוקון ההזדווגות עד שהזבובים יהיו המומים וצנח על המדיה שבבסיס הבקבוקון. נתקו את בקבוקון ההזדווגות וכסו את פיו בבקבוקון תרבית הפוך מנותק במדיה טרייה. לאחר מכן הפכו והקישו על הבקבוקונים כדי להעביר את הזבובים לבקבוקון התרבית הטרי.

חברו את בקבוקון התרבית הטרי והשליכו את הבקבוקון הישן. מניחים את בקבוקון התרבית הטרייה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס להטלת ביצים על המצע הטרי. הוציאו את הזבובים לאחר שש שעות של הטלת ביצים והשליכו את הזבובים על ידי השלכתם לבקבוק המכיל 75% אתנול.

לדגור על הבקבוקון עם עוברים באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך שעה כדי לגרום לביטוי פליפאז. לאחר מכן, הניחו אותם באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס ואפשרו לעוברים להמשיך להתפתח. בעזרת מרית מעבדה, גרפו את המדיה המכילה את הזחלים המתפתחים לתוך צלחת פטרי 75 שעות לאחר הטלת הביצים.

הוסיפו 1X PBS לתבשיל והפרידו בעדינות את מצע התרבית ואת הזחלים באמצעות מלקחיים ארוכים. לאחר מכן בחר 10 עד 15 זחלי כוכב שלישי מוקדם. מלאו את הבארות של צלחת ספוט שקע זכוכית בעלת תשע בארות עם PBS 1X והניחו את הזחלים המופרדים של הכוכב השלישי בבארות באמצעות מלקחיים ארוכים.

לשטוף את הזחלים ביסודיות כדי להסיר את כל שאריות התקשורת. קח חמישה מיליליטר של תמיסת 20% סוכרוז בבקבוקון ריק ושים את הזחלים הנקיים של כוכב שלישי בתמיסה זו באמצעות מלקחיים ארוכים. דגרו על בקבוקון זה באינקובטור של 25 מעלות צלזיוס במשך שש שעות לפני הקציר לנתיחה.

הוסף 1X PBS לכל באר של צלחת שקע זכוכית תשע בארות ולהעביר את הזחלים לתוך הבארות עם מלקחיים ארוכים. מניחים זחל אחד בבאר כאשר הצד הגבי פונה כלפי מעלה. אחזו בקוטיקולה של הזחל עם שתי מלקחיים 5 במרכז גזע הזחל וקרעו בעדינות את הקוטיקולות.

גופי השומן החשופים, יחד עם רקמות פנימיות אחרות של הזחל, עדיין יהיו מחוברים לפגר הזחל. משוך מספיק כדי לחשוף את האיברים הפנימיים ככל האפשר. חזור על שלב זה עבור כל הזחלים.

מעבירים את פגר הזחל לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר המכיל 500 מיקרוליטר של 4% PFA ודגרים במשך 30 דקות בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס מבלי לטלטל את הצינורות. לאחר 30 דקות, פיפטה החוצה את פתרון PFA. הוסף 500 מיקרוליטר של 1X PBS לתוך הצינור.

נערו בעדינות את הצינור על מסובב שטוח למשך 10 דקות ולאחר מכן השליכו את תמיסת 1X PBS. חזור על פעולה זו שלוש פעמים. בעזרת מלקחיים ארוכים, מעבירים את פגר הזחל הקבוע והשטוף לבאר בצלחת תשעת שקעי הדיכאון המלאה ב-1X PBS.

הסר את כל רקמות הגוף ללא שומן עם 5 מלקחיים. לבסוף, הרכיבו את חלקי גוף השומן על מגלשת מיקרוסקופ באמצעות 80% גליצרול כאמצעי הרכבה והניחו כיסוי על גבי. מוטנט אחד ומוטנט שני הם שני מוטנטים קטלניים עצמאיים על כרומוזום X וזבובי FRT 19A צהובים לבנים איזוגניים משמשים כאן כבקרה.

תבניות GFP-Atg8a נותחו בקבוצת הביקורת, מוטנטית אחת או מוטנטית בשני גופי שומן של זחלי פסיפס, ושיבוטים מוטנטיים או שיבוטים של קבוצת ביקורת סומנו באופן שלילי על ידי RFP. בשיבוטים של הביקורת, הדפוסים של GFP-Atg8a Puncta היו דומים לאלה שבתאים החיוביים של RFP שמסביב. בשיבוטים מוטנטיים אחד, ה-GFP-Atg8a Puncta הופחתו במידה ניכרת.

ובשני שיבוטים מוטנטיים, המספרים והגודל של GFP-Atg8a Puncta גדלו. השלב ההתפתחותי של הזחלים הוא קריטי כאן. יש לשנות את זמן ההתפתחות ואת משך הרעב בהתאם למתכוני התרבית של כל מעבדה.

הליך זה יכול להיות מיושם כדי לחקור אוטופגיה סלקטיבית. לדוגמה, ניתן לנטר מיטופגיה בגופי שומן זבובים על ידי הצמדת חלבון פלואורסצנטי לרצף מיקוד מיטוכונדריאלי.