Name: יצירה, הגבלה והתבוננות בנמטיקה פעילה מבוססת מיקרוטובולים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: חקור את הכנת נמטיקה פעילה מבוססת מיקרוטובולים וקינזין לחקר דינמיקה לא ליניארית ונוזלי גבישיים. השיטה מאפשרת הגבלה במיקרוגיאומטריה ותצפית בפגמים טופולוגיים ניידים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

המחברים רוצים להודות לפרס הקרן הלאומית למדע (NSF) DMR-1808926 על מימון נדיב. הפרויקט נתמך גם על ידי ה- NSF באמצעות המרכז למצוינות מחקרית במדע וטכנולוגיה: המרכז למכונות תאיות וביומולקולריות באוניברסיטת קליפורניה מרסד (HRD-1547848) ומרכז ברנדייס למדע והנדסה של חומרים במתקנים ביו-חומרים (DMR-2011486). ברצוננו להודות לד"ר בין ליו מאוניברסיטת קליפורניה מרסד על הסיוע בהדפסת התבנית בתלת-ממד, ולד"ר ג'ורדי איגנס על הייעוץ המדעי במהלך פיתוח שיטת הניסוי ההפוכה.

<ol><li>Sokolov, A., Aranson, I. S., Kessler, J. O., Goldstein, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concentration+dependence+of+the+collective+dynamics+of+swimming+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Concentration dependence of the collective dynamics of swimming bacteria.</a> Physics Review Letters. 98 (15), 158102(2007).</li>
<li>Saw, T. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+defects+in+epithelia+govern+cell+death+and+extrusion%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological defects in epithelia govern cell death and extrusion.</a> Nature. 544 (7649), 212-216 (2017).</li>
<li>Kawaguchi, K., Kageyama, R., Sano, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+defects+control+collective+dynamics+in+neural+progenitor+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Topological defects control collective dynamics in neural progenitor cell cultures.</a> Nature. 545 (97654), 327-331 (2017).</li>
<li>Toner, J., Tu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+order+in+a+two-dimensional+dynamical+XY+model%3A+how+birds+fly+together%5BTitle%5D)+AND+%22Physics+Review+Letters%22%5BJournal%5D)">Long-range order in a two-dimensional dynamical XY model: how birds fly together.</a> Physics Review Letters. 75 (23), 4326-4329 (1995).</li>
<li>Katz, Y., Tunstrøm, K., Ioannou, C. C., Huepe, C., Couzin, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inferring+the+structure+and+dynamics+of+interactions+in+schooling+fish%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Inferring the structure and dynamics of interactions in schooling fish.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (46), 18720-18725 (2011).</li>
<li>Needleman, D., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+matter+at+the+interface+between+materials+science+and+cell+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Materials%22%5BJournal%5D)">Active matter at the interface between materials science and cell biology.</a> Nature Reviews Materials. 2 (9), 17048(2017).</li>
<li>Weirich, K., Dasbiswas, K., Witten, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+motors+divide+active+liquid+droplets%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Self-organizing motors divide active liquid droplets.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (23), 11125-11130 (2019).</li>
<li>Memarian, F. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+nematic+order+and+dynamic+lane+formation+of+microtubules+driven+by+membrane-bound+diffusing+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Active nematic order and dynamic lane formation of microtubules driven by membrane-bound diffusing motors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (52), (2021).</li>
<li>Bausch, A., Sciortino, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+formation+and+polarity+sorting+of+driven+actin+filaments+on+lipid+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Pattern formation and polarity sorting of driven actin filaments on lipid membranes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (6), (2021).</li>
<li>Maroudas-Sacks, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+defects+in+the+nematic+order+of+actin+fibres+as+organization+centres+of+Hydra+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Topological defects in the nematic order of actin fibres as organization centres of Hydra morphogenesis.</a> Nature Physics. 17 (2), 251-259 (2021).</li>
<li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+braiding+and+virtual+particles+on+the+cell+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Topological braiding and virtual particles on the cell membrane.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (34), (2021).</li>
<li>Hirst, L. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHirst%2C+LS+%22Fundamentals+of+Soft+Matter+Science+2nd+ed%22">Fundamentals of Soft Matter Science 2nd ed</a>. , CRC Press. (2019).</li>
<li>Sanchez, T., Chen, D., DeCamp, S., Heymann, M., Dogic, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+motion+in+hierarchically+assembled+active+matter%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Spontaneous motion in hierarchically assembled active matter.</a> Nature. 491 (7424), 431-434 (2012).</li>
<li>Nedelec, F. J., Surrey, T., Maggs, A. C., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+microtubules+and+motors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organization of microtubules and motors.</a> Nature. 389 (6648), 305-308 (1997).</li>
<li>Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Sagués, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Taming+active+turbulence+with+patterned+soft+interfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Taming active turbulence with patterned soft interfaces.</a> Nature Communications. 8, 564(2017).</li>
<li>Thijssen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Submersed+micropatterned+structures+control+active+nematic+flow%2C+topology%2C+and+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Submersed micropatterned structures control active nematic flow, topology, and concentration.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 118 (38), (2021).</li>
<li>Shendruk, T. N., Doostmohammadi, A., Thijssen, K., Yeomans, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dancing+disclinations+in+confined+active+nematics%5BTitle%5D)+AND+%22Soft+Matter%22%5BJournal%5D)">Dancing disclinations in confined active nematics.</a> Soft Matter. 13 (21), 3853-3862 (2017).</li>
<li>Giomi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Geometry+and+topology+of+turbulence+in+active+nematics%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+X%22%5BJournal%5D)">Geometry and topology of turbulence in active nematics.</a> Physical Review X. 5 (3), 031003(2015).</li>
<li>Tan, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topological+chaos+in+active+nematics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Physics%22%5BJournal%5D)">Topological chaos in active nematics.</a> Nature Physics. 15 (10), 1033-1039 (2019).</li>
<li>Young, E. C., Berliner, E., Mahtani, H. K., Perez-Ramirez, B., Gelles, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subunit+interactions+in+dimeric+kinesin+heavy+chain+derivatives+that+lack+the+kinesin+rod%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Subunit interactions in dimeric kinesin heavy chain derivatives that lack the kinesin rod.</a> The Journal of Biological Chemistry. 270 (8), 3926-3931 (1995).</li>
<li>Gilbert, S. P., Johnson, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression%2C+purification%2C+and+characterization+of+the+Drosophila+kinesin+motor+domain+produced+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Expression, purification, and characterization of the Drosophila kinesin motor domain produced in Escherichia coli.</a> Biochemistry. 32 (17), 4677-4684 (1993).</li>
<li>Kuznetsov, S. A., Gelfand, V. I. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKuznetsov%2C+SA+%22Kinesin+Protocol%22">Kinesin Protocol</a>. Vernos, I. 164, Humana Press. NJ. (2001).</li>
<li>Hawkins, T. L., Sept, D., Mogessie, B., Straube, A., Ross, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+properties+of+doubly+stabilized+microtubule+filaments%5BTitle%5D)+AND+%22Biophysics+Journal%22%5BJournal%5D)">Mechanical properties of doubly stabilized microtubule filaments.</a> Biophysics Journal. 104 (7), 1517-1528 (2013).</li>
<li>Bate, T. E., Jarvis, E. J., Varney, M. E., Wu, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Controlling+flow+speeds+of+microtubule-based+3D+active+fluids+using+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Controlling flow speeds of microtubule-based 3D active fluids using temperature.</a> Journal of Visualized Experiments. (153), e60484(2019).</li>
<li>Castoldi, M., Popov, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+brain+tubulin+through+two+cycles+of+polymerization-depolymerization+in+a+high-molarity+buffer%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Expression+and+Purification%22%5BJournal%5D)">Purification of brain tubulin through two cycles of polymerization-depolymerization in a high-molarity buffer.</a> Protein Expression and Purification. 32 (1), 83-88 (2003).</li>
<li>Tayar, A. M., Lemma, L. M., Dogic, Z. Assembling microtubule-based active matter.. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTayar%2C+AM+%22Microtubules%22">Microtubules</a>. , Humana. New York, NY. 151-183 (2022).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Analytical Biochemistry. 72 (1-2), 248-254 (1976).</li>
<li>Guillamat, P., Ignés-Mullol, J., Shankar, S., Marchetti, M. C., Sagués, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+shear+viscosity+of+an+active+nematic+film%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+Review+E%22%5BJournal%5D)">Probing the shear viscosity of an active nematic film.</a> Physical Review E. 94 (6), 060602(2016).</li>
<li>Rudy, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lubricous+hydrogel+surface+coatings+on+polydimethylsiloxane+%28PDMS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Tribology+Letters%22%5BJournal%5D)">Lubricous hydrogel surface coatings on polydimethylsiloxane (PDMS).</a> Tribology Letters. 65, 3(2017).</li>
<li>Venzac, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PDMS+curing+inhibition+on+3D-printed+molds%3A+Why%3F+Also%2C+how+to+avoid+it%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">PDMS curing inhibition on 3D-printed molds: Why? Also, how to avoid it.</a> Analytical Chemistry. 93 (19), 7180-7187 (2021).</li>
<li>Khaladj, D. A., Hirst, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+curved+fluid+boundaries+to+confine+active+nematic+flows%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+of+Physics%22%5BJournal%5D)">Using curved fluid boundaries to confine active nematic flows.</a> Frontiers of Physics. 10, 880941(2022).</li>
</ol>

חלק מהחומרים המשמשים בעבודה זו סופקו ללא תשלום על ידי Cytoskeleton Inc. (דנבר, ארה"ב).

יש כמה נקודות לאורך הפרוטוקולים שבהן הנסיין יכול לבצע כמה בדיקות חשובות. לפני מילוי אחד מהמכשירים בחומר פעיל, יש להשתמש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית ( ראו איור 1) כדי לבדוק שהמיקרוטובולים הם פולימריים ואורכם האידיאלי ~2-3 מיקרומטר. אם מיקרוטובולים אינם נראים תחת המיקרוסקופ, ייתכן שהם עברו דה-פולימריזציה והנמטיקה הפעילה לא תיווצר. מאחר שמיקרוטובולים בודדים הם קטנים מאוד, ייתכן שיהיה מאתגר לצפות בהם ישירות דרך המיקרוסקופ. במחקר זה, נעשה שימוש במצלמה פלואורסצנטית באיכות גבוהה המיועדת ליישומים מאתגרים בתאורה חלשה עם התוכנה המשויכת כדי לאמת את צמיחת החוטים. אגרגטים פלואורסצנטיים משמעותיים לא צריכים להיות נוכחים בשלב זה, שכן זה עשוי להצביע על דה-פולימריזציה או על נוכחות של חלבון דנטורציה. זה גם רעיון טוב לעשות שקופית בדיקה מיקרוסקופית פשוטה על ידי שילוב microtubules, MIX, ו- ATP באותם יחסים כפי שמתואר בפרוטוקולים. הפעילות צריכה להתחיל בשילוב הרכיבים והחומר צריך להיראות דומה לזה שמוצג באיור 2C עם צרורות נוכחים ותנועות נימה בולטות הנראות לאורכו.
בעת שימוש בשיטת תא הזרימה, זמן הצנטריפוגה והכיוון של תא הזרימה חשובים ליצירת שכבה פעילה אחידה. שלב זה עשוי לדרוש כוונון עדין בהתאם לסוג הצנטריפוגה שבה נעשה שימוש. צנטריפוגה של תא הזרימה כאשר המישור הפעיל מכוון בניצב למישור הסיבוב נותנת את התוצאות הטובות ביותר מכיוון שניתן לדחוף את החומר לממשק הנוזל באופן אחיד. בדוק שוב שתא הזרימה אטום בקפידה לפני הצנטריפוגה.
כאשר משתמשים בשיטה הפוכה כדי לייצר נמטיקה פעילה מוגבלת ישנם מספר שלבים כדי לייעל. ראשית, חשוב להשתמש בשיטת הדפסה תלת מימדית המייצרת מבנים ברזולוציה גבוהה. קירות צדדיים לא אחידים יכולים לגרום למיקרוטובולים לתפוס, מה שישבש את הזרימות. הבארות לא צריכות להיות עמוקות מדי (במחקר זה נעשה שימוש בבארות בעומק 150-200 מיקרומטר עם שכבת נפט עילי בעובי 2 מ"מ). ייתכן שנסיינים יצטרכו להתאים את הפרמטרים הללו מעט על ידי ניסוי וטעייה כדי לקבל את התוצאה הטובה ביותר.
שיטת תאי הזרימה והשיטה ההפוכה שימשו מחברים שונים כדי לבחון מגוון השפעות המשפיעות על הזרימות הפעילות, כולל שמנים שונים12 ומבנים שקועים13. בחירת השיטה תלויה במטרה הניסויית. בשיטת תא הזרימה, הדמיה אופטית מעל השכבה הפעילה ברורה יותר מאשר בשיטה ההפוכה בשל הנוזלים השונים. בשיטת תאי הזרימה, ההדמיה מתבצעת באמצעות כיסוי זכוכית ושכבה דקה של מים, בעוד שהשיטה ההפוכה נועדה להחזיק את שכבת השמן למעלה. משמעות הדבר היא כי יש צורך ביעד מרחק עבודה ארוך עבור השיטה ההפוכה, ואיכות התמונה מופחתת. ניתן לראות הבדלים באיכות התמונה על-ידי השוואה בין איור 2D (שיטת תא זרימה) ואיור 3 (שיטה הפוכה), לבין סרט 1 וסרט 2, בהתאמה. עדשת הגדלה נמוכה יותר עם מרחק עבודה ארוך יותר נדרשה באיור 3 מזו ששימשה באיור 2. ניתן להימנע מחסרונות הדמיה אלה לשיטה ההפוכה אם קיים מיקרוסקופ הפוך מתאים, בשילוב עם מטרות עם מרחק עבודה מתאים למצעי ההחלקה של המיקרוסקופ. זכוכית דקה יותר יכולה לשמש כמצע כדי לאפשר שימוש במטרות סטנדרטיות של מרחק עבודה.
כיתרון, הגיאומטריה ההפוכה מאפשרת שימוש במגוון רחב יותר של צמיגות שמן, אינה דורשת בהכרח צנטריפוגה של דלי מתנדנד (אם זו אינה זמינה), והכנת המערכת קלה יחסית לאחר הכנת התבנית. עם זאת, עבור כליאה בבארות בשיטה הפוכה, צנטריפוגה מסוימת עשויה להיות חשובה כדי להכניס את החומר לשכבה דו-ממדית מוגדרת היטב.
שיטת תאי הזרימה שימשה לאחרונה בהצלחה רבה בניסויים שבהם נדרשת שכבה פעילה רציפה. עבודתנו האחרונה בחנה את הדינמיקה של פגמים טופולוגיים בשכבה הפעילה, שבה הדמיה איכותית וניתוח מרקם חשובים19. בנוסף, נעשה שימוש בשיטת תאי הזרימה כדי לחקור את ההשפעות של מיקרו-מבנים שקועים בשמן על זרימות פעילות16 ועמודים כדי ללכוד פגמים בזרימות הפעילות31. שיטה זו פועלת היטב להיווצרות שכבה פעילה רציפה, ואיכות התמונה מצוינת. עם זאת, שלב הצנטריפוגה המשמש לייצור השכבה הפעילה הדו-ממדית הסופית יכול להיות קשה לביצוע, ותאי הזרימה מועדים לדליפות ולבועות אוויר. השיטה ההפוכה היא חלופה שימושית מאוד עם אחוזי הצלחה גבוהים, קלה לבנייה, וניתן להשתמש בה לכל תבנית מצע או גיאומטריה בתנאי שניתן ליצור תבנית מאסטר מודפסת ברזולוציה גבוהה בתלת-ממד. שיטה זו שימושית גם לבחינת ההשפעות של כליאה גיאומטרית על דינמיקה נמטית פעילה מכיוון שהיא הופכת את מילוי בארות לפשוט יחסית.
במאמר זה מתוארות שתי דרכים ליצירת נמטיקה פעילה ממיקרוטובולים ומנועי קינסין, בתוספת טכניקה להגבלת החומרים בבארות. המערכת המוצגת מייצגת את הדוגמה הנקייה ביותר של שלב נמטי פעיל הקיים כיום בספרות ושוכפלה על ידי מספר קבוצות ברחבי העולם. משמעותו של חומר זה אינה טמונה רק במקורות הביולוגיים של מרכיביו, אלא גם משום שהוא פותח כיוון חדש לחלוטין בנוזלים מסודרים פעילים. על ידי עבודה עם מערכת זו והבהרת תכונותיה הבסיסיות, מדענים יכולים להתקדם לעבר תכנון של שלבים פעילים סינתטיים לחלוטין.
לניסויים המתמקדים בהשפעות הכליאה על נמטיקה פעילה יש פוטנציאל לענות על שאלות בסיסיות הנוגעות להתנהגות של זרימות פעילות ודינמיקה של פגמים טופולוגיים תחת כליאה טופולוגית. השיטה המוצגת כאן תסייע בביצוע מגוון ניסויים ממוקדי גיאומטריה וניתוחם, כולל מיקרופלואידיקה וערבוב פעיל.

נוזלים פעילים מורכבים מחלקיקים מונעי אנרגיה או מיסודות השואבים דלק מסביבתם המקומית. בתנאים הנכונים, האלמנטים הפעילים התנועתיים האלה יכולים לפעול באופן קולקטיבי כדי לייצר דינמיקה של נוזלים מתפתחים על פני קני מידה ארוכים של אורך. ישנן מגוון דוגמאות להתנהגות פאזה כזו מחוץ לשיווי משקל בספרות וניתן למצוא פאזות פעילות על פני הספקטרום של מערכות חיים. כמה דוגמאות בולטות הן מושבות של חיידקים1, יריעות תאים 2,3, ונחילה או נחיל של אורגניזמים 4,5. שלבים פעילים נחקרו בהרחבה גם בשלבים מעובים של חוטים ציטוסקטליים, בין אם כחלק מתא6 או במערכות סינתטיות שנועדו לעשות שימוש ברכיבים שחולצו ביולוגית 7,8,9. סידור גבישי נוזלי והיווצרות פגמים טופולוגיים הן במערכות טבעיות והן במערכות סינתטיות המורכבות מתמציות ביולוגיות מעניינים במיוחד את קהילת המחקר. בשנים האחרונות, קבוצות מחקר בחנו מערכות כאלה, את התכונות הפיזיקליות הבסיסיות שלהן ואת הרלוונטיות שלהן לביולוגיה 2,3,10,11.
מאמר זה מתמקד בהיווצרות המצב הנמטי הפעיל משילוב של מיקרוטובולים וחלבונים מוטוריים קינזיניים. הגביש הנוזלי הנמטי המסורתי הוא שלב שיווי משקל של חומר שבו המולקולות המרכיבות מציגות סדר אוריינטלי. לדוגמה, נוזל המורכב ממולקולות דמויות מוט קשיחות יחסית עשוי להציג הן את הפאזה הנמטית והן, בטמפרטורות גבוהות יותר, פאזת נוזל איזוטרופית לא מכוונת12. הדוגמה הניסויית הראשונה של פאזה נמטית פעילה פותחה על ידי Sanchez et al.13, תוך התאמת ניסוי חוץ גופי מוקדם יותר 14 שבו אשכולות של חלבונים מוטוריים שימשו ליצירת תנועת גזירה בין צרורות מיקרוטובולים שכנים. כאשר מערכת מיקרוטובולים זו הוגבלה לשכבה דקה, נוצר סדר נמטי ספונטני. בשנים האחרונות, המצב הנמטי הפעיל נחקר באינטנסיביות על ידי מספר קבוצות מחקרניסיוניות של 15,16 ו-17,18 קבוצות מחקר תיאורטיות, תוך התמקדות בתופעות כגון טורבולנציה פעילה - מצב שבו הנוזל מייצר זרימות כאוטיות מונעות עצמית 19 - ופגמים טופולוגיים ניידים. מאמר זה מתאר שיטות להכין וליצור את המצב הנמטי הפעיל ממיקרוטובולים ומנועי קינסין בגאומטריות ניסיוניות שונות. ראשית, מתוארות שיטות הכנה לפתרונות הרכיבים השונים, ואחריהן שיטות ליצירת הנמטיקה הפעילה באמצעות שתי גיאומטריות שונות של תאי זרימה. מוצגות תוצאות הדמיה אופייניות. לבסוף, מתוארות שיטות להגבלת הנמטי הפעיל בבארות ובתעלות.

<table><tbody><tr><td>20 kD PEG (פוליאתילן גליקול))</td><td>סיגמא אולדריץ</td><td>'</td><td>1419109 חומר דלדול מספר CAS: 125061-88-3</td></tr><tr><td>3-(trimethoxysilyl)פרופיל מתאקרילט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M6514-50ML</td><td>מספר CAS: 2530-85-0</td></tr><tr><td>מדפסת תלת מימד & שרף</td><td>Phrozen</td><td></td><td>Phrozen Sonic mini 8K מדפסת תלת מימד - Aqua Gray 8K שרף</td></tr><tr><td>40% תמיסת אקרילאמיד</td><td>BIO-RAD</td><td>1610140</td><td>מספר CAS: 7732-18-5, 79-06-1</td></tr><tr><td>חומצה אצטית</td><td>מספר פישר</td><td></td><td>CAS: 64-19-7</td></tr><tr><td>אצטון</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>מספר CAS: 67-64-1</td></tr><tr><td>יריעות דבק (הערה: "פרפילם" הוא אלטרנטיבה)</td> <td>גרייס ביו-לאבס</td><td>620001</td><td>SecureSeal</td></tr><tr><td>אמוניום פרסולפט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A3678</td><td>מספר CAS: 7727-54-0</td></tr><tr><td>Aquapel (הערה: "RainX" הוא אלטרנטיבה)</td> <td>טיפול</td><td></td><td>בזכוכית הידרופובית Aquapel טיפול בזכוכית הידרופובית</td></tr><tr><td>ATP (אדנוזין טריפוספט)</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A1852</td><td>מספר CAS: 34369-07-8</td></tr><tr><td>כוסות</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catalase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9322</td><td>מספר CAS: "9001-05-2"</td></tr> <tr><td>Desiccator</td><td>Bel-art</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצלמת CMOS דיגיטלית</td><td>Hamamatsu</td><td>ORCA - Flash4.0 LT+</td><td></td></tr><tr><td>DTT (Dithiothreitol)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9779</td><td>מספר CAS: "3483-12-3"</td></tr><tr><td>EGTA (3,12-bis(carboxymethyl)-6,9-dioxa-3,12-diazatetradecane-1,14-dioic acid)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>MFCD00004291</td><td>מספר CAS: 67-42-5</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>מספר CAS: 64-17-5</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td><td>Leica</td><td>DM 2500P</td><td></td></tr><tr><td>כיסויי זכוכית</td><td>VWR</td><td>48368-040</td><td></td></tr><tr><td>שקופיות זכוכית</td><td>VWR</td><td>16004-430</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G7021</td><td>מספר CAS: 50-99-7</td></tr><tr><td>גלוקוז אוקסידאז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>345386</td><td>מספר CAS: 9001-37-0</td></tr><tr><td>GMPCPP (גואניליל 5'-&אלפא;,&בטא;-מתילנדיפוספונאט)</td><td>Jena Bioscience</td><td>NU-405S</td><td>מספר CAS: 14997-54-7</td></tr><tr><td>שמן HFE7500</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלטה חמה</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>תרמיקס דגם 100M</td><td></td></tr><tr><td>איזופרופיל אלכוהול</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl (אשלגן כלורי)</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>P5405</td><td>מספר CAS: 7447-40-7</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>מספר CAS: 67-56-1</td></tr><tr><td>MgCl2 (מגנזיום כלוריד)</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>208337</td><td>מספר CAS: 7786-30-3</td></tr><tr><td>צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>אפנדורף - מטהר</td><td></td> מים ננו-טהור תרמו פישר 1.5 מ"ל <td></td></tr><tr><td></td><td>Sartorius</td><td>arium mini</td><td></td></tr><tr><td>NaOH (נתרן הידרוקסיד)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>SX0603</td><td>CAS מספר: 1310-73-2</td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PH מד</td><td>תרמו מדען</td><td>אוריון 3 STAR</td><td></td></tr><tr><td>פוספואנול-פירובט (PEP)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>MFCD00044476</td><td>מספר CAS: 4265-07-0</td></tr><tr><td>צינורות (1,4-חומצה פיפרזיניתדיאטנסולפונית)</td> מספר CAS של <td>סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>: 5625-37-6</td></tr><tr><td>פיפטות (0.2 - 1000 ומיקרו; l)</td> <td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Sigma Aldrich</td><td>2594628</td><td></td></tr><tr><td>RAN פעילי שטח (הערה: "FluoSurf" מבית Emulso הוא אלטרנטיבה)</td> <td>Ran Biotechnologies</td><td>008-FluoroSurfactant-2wtH-50G</td><td></td></tr><tr><td>שמן סיליקון (100mpa s-1000 mpa s)</td> <td>מספר סיגמא אולדריץ'</td><td></td><td>CAS: 63148-52-7</td></tr><tr><td>Streptavidin</td><td>Thermofisher</td><td>S888</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה דלי מתנדנד</td><td>Thermo Scientist</td><td>Sorvall legend RT+</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 בסיס אלסטומר</td><td>מכשירים מדויקים עולמיים</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 סוכן ריפוי אלסטומר</td><td>World Precision Instruments</td><td>SYLG184</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>Eppendorf</td><td>MiniSpin Plus</td><td></td></tr><tr><td>TEMED (Tetramethylethylenediamine)</td><td>BIO-RAD</td><td>1610800</td><td>מספר CAS: 110-18-9</td></tr><tr><td>Trolox (חומצה 6-הידרוקסי-2,5,7,8-טטרמתילכרומן-2-קרבוקסילית)</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>MFCD00006846</td><td>מספר CAS: 53188-07-1</td></tr><tr><td>שלד ציטו</td><td>טובולין</td><td>T240-B</td><td></td></tr><tr><td>טובולין (תווית רודמין)</td><td>שלד ציטו</td><td>TL590M-A</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן</td><td>אופטימה מקס-TL</td><td></td></tr><tr><td>אור UV</td><td>RapidFix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>דבק הניתן לריפוי UV (הערה: "Norland NO81" הוא אלטרנטיבה)</td> <td>RapidFix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Water Bath</td><td>Thelco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Whatman נייר סינון</td><td>Sigma Aldrich</td><td>WHA1001325</td><td></td></tr></tbody></table>

יצירה, הגבלה והתבוננות בנמטיקה פעילה מבוססת מיקרוטובולים

Forming, Confining, and Observing Microtubule-Based Active Nematics

היווצרות פאזות פעילות מבוססות ביופולימרים הפכה לטכניקה חשובה עבור חוקרים המעוניינים לחקור את התחום המתפתח של גבישים נוזליים פעילים ואת תפקידיהם האפשריים בביולוגיה של התא. מערכות חדשניות אלה מורכבות מתת-יחידות המונעות על ידי עצמן הצורכות אנרגיה באופן מקומי, ומייצרות נוזל דינמי מחוץ לשיווי משקל. כדי ליצור את שלב הגביש הנוזלי הפעיל המתואר בדוח זה, רכיבי חלבון מטוהרים כולל ביופולימרים ומנועים מולקולריים משולבים, והפאזה הנמטית הפעילה נוצרת באופן ספונטני בנוכחות אדנוזין טריפוספט (ATP). כדי לבחון את המצב הנמטי, החומר חייב להיות מוגבל בגיאומטריה מתאימה למיקרוסקופיה בצפיפות גבוהה מספיק. מאמר זה מתאר שתי שיטות שונות להיווצרות פאזה נמטית פעילה באמצעות מיקרוטובולים ומנועי קינסין: הרכבה של שכבה פעילה דו-ממדית בממשק שמן ומים והרכבה תחת שכבת שמן באמצעות באר אלסטומרית. מתוארות גם טכניקות להכנסת החומר הפעיל לבארות קטנות בצורות שונות.

איור 1 מראה תמונה מייצגת של מיקרוטובולים בודדים שהוכנו מטובולין GMPCPP. התמונה מתארת מיקרוטובולים קצרים באורכים דומים (עם פיזור מסוים). דילול מספיק של תמיסת המיקרוטובול אמור לייצר תמונה של מיקרוטובולים מופרדים היטב לאימות אורך. המיקרוטובולים הבודדים עשויים להיות מאתגרים לצילום בשל גודלם הקטן. השימוש במצלמה בעלת רגישות גבוהה המיועדת למיקרוסקופיה פלואורסצנטית הוא הטוב ביותר עבור יישום זה. איור 2 ואיור 3 מראים תמונות מיקרוסקופיה פלואורסצנטיות לדוגמה של ניסויים מוצלחים שבוצעו בשיטת תא הזרימה (סעיף 2.1) ובשיטה ההפוכה (סעיף 2.2), בהתאמה. שכבה נמטית פעילה שנוצרה היטב היא הומוגנית במרקם, ללא אזורים ריקים משמעותיים ופגמים טופולוגיים ניידים. עם זאת, שים לב שעשויים להיות כמה חללים קטנים מקובלים בליבות הפגם. בנוסף לדוגמאות המוצגות באיור 2 ובאיור 3, נכללו שלושה סרטים משלימים (סרט 1, סרט 2 וסרט 3) כדי להדגים כיצד הנמטיקה הפעילה צריכה להופיע בניסוי מוצלח. כל הסרטים מדגימים את התנועה הרציפה החלקה של הפאזה הנמטית הפעילה. לא ניכרים שינויים בריכוז המיקרוטובולים לאחר שהחומר הגיע למצבו היציב. כל עוד קיים מספיק ATP במערכת, החומר ימשיך לנוע באופן אחיד.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64287/64287fig01.jpg"> איור 1: תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי של מיקרוטובולים GMPCPP. המיקרוטובולים של GMPCPP סומנו ב-4% עם טובולין רודאמין ופולימריים במשך 20 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. ההדמיה בוצעה בטמפרטורת החדר. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/64287fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64287/64287fig02.jpg"> איור 2: נמטיקה של מיקרוטובולים בתא זרימה . (A) סכמת חתך של תא הזרימה, גיאומטריה של 1 מ"מ x 18 מ"מ. (B) סכמת תצוגה עליונה של תא הזרימה. (C) תמונת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית המדגימה את המראה האופייני של התמיסה הפעילה לפני ההרכבה בממשק שמן/מים. (D) תמונת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של הפאזה הנמטית הפעילה המורכבת בממשק השמן/מים בתוך תא הזרימה. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/64287fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64287/64287fig03.jpg"> איור 3: תמונת מיקרוסקופ פלואורסצנטי המציגה נמטיקה פעילה שהוכנה בשיטה הפוכה. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/64287fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64287/64287fig04.jpg"> איור 4: דיאגרמת זרימה הממחישה את השיטה לכליאה נמטית פעילה בבאר PDMS, כולל ייצור עובש וטיפול בפני השטח. סרגל קנה מידה בתמונה הימנית (חומר פעיל מוגבל) = 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/64287fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
סרט 1: תוצאה מייצגת עבור נמטיקה פעילה שהוכנה בשיטת תא הזרימה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/MOVIE1_JOVE.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.</a>
סרט 2: תוצאה מייצגת לנמטיקה פעילה שהוכנה בשיטה הפוכה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/MOVIE2_JOVE.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.</a>
סרט 3: תוצאה מייצגת לנמטיקה פעילה שהוכנה בשיטה הפוכה המוגבלת לבאר אליפטית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64287/MOVIE3_JOVE.avi" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד סרט זה.</a>

מוצגות כאן שיטות להכנת נמטיקה פעילה ממיקרוטובולים ומנועי קינסין, כולל הכנה ובנייה של חלבונים ושימוש בבארות לכליאה נמטית פעילה.

The formation of biopolymer-based active phases has become an important technique for researchers interested in exploring the emerging field of active ...

נמטיקה פעילה התגלתה כנושא מחקר מרתק המרחיב את תחומי הדינמיקה הלא ליניארית וגבישים נוזליים. ישנם נוזלים מורכבים המציגים פגמים טופולוגיים בני תמותה ודינמיקה כאוטית. ישנם מחקרים תיאורטיים רבים שפורסמו לאחרונה בספרות והתמקדו בנמטיקה פעילה מוגבלת.עם זאת, זה היה מאתגר עבור נסיינים להגביל את החומר בגיאומטריות בקנה מידה זעיר. הטכניקה שלנו הופכת את מערך הניסוי לפשוט יותר כדי שהקבוצות החדשות יוכלו להיכנס לתחום ולנסות את החומרים המרגשים האלה. הטכניקות יכולות להיות מיושמות על מערכות חומר פעיל אחרות של EQUIS, למשל כדי ליצור פאזת מורכבת של השפעה וככל שפאזות פעילות יותר יפותחו בעתיד הנסיינים יצטרכו למצוא דרכים להגביל את החומר באמצעות נמטיקה דומה.מי שידגימו את ההליך יהיו דרק האמר ופרשטה ממריאן, סטודנטים לתארים מתקדמים מהמעבדה שלי. כדי להכין החלקות כיסוי הידרופיליות עם ציפוי אקרילאמיד להתחיל על ידי ניקוי הכיסוי מחליק ביסודיות עם מי סבון, אתנול ו 0.1 טוחנת נתרן הידרוקסיד עם שטיפות חלופיות באמצעות מים טהורים ננו. לאחר שטיפת הציפוי המכסה מחליק עם תמיסת Silane המורכבת מ-100 מיליליטר אתנול מיליליטר אחד של חומצה סגפנית ו-500 מיקרוליטר של טרימתוקסיסיליל פרופיל מתקרילט למשך 15 דקות.לאחר מכן יש לשטוף במים טהורים. הכינו תמיסת אקרילאמיד מ-95 מיליליטר מים ננו-טהורים וחמישה מיליליטרים של 40 אחוז אקרילאמיד. לאחר מכן degas את הפתרון במשך 30 דקות בתנור ואקום, להוסיף 0.07 גרם של אמוניום לכל סולפיט ו 35 מיקרוליטר של Tetramethylethylenediamine עבור ריכוז סופי 2.3 מילימולר.יש לשפוך תמיסת אקרילאמיד על הכיסוי תוך כדי פניה כלפי מעלה ולדגור במשך הלילה בטמפרטורת החדר. כדי להכין מיקרוסקופ הידרופובי מחליק פיפטה 100 מיקרוליטר של תמיסה דוחה מים על שקופית מיקרוסקופ זכוכית נקייה. לאחר מכן הניחו עוד שקופית זכוכית נקייה על גבי.זה מבטיח ציפוי אחיד של תמיסה דוחה מים על פני השטח שבו הוא יושב במשך שתי דקות. הסר את מגלשת הזכוכית השנייה ושטוף היטב את המגלשה הראשונה במים טהורים. לאחר מכן יבש עם גז חנקן.הכינו תערובת של שמן מהונדס הכוללת 1.8% פלואורו פעילי שטח. הרכיבו את מגלשת הזכוכית ואת מחליק הכיסוי באמצעות מרווחי דבק דו-צדדיים של 40 מיקרומטר. הניחו את הספייסרים במרחק של 1.5 מילימטרים זה מזה במגלשת המיקרוסקופ ההידרופובי.לאחר מכן הניחו את הכיסוי המצופה באקרילאמיד על גבי הספייסרים עם צד מטופל עם הפנים כלפי מטה כדי לדבוק. לאחר שתא הזרימה נבנה מיד פיפטה תערובת השמן לתוך תא הזרימה הממלא את החלל הסגור באמצעות פיפטה בבקבוקון נפרד, מערבבים בעדינות שישה מיקרוליטרים של חומר פעיל עם 3.73 מיקרוליטר של תערובת. מיקרוליטר אחד של תמיסת מיקרוטובול 0.6 מיקרוליטר של תמיסת ATP, ו-0.67 מיקרוליטרים של פיפטה חיץ M two B שישה מיקרוליטרים של חומר פעיל מעורבב טרי לקצה פתוח אחד של תא הזרימה.חלק מהשמן ייעקר על ידי התמיסה המימית כשהוא מוזרק לתעלה. זה יכול להיות מרושע בקצה הנגדי של ערוץ הזרימה באמצעות פיסת נייר טישו קטנה. לאחר המילוי, יש לאטום את שני צידי תא הזרימה בדבק אפוקסי המתקשה בעת חשיפה לאור UV למשך 20 שניות.להגביל את השכבה הפעילה בין שני הנוזלים הקבילים בשכבה מעין דו-ממדית. מניחים את תא הזרימה בצנטריפוגת דלי מתנדנדת עם הפאזה המימית למעלה ושכבת השמן הצפופה יותר מתחת לצנטריפוגה ב-212 גרם למשך 10 דקות. לאחר השלמת שלב זה ניתן לקחת את תא הזרימה למיקרוסקופ אפי-פלואורסצנטי להדמיה עם מטרת הגדלה של 10 x או 20 x.ראשית, תכנן תבנית אב עבור PDMS. זה יכול להיות מושגת על ידי הדפסת עמודים 3D על מצע. לאחר הדפסת תלת מימד של התבנית הראשית של שרף, נקו אותה עם איזופרופנול ולאחר מכן רפאו את התבנית מתחת למנורת UV למשך 45 דקות ובתנור ב 120 מעלות צלזיוס למשך שעתיים, הכינו את הצבע פולי מתיל ציאן באמצעות חומר ריפוי אלסטומר ובסיס אלסטומר.מערבבים את שני הרכיבים ביחס של 1 עד 10 בעזרת מרית מתכת. כדי להסיר את הבועות האלה, מניחים את התערובת מתחת לוואקום כדי לרוקן במשך שעה אחת לאחר מכן PDMS uncured צריך להיראות שקוף. יוצקים את PDMS לתוך תבנית מתאימה ולהשאיר לילה לרפא ב 60 מעלות צלזיוס.כדי להכין משטח PDMS הידרופילי יש לנקות את ה-PDMS במשך 10 דקות גם עם אתנול וגם עם איזופרופנול, ואז לשטוף היטב במים שעברו דה-יוניזציה שלוש פעמים ולייבש. השתמשו במנקה פלזמה למשך חמש דקות כדי לנקות את ה-PDMS שנרפא יבש. זה הופך את פני השטח להידרופיליים יותר.לאחר מכן, הכינו תמיסת סילאן וטבלו את המצע בתמיסה זו למשך 15 דקות כדי להכין את ציפוי האקרילאמיד, שטפו היטב את המצע במים שעברו דה-יוניזציה וטבלו בתמיסת אקרילאמיד. כאשר הוא מוכן לשימוש, יש לשטוף את פני השטח במים שעברו דה-יוניזציה ולייבש בחנקן לשימוש מיידי. חברו את ה-PDMS למגלשת זכוכית עם דבק אפוקסי, הוסיפו מיקרוליטר אחד של התערובת הפעילה על מצע ה-PDMs, והוסיפו מיד שמן סיליקון על גבי טיפת הרשת הפעילה.הרשת הפעילה תעבור לבאר. תהליך זה אורך עד 60 דקות. מניחים את מכשיר ה-PDMS בצנטריפוגת דלי מתנדנדת עם שכבת השמן מעל שכבת המים ומסתובבים במשך 12 דקות ב-212 G.לאחר השלמת שלב זה, קחו את החומר למיקרוסקופ להדמיית התקדמות החומר.כפי שהוא מתאזן. התמונה המייצגת מתארת מיקרוטובולים קצרים באורכים דומים. המיקרוטובולים הבודדים עשויים להיות מאתגרים לצילום בשל גודלם הקטן.השימוש במצלמה בעלת רגישות גבוהה המיועדת למיקרוסקופיה פלואורסצנטית הוא הטוב ביותר עבור יישום זה. שכבה פנאומטית פעילה הבנויה היטב היא הומוגנית במרקם ללא אזורי ריק משמעותיים ופגמים טופולוגיים ניידים. שים לב, עם זאת, כי ייתכן שיש כמה חללים קטנים מקובלים בליבות הפגם.טיפול פני השטח הנכון יש משטח הידרופילי או הידרופובי. בשיטה זו ניתן לדון בקלות בגלגול הגיאומטריה וניתן לשלוט במבנה הפעיל רק על ידי שינוי הכליאה הפיזית.

forming-confining-and-observing-microtubule-based-active-nematics

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Microtubules מטבעם פולימרים לא יציבים, ומיתוגם בין הצמיחה וקיצור הוא אקראי וקשה לשליטה. כאן אנו מתארים פרוטוקולים באמצעות microtubules המפולח עם כובעי ייצוב photoablatable. Depolymerization של microtubules המפולח יכול להיות מופעל עם רזולוציה של זמן ומרחב גבוה, ובכך מסייע לניתוח של תנועות עם קצות microtubule פירוק.

הכנת Microtubules מקוטע לחקר תנועות מונעים על ידי מסתיים microtubule הפירוק

ניצני שמרים הוא מודל יתרון לחקר הדינמיקה microtubule in vivo עקב גנטיקה חזקה שלה ואת הפשטות של שלד התא microtubule שלה. הפרוטוקול הבא מתאר כיצד להפוך ותאי שמרי התרבות, לרכוש תמונות מיקרוסקופיה confocal, וגם כמותית לנתח דינמיקת microtubule בתאים חיים שמרים.

הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח של Dynamics microtubule אסטרל הבודד שמרים ניצנים

פרוטוקול להדמיית המיקרוטובולות הדינמיות ב-vivo באמצעות חלבון מחייב קצה עם תווית פלואורסצנטית הוצג. תיארנו את השיטות לתיוג, תמונה וניתוח המיקרוטובולות הדינמיות בתאי העצב של מיקרוטובול לרוחב אחורי (PLM) של C. elegans.

In vivo הערכה של מיקרוטובולה דינמיקה והתמצאות ב Caenorhabditis elegans נוירונים

כאן, בדיקת שחזור במבחנה מבוססת מיקרוסקופיה TIRF מוצגת כדי לכמת ולהשוות בו זמנית את הדינמיקה של שתי אוכלוסיות microtubule. שיטה מתוארת כדי להציג בו זמנית את הפעילות הקולקטיבית של חלבונים מרובים הקשורים microtubule הקשורים על חבילות microtubule מקושרים ו microtubules יחיד.

הדמיה סימולטנית של הדינמיקה של מיקרוטובולים מקושרים ובודדים במבחנה על ידי מיקרוסקופיה TIRF

כאן אנו מציגים פרוטוקול לשחזור צרורות מיקרוטובולים במבחנה וכימות ישיר של הכוחות המופעלים בתוכם באמצעות השמנה אופטית סימולטנית ומיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת. בדיקה זו מאפשרת מדידה ברמה ננומטרית של הכוחות והתזוזות הנוצרים על ידי הרכבי חלבונים בתוך רשתות מיקרוטובולים פעילות.

מדידה ישירה של כוחות בתוך צרורות מיקרוטובולים פעילים משוחזרים

אנו מציגים פרוטוקולים לבדיקות מיקרופלואידיות פשוטות של נימת אקטין, בשילוב עם מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרות לנטר במדויק חוטי אקטין בודדים בזמן אמת תוך חשיפתם ברצף לתמיסות חלבון שונות.

שימוש במיקרופלואידיקה ובמיקרוסקופיה פלואורסצנטית כדי לחקור את דינמיקת ההרכבה של חוטי אקטין בודדים וחבילות

מאמר זה מציג פרוטוקול להיווצרות מכלולים של מיקרוטובולים בצורת טקטואידים תוך שימוש ב-MAP65, קרוסלינקר מיקרוטובולים על בסיס צמחי, ו-PEG כסוכן צפיפות.

הרכבה עצמית של טקטואידים מיקרוטובולים

מאמר זה מציג פרוטוקולים להנדסה ולאפיון רשתות תלת-ממדיות מרוכבות הניתנות לכוונון של חוטי אקטין ומיקרו-טובולים המסתבכים. חומרים מרוכבים עוברים ארגון מחדש אקטיבי ותנועה בליסטית, מונעים על ידי מנועי מיוזין II וקינסין, ומכוונים על ידי הריכוזים היחסיים של אקטין, מיקרוטובולים, חלבונים מוטוריים וקרוסלינקרים פסיביים.

שחזור ואפיון מרוכבים של אקטין-מיקרוטובול עם דינמיקה ומכניקה מונעות מנוע ניתנות לכוונון

בעבודה זו, גישה של בנייה מחדש במבחנה משמשת לחקר הפורואלסטיות של ג'ל אקטומיוזין בתנאים מבוקרים. הדינמיקה של ג'ל האקטומיוזין והממס המוטבע מכומתים, שבאמצעותם מודגמת פורואלסטיות הרשת. אנו דנים גם באתגרים הניסיוניים, במלכודות הנפוצות וברלוונטיות למכניקת השלד התא.

המכניקה של (פורו-)רשתות אקטומיוזין אלסטיות כמערכת מודל של שלד התא

כאן, אנו מציגים שיטות להכנת מכלולי אקטין מעין דו-ממדיים (2D) שזורים, צולבים וגבישים נוזליים מחלבונים מטוהרים.

כוונון מצבי ההתכווצות והעיוות של מכלולים מבוססי אקטין פעילים במבחנה: מרשתות פעילות דו-ממדיות לטיפות גביש נוזלי

פרוטוקול זה מפרט את התכנון והייצור של מכשיר מיקרופלואידי, המתאים לחקירת מכניקת פולימרים מיקרו-צינוריים. הסינתזה של מיקרו-ייצור, בקרת זרימה אוטומטית וטכניקות מידול חישוביות מאפשרת מערכת גמישה המתאימה באופן אידיאלי לחקירת השלד התאי במבחנה.

פיתוח גישה מבוססת מיקרופלואידיקה לחקר מכניקת פולימרים מיקרו-צינוריים

חקור את הכנת נמטיקה פעילה מבוססת מיקרוטובולים וקינזין לחקר דינמיקה לא ליניארית ונוזלי גבישיים. השיטה מאפשרת הגבלה במיקרוגיאומטריה ותצפית בפגמים טופולוגיים ניידים.

יצירה, הגבלה והתבוננות בנמטיקה פעילה מבוססת מיקרוטובולים

גלה סרטונים נוספים