שילוב של מיקרוסקופיית ניקוי ופלואורסצנציה להדמיית שינויים בביטוי גנים ותגובות פיזיולוגיות לפלסמודיופורה brassicae

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה אופטימלית לתצפית היסטולוגית של גלים המושרים על ידי פלזמודיופורה brassicae. מקטעי ויברטומים של היפוקוטיל מנוקים לפני הדמיה פלואורסצנטית כדי לחקור את המעורבות של גורמי שעתוק ופיטוהורמונים במהלך התקדמות המחלה. פרוטוקול זה מתגבר על מגבלות הטמעת הרגם, ומאפשר הדמיה של חלבונים פלואורסצנטיים בצמחים.

פלסמודיופורה (שם מדעי: Plasmodiophora brassicae) הוא פתוגן ביוטרופי חובה הנישא בקרקע, התוקף צמחים ממשפחת ה-Brassicaceae. עם ההדבקה, פתוגן גורם להתפתחות של galls על החלקים התת-קרקעיים של הצמח, ומכאן השם של המחלה clubroot. הפיתוח של galls מלווה תכנות מחדש מורכב מאוד.

לכן, האפשרות לעקוב אחר שינויים פנימיים במהלך מחלה היא חיונית להבנת האינטראקציה בין הצמח לפתוגן. הפרוטוקול שלנו משפר את ההדמיה של מורכבים, עבים וגרגרים. זה מקל על הדמיה של שינויים בביטוי גנים, תגובות פיזיולוגיות, איזון phytohormone, התקדמות המחלה, התפלגות נבגים, ו lignification מקומי.

הפרוטוקול משמר חלבונים פלואורסצנטיים בתוך דגימות, ומאפשר אחסון ועיבוד של אובייקטים לאורך זמן. הוא גם מאפשר מעקב אחר שינויים ביוכימיים ומבניים הנלווים להתקדמות המחלה. מי שידגימו את ההליך יהיו שרה בליצ'רץ, חוקרת בתר-דוקטוריאלית בקבוצה שלנו, דקשה סינג, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו, וקורנל מיכלאק, דוקטורנטית מקבוצת פרופ' אגניישקה בגנייבסקה-זדוורנה באוניברסיטת אדם מיצקייביץ'.

מתחילים בהכנת רקמת הצמח. בזהירות להסיר אדמה ממערכות השורשים של צמחים נגועים clubroot ולא נגועים. נקו היטב עם מים ואספו היפוקוטיל וגלגלות לתוך צינורות מיקרוצנטריפוגה.

תקן את הדגימות ב 200 עד 500 מיקרוליטר של paraformaldehyde fixative במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר על ידי החלת ואקום קבוע של 700 מיליבר באמצעות משאבת ואקום. ודא כי האובייקט שקוע לחלוטין בתמיסת paraformaldehyde. יש להשתמש ב-4%agarose להטמעת היפוקוטיל שאינם נגועים ובגלים נגועים.

מרתיחים את התמיסה כדי להמיס agarose ושופכים אותו כאשר הוא מתקרר בזמן שהוא עדיין צמיג. יבש את האובייקט מעט על רקמה במשך כמה שניות כדי להסיר paraformaldehyde עודף. השתמש בקיסמים או מלקחיים כדי להטביע ולכוון את האובייקט הצמחי באגרוז בזהירות.

כדי למנוע מקטעים אלכסוניים, ודא שהאובייקט מכוון ומעוצב כראוי כך שצירו ניצב למישור להב הוויברטום. כדי להאיץ את התמצקות האגרוז, הניחו צלחת פטרי או רב-תרבותית בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. באמצעות להב, בזהירות לחתוך ולעצב את האובייקט בתוך בלוק agarose, וציין את הכיוון המועדף עבור חתך.

הדביקו את גוש האגרוז או את הגל הגדול כדי להרכיב אותו כראוי על מחזיק הדגימה באמצעות ציאנואקרילט או דבק מיידי וסרט מיסוך. התאם את העובי למקטעים, מהירות ומשרעת רטט בהתאם לעובי וגודל המרה. מוסיפים מים מזוקקים לאמבטיית המים ומתחילים בחתך.

אסוף בזהירות חלקים באמצעות מלקחיים או מברשת והעבר אותם לתוך צינור microcentrifuge המכיל מיליליטר אחד של 1X PBS buffer. הסר 1X PBS מצינור microcentrifuge ולהוסיף 200 עד 500 microliters של פתרון ניקוי. החלף את פתרון הניקוי בחדש אם צבעו משתנה לאחר זמן מה במהלך עיבוד הדגימה.

ביצוע צביעה לבנה של קלקופלואור על דפנות התאים של תאי הצמח המשתלבים על ידי הכנת 5% של כתם לבן קלקופלו בתמיסת הניקוי. לאחר מכן מכתימים את התאים בחושך במשך חמש דקות לפחות. כתמים שומנים עם אדום הנילוס וליגנינים עם צביעת ליגנין בסיסית של פוקסין כפי שמתואר בכתב היד של הטקסט והרכיבו את החלקים המנוקים על שקופית המיקרוסקופיה.

לאחר מכן התבונן בתאים תחת אפיפלואורסצנציה או מיקרוסקופ קונפוקלי. השתמש במצבי רכישה מרובים להדמיית יותר מספקטרום פלואורסצנטי אחד בו-זמנית. דינמיקה של מחלות והצטברות פתוגנים הייתה במעקב בכיסים שהתיישבו על ידי פלסמודיופורה brassicae, ותאים גדולים עם נבגי P.brassicae נחים נצפו לאחר צביעה אדומה של הנילוס.

שינויים בהבחנה של קסילם עם זיהום P.brassicae הודגמו באמצעות צביעת פוקסין בסיסית. צמחי Arabidopsis בעלי מבנה pHCA2:erRFP נוצלו כדי להמחיש את ביטוי הגנים HCA2 ברקמת פלום בתוך כיסי כיס הים. HCA2 השתלב עם הפלום בשלבים המאוחרים של התפתחות גליל מונחה P.brassicae, ופעילות הגנים שיקפה את המנגנון שבאמצעותו P.brassicae מגביר את מורכבות הפלום.

ב-16 ימים לאחר החיסון, הוערכו תגובות ציטוקינין דיפרנציאליות בין צמחים נגועים ללא נגועים על ידי בדיקת הביטוי של סמן TCS:GFP בפיתוח כיס מרה. נראה כי תגובות הציטוקינין פחתו באופן משמעותי בגלים נגועים, בעוד שהם נשארו חזקים, במיוחד בבריכת הפלום, בצמחים שאינם נגועים. השלבים הקריטיים ביותר הם קיבוע ב- PFA, הטבעה וחיתוך.

עבור חיתוך ויברטום, יש לייעל ולהתאים בזהירות פרמטרים של מהירות, משרעת ועובי כדי להשיג מקטעים באיכות טובה. טכניקות חיתוך ויברטומים וניקוי רקמות סללו את הדרך לשיפור הניתוח המיקרוסקופי של תגובות פיזיולוגיות במהלך אינטראקציות בין צמחים למיקרובים ורקמות המציגות צמיחה משנית עם אנטומיה תאית מורכבת.