Name: ספירת יחידות יוצרות מושבה מהירה בתבנית צלחת 96 בארות המיושמת על מיקרוביום הדרוזופילה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-13T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 55 s
Description: למד שיטה אוטומטית לספירת יחידות יוצרות מושבה בפורמט צלחת 96 בארות לניתוח מיקרוביום Drosophila. הפרוטוקול מציע יתרון של מאה מונים בזמן בהשוואה לשיטות מסורתיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ד"ר קרווין קייסי הואנג, ד"ר אנדרס ארנדה-דיאז, טד קופר וחברי מעבדת לודינגטון נתנו מידע חשוב על פיתוח פרוטוקול זה. המימון ניתן על ידי מענק NSF IOS 2032985, מענק NIH DP5OD017851, מענק של מכון קרנגי בקנדה והקדש של מכון קרנגי למדע.

<ol><li>McFall-Ngai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animals+in+a+bacterial+world%2C+a+new+imperative+for+the+life+sciences%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Animals in a bacterial world, a new imperative for the life sciences.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (9), 3229-3236 (2013).</li>
<li>Shepherd, E. S., Deloache, W. C., Pruss, K. M., Whitaker, W. R., Sonnenburg, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+exclusive+metabolic+niche+enables+strain+engraftment+in+the+gut+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An exclusive metabolic niche enables strain engraftment in the gut microbiota.</a> Nature. 557 (7705), 434-438 (2018).</li>
<li>Taur, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+domination+and+the+risk+of+bacteremia+in+patients+undergoing+allogeneic+hematopoietic+stem+cell+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Intestinal domination and the risk of bacteremia in patients undergoing allogeneic hematopoietic stem cell transplantation.</a> Clinical Infectious Diseases. 55 (7), 905-914 (2012).</li>
<li>Buffie, C. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+microbiome+reconstitution+restores+bile+acid+mediated+resistance+to+Clostridium+difficile%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Precision microbiome reconstitution restores bile acid mediated resistance to Clostridium difficile.</a> Nature. 517 (7533), 205-208 (2015).</li>
<li>Callahan, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DADA2%3A+High-resolution+sample+inference+from+Illumina+amplicon+data%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">DADA2: High-resolution sample inference from Illumina amplicon data.</a> Nature Methods. 13 (7), 581-583 (2016).</li>
<li>Vandeputte, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+variability+in+quantitative+human+gut+microbiome+profiles+and+implications+for+clinical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Temporal variability in quantitative human gut microbiome profiles and implications for clinical research.</a> Nature Communications. 12 (1), 6740(2021).</li>
<li>D'hoe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrated+culturing%2C+modeling+and+transcriptomics+uncovers+complex+interactions+and+emergent+behavior+in+a+three-species+synthetic+gut+community%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Integrated culturing, modeling and transcriptomics uncovers complex interactions and emergent behavior in a three-species synthetic gut community.</a> eLife. 7, 2892(2018).</li>
<li>Ludington, W. B., Ja, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+as+a+model+for+the+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Drosophila as a model for the gut microbiome.</a> PLoS Pathogens. 16 (4), 1008398(2020).</li>
<li>Chandler, J. A., Lang, J. M., Bhatnagar, S., Eisen, J. A., Kopp, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+communities+of+diverse+Drosophila+species%3A+Ecological+context+of+a+host-microbe+model+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Bacterial communities of diverse Drosophila species: Ecological context of a host-microbe model system.</a> PLoS Genetics. 7 (9), 1002272(2011).</li>
<li>Pais, I. S., Valente, R. S., Sporniak, M., Teixeira, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+melanogaster+establishes+a+species-specific+mutualistic+interaction+with+stable+gut-colonizing+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Drosophila melanogaster establishes a species-specific mutualistic interaction with stable gut-colonizing bacteria.</a> PLoS Biology. 16 (7), 2005710(2018).</li>
<li>Adair, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+determinants+of+among-species+variation+in+microbiome+composition+in+drosophilid+flies%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Host determinants of among-species variation in microbiome composition in drosophilid flies.</a> The ISME Journal. 14, 217-229 (2019).</li>
<li>Koyle, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rearing+the+fruit+fly+Drosophila+melanogaster+under+axenic+and+gnotobiotic+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rearing the fruit fly Drosophila melanogaster under axenic and gnotobiotic conditions.</a> Journal of Visualized Experiments. (113), e54219(2016).</li>
<li>Lesperance, D. N. A., Broderick, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbiomes+as+modulators+of+Drosophila+melanogaster+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">Microbiomes as modulators of Drosophila melanogaster homeostasis and disease.</a> Current Opinion in Insect Science. 39, 84-90 (2020).</li>
<li>Grenier, T., Leulier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+commensal+microbes+shape+the+physiology+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Insect+Science%22%5BJournal%5D)">How commensal microbes shape the physiology of Drosophila melanogaster.</a> Current Opinion in Insect Science. 41, 92-99 (2020).</li>
<li>Broderick, N. A., Lemaitre, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut-associated+microbes+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Gut+Microbes%22%5BJournal%5D)">Gut-associated microbes of Drosophila melanogaster.</a> Gut Microbes. 3 (4), 307-321 (2012).</li>
<li>Tkacz, A., Hortala, M., Poole, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Absolute+quantitation+of+microbiota+abundance+in+environmental+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">Absolute quantitation of microbiota abundance in environmental samples.</a> Microbiome. 6 (1), 110(2018).</li>
<li>Téfit, M. A., Gillet, B., Joncour, P., Hughes, S., Leulier, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+association+of+a+Drosophila-derived+microbiota+with+its+animal+partner+and+the+nutritional+environment+throughout+a+fly+population%27s+life+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Insect+Physiology%22%5BJournal%5D)">Stable association of a Drosophila-derived microbiota with its animal partner and the nutritional environment throughout a fly population's life cycle.</a> Journal of Insect Physiology. 106, 2-12 (2017).</li>
<li>Ryu, J. -H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Innate+immune+homeostasis+by+the+homeobox+gene+caudal+and+commensal-gut+mutualism+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila.</a> Science. 319 (5864), 777-782 (2008).</li>
<li>Sieuwerts, S., De Bok, F. A. M., Mols, E., De Vos, W. M., Van Hylckama Vlieg, J. E. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+and+fast+method+for+determining+colony+forming+units%5BTitle%5D)+AND+%22Letters+in+Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A simple and fast method for determining colony forming units.</a> Letters in Applied Microbiology. 47 (4), 275-278 (2008).</li>
<li>Eckburg, P. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+of+the+human+intestinal+microbial+flora%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Diversity of the human intestinal microbial flora.</a> Science. 308 (5728), 1635-1638 (2005).</li>
<li>Newell, P. D., Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interspecies+interactions+determine+the+impact+of+the+gut+microbiota+on+nutrient+allocation+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Interspecies interactions determine the impact of the gut microbiota on nutrient allocation in Drosophila melanogaster.</a> Applied and Environmental Microbiology. 80 (2), 788-796 (2013).</li>
<li>Costello, E. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+community+variation+in+human+body+habitats+across+space+and+time%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial community variation in human body habitats across space and time.</a> Science. 326 (5960), 1694-1697 (2009).</li>
<li>Fadrosh, D. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+dual-indexing+approach+for+multiplexed+16S+rRNA+gene+sequencing+on+the+Illumina+MiSeq+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiome%22%5BJournal%5D)">An improved dual-indexing approach for multiplexed 16S rRNA gene sequencing on the Illumina MiSeq platform.</a> Microbiome. 2 (1), 6(2014).</li>
<li>Vega, N. M., Ludington, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+a+parts+list+to+assembly+instructions+and+an+operating+manual%3A+How+small+host+models+can+re-write+microbiome+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">From a parts list to assembly instructions and an operating manual: How small host models can re-write microbiome theory.</a> Current Opinion in Microbiology. 64, 146-151 (2021).</li>
<li>Samuel, B. S., Rowedder, H., Braendle, C., Félix, M. -A., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+responses+to+bacteria+from+its+natural+habitats%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans responses to bacteria from its natural habitats.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (27), 3941-3949 (2016).</li>
<li>Berg, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+the+Caenorhabditis+elegans+gut+microbiota+from+diverse+soil+microbial+environments%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">Assembly of the Caenorhabditis elegans gut microbiota from diverse soil microbial environments.</a> The ISME Journal. 10, 1998-2009 (2016).</li>
<li>Sundarraman, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-order+interactions+dampen+pairwise+competition+in+the+zebrafish+gut+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Higher-order interactions dampen pairwise competition in the zebrafish gut microbiome.</a> mBio. 11 (5), 1-15 (2020).</li>
<li>Douglas, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+animal+models+for+microbiome+research%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Simple animal models for microbiome research.</a> Nature Reviews Microbiology. 17, 764-775 (2019).</li>
<li>Friedman, J., Higgins, L. M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Community+structure+follows+simple+assembly+rules+in+microbial+microcosms%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Ecology+%26+Evolution%22%5BJournal%5D)">Community structure follows simple assembly rules in microbial microcosms.</a> Nature Ecology & Evolution. 1, 0109(2017).</li>
<li>Gilchrist, J. E., Campbell, J. E., Donnelly, C. B., Peeler, J. T., Delaney, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spiral+plate+method+for+bacterial+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Spiral plate method for bacterial determination.</a> Applied Microbiology. 25 (2), 244-252 (1973).</li>
<li>Thomas, P., Sekhar, A. C., Upreti, R., Mujawar, M. M., Pasha, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+single+plate-serial+dilution+spotting+%28SP-SDS%29+with+sample+anchoring+as+an+assured+method+for+bacterial+and+yeast+cfu+enumeration+and+single+colony+isolation+from+diverse+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+Reports%22%5BJournal%5D)">Optimization of single plate-serial dilution spotting (SP-SDS) with sample anchoring as an assured method for bacterial and yeast cfu enumeration and single colony isolation from diverse samples.</a> Biotechnology Reports. 8, 45-55 (2015).</li>
<li>Nuñez, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Low+cost+and+open+source+multi-fluorescence+imaging+system+for+teaching+and+research+in+biology+and+bioengineering%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Low cost and open source multi-fluorescence imaging system for teaching and research in biology and bioengineering.</a> PLoS One. 12 (11), 0187163(2017).</li>
<li>Putman, M., Burton, R., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+method+to+automatically+count+bacterial+colony+forming+unit%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">Simplified method to automatically count bacterial colony forming unit.</a> Journal of Immunological Methods. 302 (1-2), 99-102 (2005).</li>
<li>Ashburner, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aAshburner%2C+M+%22Drosophila.+A+Laboratory+Handbook%22">Drosophila. A Laboratory Handbook</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1989).</li>
<li>Dodge, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gut+commensal+niche+regulates+stable+association+of+a+multispecies+microbiota%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">A gut commensal niche regulates stable association of a multispecies microbiota.</a> bioRxiv. , (2021).</li>
<li>Obadia, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probabilistic+invasion+underlies+natural+gut+microbiome+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Probabilistic invasion underlies natural gut microbiome stability.</a> Current Biology. 27 (13), 1999-2006 (2017).</li>
<li>Vega, N. M., Gore, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochastic+assembly+produces+heterogeneous+communities+in+the+Caenorhabditis+elegans+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Stochastic assembly produces heterogeneous communities in the Caenorhabditis elegans intestine.</a> PLoS Biology. 15 (3), 2000633(2017).</li>
<li>Jaime, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+high-throughput+WAFFL+system+for+treating+and+monitoring+individual+Drosophila+melanogaster+adults%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">The high-throughput WAFFL system for treating and monitoring individual Drosophila melanogaster adults.</a> bioRxiv. , (2018).</li>
<li>Ren, C., Webster, P., Finkel, S. E., Tower, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increased+internal+and+external+bacterial+load+during+Drosophila+aging+without+life-span+trade-off%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Increased internal and external bacterial load during Drosophila aging without life-span trade-off.</a> Cell Metabolism. 6 (2), 144-152 (2007).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הטכניקות המפורטות המוצגות כאן מאפשרות גידול של פי >100 במספר הדגימות שניתן להעריך בניסוי ספירת CFU. טכניקה זו מקדמת שיטות קיימות לניסויים במיקרוביום בדרוזופילה 12,35,36 על ידי שימוש בפורמט של צלחת 96 בארות כדי לבחון זבובים בודדים. יתר על כן, הוא מיישם שיטת ציפוי ספוטיעילה יותר 19,31 וזרימת עבודה אוטומטית עם פלטפורמת צילום וספירת מושבות. המשמעות של שיטה זו עבור Drosophila היא סטנדרטיזציה של ניסויים לפורמט לוח 96 באר, המאפשר טיפול בו זמנית של מספר רב של שכפולים ביולוגיים עם אוטומציה כדי להשיג כימות תפוקה גבוהה של CFUs.
פלטפורמת 96 הקידוחים מראה שתדירות מוגברת של העברה ו"ניקוי" של חיידקים חולפים גורמת להפחתה משמעותית הן בשפע הממוצע והן בשונות בין הדגימות (איור 1B,C), מה שמדגים את ההקפדה של פרוטוקול משופר זה. מגבלה אחת של שיכון משותף של זבובים היא העברה אופקית של חיידקים בין זבובים. הפתרון המוצע הוא לשמור על זבובים בנפרד בפורמט של 96 בארות, כגון כל האכלת בעלי חיים שטוחה38.
למרות שלא נצפתה ירידה משמעותית בעומס החיידקים כאשר זבובים נשטפו באתנול, זבובים אלה נשמרו רק בנוכחות חיידקים חיצוניים במשך 3 ימים. דיור לפרקי זמן ארוכים יותר יכול לאפשר עומס חיידקים גדול יותר לצבור39. לכן, כביסה באתנול עדיין מומלץ.
העברת זבובים לתוך לוח 96 בארות היא הצעד הראשון הקריטי להגדרת זרימת העבודה (איור 1A). לאחר שהזבובים נשטפים, הם מופצים לבארות בזה אחר זה. תרשים לוחות שימושי בשלב זה כדי לציין אילו תנאים קיימים בכל באר ולהוסיף הערות כגון "הזבוב אבד". הומוגניזציה היא צעד קריטי נוסף עם כמה אזהרות חשובות. חיידקים שורדים את תהליך ההומוגניזציה כשהם נמצאים בנוכחות זבוב (איור 1D,E), וככל הנראה העיקרון הזה נכון גם כשהחיידקים נמצאים בתוך המעיים של הזבוב. עם זאת, חיידקים מומתים גם כאשר הם הומוגניים בצלחות מקציף חרוזים בלבד, מה שמוכיח כי ההומוגניזציה יכולה להרוג את תאי החיידקים בנסיבות מסוימות, מגבלה שעשויה להיות חשובה אם מדובר בהומוגניות של מעיים מנותחים, למשל. יש לציין כי אובדן יחידות ה-CFU בעת הומוגניזציה תלוי במספר יחידות ה-CFU במדגם, וההפסד הוא מינימלי כאשר משתמשים ב~105 יחידות יוצרות מושבה לכל באר. ניתן להשיג שימור נוסף של יחידות יוצרות מושבה על ידי עצירת הומוגניזציה באמצע הדרך וקירור הצלחת על קרח.
הומוגניזציה בוצעה במשך 5 דקות בפרוטוקול זה בהתבסס על ניסויי בקרה שבהם מספר ידוע של יחידות יוצרות מושבה עורבבו עם זבוב נטול חיידקים, וזה עבד באופן אמפירי עבור חיידקי זבובים. פחות מכות גרמו לנוכחות חלקי זבוב גדולים יותר, מה שמפריע לפיפטות, בעוד שזמני הומוגניזציה ארוכים משמעותית של ~ 10 דקות הפכו את ספירת ה- CFU למשתנה יותר. הנפח הקטן יותר והצורה הזוויתית של בארות צלחת חרוטית נצפו כדי להפחית את היעילות של מכות חרוזים בהשוואה צינורות גליליים 2 מ"ל. וריאציות רבות על גישה כללית זו אפשריות, כולל אילו זני חיידקים, איזה מיכל מכות חרוזים, אילו חרוזים, ואיזה גנוטיפ זבוב משמשים. מקרי משתמש בודדים צריכים להשתמש בפקדים חיוביים כדי לבסס את הגישה שלהם.
שיטת הציפוי הנקודתי הופעלה באופן ספציפי: דילולים של 1:2 של L. plantarum WF ב- PBS זוהו על לוחות MRS והודגרו בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך יומיים (ניתן ליישם זמני דגירה קצרים יותר כדי ליצור גדלי מושבות קטנים יותר). השיטה דורשת השקעה מסוימת מראש בציוד, בעיקר מקציף החרוזים והפיפטור בעל 96 הערוצים (איור 2A), הנחוץ הן לסדרת הדילול והן לציפוי הנקודתי. עם זאת, קיימות אפשרויות זולות יותר, כולל משכפל לוחות 96 באר עם פינים מחורצים. סדרת הדילול היא שלב קריטי המשפיע על הדיוק של תוצאות ספירת CFU. מבחינת מצבי כשל, ניתן לסתום את קצות הפיפטה עם חלקי זבוב או חרוזי זכוכית ועל קצות הפיפטה לא לאטום כראוי על הפיפטור או להיכשל מסיבה אחרת. כל הבעיות הללו גורמות למספר חסר של הבארות המושפעות ויש לעקוב אחריהן. ערבוב הולם בכל שלב בסדרת הדילול הוא גם חיוני. כל דילול צריך להיות מעורבב ביסודיות או על ידי הנחת הצלחת על שייקר צלחת או על ידי pipetting למעלה ולמטה 15-20 פעמים, אשר משמש גם לשטוף את הקצוות. על ידי איתור מהצלחת המדוללת ביותר לצלחת המדוללת ביותר, ניתן לעשות שימוש חוזר בקצוות עבור כל סדרת הדילול. עם דילולים של 1:2, הספירה מדויקת על פני טווח של 2-25 מושבות, המשתרעות על סדר גודל (איור 2C). לכן, דילולים של 1:10 חוסכים זמן וחומרים. משתנה נוסף שניתן לנצל הוא זמן הדגירה, אשר ניתן להתאים כדי לייצר מושבות קטנות יותר, ובכך להגדיל את טווח הנקודות הניתנות לספירה על ידי מניעת מיזוג של מושבות סמוכות.
תמונה איכותית של הצלחת היא חיונית מכיוון שהיא הופכת לנתוני המקור הגולמיים שמהם מנותחים ה- CFUs וניתן לאחסן אותם בארכיון ללא הגבלת זמן. ה- FluoroBox נועד להפיק תמונות של הלוחות בעוצמת אור אחידה, הממזערת את הבוהק על משטח האגר. בנוסף, העיצוב מסוגל לצלם באופן סלקטיבי מושבות פלואורסצנטיות באמצעות נורות LED בצבע יחיד ומסנני תמונות צבעוניים (איור 3A). בניית מערך כמו FluoroBox, עם הגדרות תאורה ומצלמה מבוקרות, יכולה להגדיל מאוד את יכולת השחזור של תמונות CFU, החשובות לניתוח אוטומטי. מורפולוגיות של מושבות, עוצמת פלואורסצנטיות והשפעות הזמן או הצפיפות על צמיחת המושבה הן רק כמה מהתכונות שניתן לנתח באמצעות התצלומים. ניתן לבנות את תיבת התמונות ללא מסנני הצבע ונורות בצבע יחיד אם לא נעשה שימוש בחיידקים פלואורסצנטיים, מה שמפחית את העלות והמורכבות. אורות עירור ומסנני פליטה שונים יכולים להיות מוחלפים לאלה המומלצים כאן אם פלואורופור אחר משמש מעבדה. מצלמה המחוברת לטאבלט באמצעות WiFi באמצעות אפליקציה שימושית הן עבור תכונת התריס האוטומטי למניעת רעידות והן עבור העברת נתונים קלה. ניתן להעביר תמונות לטאבלט ולאחר מכן למחשב נייד באמצעות תוכנת העברת קבצים אלחוטית. מצלמות מומלצות עם יכולות אלה מצוינות בטבלת החומרים.
Count-On-It הוא תוסף שנכתב ב-ImageJ. תוכנת ספירת CFU האוטומטית מפלחת את תמונת הלוח לרשת אחידה של 96 בארות, סופרת את המושבות בכל תא רשת ומאצוות את התוצאות לגיליון אלקטרוני פשוט. מכיוון שתמיד יש שונות במיקום של רשת הספוט על הצלחת ובתמונה, על המשתמש להתאים ידנית את הרשת לתמונה באמצעות התוסף Croptacular. זה גם עוזר לא לכלול אזורים ליד קצה הצלחת, אשר יש בוהק. קביעת הסף היא המפתח לקבלת ספירת CFU המדויקת ביותר מהתמונה. אם הסף נקבע גבוה מדי, המושבות יתמזגו; אם הסף נקבע נמוך מדי, המושבות לא ייכללו. לאחר קביעת הסף, המאקרו מחיל טשטוש גאוס כדי לרכך את הקצוות ולהקטין את הכינוי, מסנן קו פרשת המים מחלק מושבות חופפות, והכתמים נספרים באמצעות חלקיקי ניתוח. 
לפעמים, צפיפות המושבות גבוהה מדי במקום מסוים. Count-On-It מספק דרך להתמודד עם זה. כדי להעריך את מספר המושבות בתא רשת עם מושבות ממוזגות חלקית, ראשית השטח הממוצע של גוש עגול מכל הלוח נלקח כממוצע C. לאחר מכן, השטח של כתם A 1 מחולק בשטח הממוצע של כתם עגול A1/Cממוצע. מספר זה מעוגל למספר השלם הקרוב ביותר, וזהו האומדן עבור מספר המושבות הנמצאות בכתם. פונקציה זו היא אחת הסיבות לכך שהסף יכול להשפיע על תוצאות הספירה: שטח המושבה הממוצע היחסי לעומת אזור הכתמים הממוזג יהיה שונה בהתאם לאופן שבו הסף השפיע על כתמים ממוזגים.
לשיטות המוצגות יש מספר מגבלות. אלה כוללים את הצורך בציוד להוצאת מדיה נוזלית במדויק מלוחות 96 באר. ציוד זה, או פיפטור 96 ערוצים או כלי פין משכפל מחורץ, יכול לעלות אלפי דולרים להשיג. קיימות חלופות זולות יותר אך הן פחות מדויקות. ספירה אוטומטית באמצעות Count-On-It מציגה גם כמה מגבלות. לדוגמה, אם שני סוגי מושבות באוכלוסייה מעורבת היו מופרדים על סמך גודל בלבד, ספירת כתמים לא תוכל להקצות מושבות לסוג הנכון. במקרה זה, כתמים עם כתמים יהיה צורך לחסל מן הספירות. הבחנה נוספת של מושבות על בסיס מורפולוגיה תהיה הרחבה רבת ערך של השיטה שאינה מיושמת כיום. השימוש במדיה סלקטיבית הכוללת חומרים מזינים ספציפיים לזן ואנטיביוטיקה מפשט את הצורך בניתוח תמונה מורכב.
קיום ניסויים של זבוב הפירות בלוחות של 96 בארות מכפיל את מספר הדגימות והתנאים שניתן לבדוק בניסוי יחיד ויכול להקל על מסכי תפוקה גבוהה בפנוטיפים של קשר דרוזופילה-חיידקים. אנו מדמיינים שניתן להרחיב שיטה זו על ידי שימוש במדיה סלקטיבית כדי להבדיל בין זני חיידקים רבים בתערובות מורכבות. השיטה אינה מוגבלת לחקר המיקרוביום של הזבוב. כימות של יחידות יוצרות מושבה נפוץ ביישומים רבים של מיקרוביולוגיה, החל מספירות קוליפורמים במי שתייה וכלה בזיהוי פתוגנים. מערכת ציפוי CFU המוצגת כאן מאפשרת מסכים בתפוקה גבוהה, כמו גם רכישה, עיבוד, אחסון ואספקה אוטומטיים של תוצאות.

הקשר בין המיקרוביוטה של המעיים לבין בעלי החיים המארחים שלהם נמצא יותר ויותר בחזית המחקרים הביולוגיים1, המראים כי הרכב המתח של המיקרוביום חשוב לפיזיולוגיה של המארח 2,3,4. קצב הגילוי הוגבל על ידי גורמים מבלבלים כגון שונות טבעית גבוהה בין אינדיבידואלים ומגוון גבוה של חיידקים מתיישבים 5,6,7. זבוב הפירות, Drosophila melanogaster, התגלה כמודל מבטיח בזכות המיקרוביום בעל המגוון הנמוך הטבעי שלו, קלות הטיפול והגנטיקה החזקה של המארח 8,9,10,11. זבובים יכולים להיות נקיים מחיידקים ולשייך אותם מחדש למיקרוביוטה12 מוגדרת, והוכח כי הפלורה משפיעה על התכונות הפיזיולוגיות של הזבובים13,14. הפלורה המולדת מורכבת מקבוצה מוגבלת של חיידקים שכולם ניתנים לתרבות, וקרובי משפחה של אלה הם גם אנדוגניים למעיים של יונקים, כולל לקטובצילי, פרוטאובקטריה ואנטרוקוצ'י15.
חקר השפעת המיקרוביום על תכונות הפונדקאי דורש כימות של המיקרוביום הן מבחינת המינים הקיימים והן מבחינת השפע המוחלט שלהם16. הדרכים השולטות לניתוח המיקרוביום של הזבובים הן יחידות יוצרות מושבה (CFU) ספירות17, 16S rRNA גן אמפליקון9, ו- qPCR של הגן 16S rRNA18. ניתן להשיג ספירות CFU ללא ריאגנטים יקרים, והם מאשרים את הכדאיות של תאי החיידקים19. לטכניקות 16S הכוללות qPCR יש יתרונות בכך שניתן לברר זהויות טקסונומיות של מיקרובים ללא התחשבות בדרישות הגידול שלהם או במורפולוגיות של מושבות20.
במקרה שבו ניסויים משתמשים בזבובים עם מיקרוביום מוגדר של חיידקים ידועים (זבובים גנוטוביוטיים), לספירת CFU יש יתרונות מיוחדים על פני ריצוף21. ריצוף הוא יקר, ודורש מיצוי דנ"א, הכנת ספרייה מבוססת PCR וריצוף בתפוקה גבוהה כדי להשיג שפע יחסי22. בשל העלות הגבוהה, בדרך כלל יש לבצע שיטות ריצוף בתפוקה גבוהה בכמויות גדולות כדי להפחית את המחיר למדגם23. שיטות נוספות כגון qPCR נדרשות כדי להשיג שפע מוחלט16. לעומת זאת, ספירות CFU הן מהירות וזולות ונותנות את המספרים המוחלטים של תאים בני קיימא. Drosophila8 ומודלים אחרים של מיקרוביום קטן24, כולל התולעת, Caenorhabditis elegans 25,26, ודג הזברה הזחלי, Danio rerio, שגדל באופן גנוטוביוטי27, יש מגוון מוגבל של חיידקים, אשר ידועים מאפייני גדילה28. במקרים אלה, במיוחד עם בעלי חיים גנוטובוטיים, ספירת CFU יכולה להבדיל בין כל מיני החיידקים בתוך קהילות המעיים הרב-מיניות21,27,29. שיטות ספירת CFU בתפוקה גבוהה יותר ישפרו עוד יותר את העלות-תועלת והמהירות של מדידת הרכב המיקרוביום, וניתן יהיה ליישם אותן בניסויים רבים אחרים במיקרוביולוגיה.
ספירת CFUs על ידי ציפוי דילול סדרתי של תרחיף חיידקים על מדיית גידול מבוססת אגר היא שיטה סטנדרטית בכל תחום המיקרוביולוגיה. המושבות שגדלות על הלוחות נספרות ידנית. הדילולים מאפשרים לחוקר לבחור צפיפות מושבות הניתנת לספירה (למשל, ~100 יחידות יוצרות מושבה לכל צלחת), כלומר המושבות אינן גדלות זו לזו וניתן לספור אותן בפרק זמן סביר. רוב המיקרוביולוגים משתמשים למעשה באותה שיטת ספירת CFU שפותחה לפני 140 שנה במעבדתו של רוברט קוך, ועבור יישומים רבים, שיטה זו עדיין מספקת. עם זאת, מתעוררת בעיה כאשר מבקשים לכמת מספר רב של דגימות. דגימה בודדת עשויה לדרוש ציפוי של 1 עד 10 דילולים סדרתיים של הדגימה כדי לקבל יחידות CFU הניתנות לספירה, כך שניסויים הכוללים יותר מכמה עשרות דגימות הופכים למיסוי. שיטות שונות פותחו כדי להגביר את היעילות של ספירת CFU. ציפוי ספירלי אוטומטי מבטל את הצורך בדילולים סדרתיים30, מה שהופך רק צלחת אחת לנחוצה לספירת CFU אך מגדיל את הזמן לצלחת הדגימה. זיהוי דילול טורי של צלחת יחידה (SP-SDS) מאפשר הערכות CFU מפחות צלחות לכלדגימה 31. שיטות אלה מהוות שיפור בשיטת ציפוי ההתפשטות המסורתית, אך עדיין דורשות טיפול וציפוי של דגימות חיידקים בנפרד ולכן אינן אידיאליות לתפוקה גבוהה. טיפול בדגימות בלוחות 96 בארות וציפוי ספוט של אותן 96 דגימות על לוחות אגר מלבניים משפר מאוד את התפוקה של דגימות19.
מיקרוביום מורכב בדרך כלל ממספר זנים ומינים. בעוד שלעתים קרובות ניתן להבחין בין מינים על ידי מורפולוגיה של מושבות או אמצעי גדילה, ניתן להשתמש בפלואורסצנציה כדי להבחין עוד יותר בין סוגים שונים של חיידקים ותכונות הגדילה שלהם32. לדוגמה, גנוטיפים שונים של אותו המין יכולים להיות מסומנים בחלבונים פלואורסצנטיים שונים המקודדים גנטית. שיטות הדמיית לוחות המשלבות פלואורסצנציה מאפשרות לחוקרים לנצל את הטכניקות הגנטיות הללו במבחנים מבוססי CFU32. שילוב פלואורסצנטיות בשיטות ספירת CFU בתפוקה גבוהה ישפר עוד יותר את התועלת שלהן.
ספירת CFUs באופן ידני הופכת מסורבלת כאשר יש מספר רב של דגימות. ספירה אוטומטית של CFUs יכולה להתבצע על ידי צילום הצלחת ועיבוד התמונה באמצעות תוכנה מיוחדת33. Sieuwerts et al. שילבו את יעילות הציפוי המשופרת של ציפוי נקודתי עם ספירת מושבות אוטומטית באמצעות צילום דיגיטלי קונבנציונלי ותוכנת ImageJ19.
שיטה בעלת תפוקה גבוהה לסינון הפנוטיפים של מיקרובים ספציפיים ואגודות מארחות תסייע למחקרים על התכנסות קהילת המיקרוביום וההשפעה על בריאות המארח וכושרו. לצורך מחקרים במיקרוביום דרוזופילה , פלטפורמה מיקרוביולוגית בעלת תפוקה גבוהה תשלב טיפול בדגימות זבובים בפורמט של 96 לוחות, תזה של זבובים ללא תזה חיידקית, יעילות של ציפוי נקודתי, היכולת להשתמש בפלואורסצנטיות ולהבחין בין פלואורופורים מרובים, סביבת אור מבוקרת להדמיה ניתנת לשחזור של לוחות CFU, ותוכנה אוטומטית אמינה לספירת מושבות. מאמר זה מתאר שיטה הממוטבת לבדיקה של יחידות יוצרות מושבה בזבובים גנוטוביוטיים, שהיא פשוטה, מהירה ואוטומטית. פרוטוקול זה מתווה זרימת עבודה חדשנית המשלבת את מיטב השיטות שפורסמו בעבר וממוטבת לחקר מיקרוביום המעי בדרוזופילה.

<table><tbody><tr><td><חזק>מכות חרוזים וציפוי נקודתי</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>בקבוקוני זבוב</td><td>Genesee</td><td>32-121</td> פקקי בקבוקון <td>זבוב הניתנים לחיטוי</td></tr><tr><td></td><td>Genesee</td><td>59-201</td> מוליך ידני <td>הניתן לחיטוי</td></tr><tr><td></td><td>3M</td><td>3M PA1</td><td></td></tr><tr><td>אוטם חום</td><td>Eppendorf</td><td>5390</td><td></td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater 96</td><td>BioSpec</td><td>1001</td><td></td></tr><tr><td>Mini-BeadBeater חרוזי טחינת זכוכית, 0.5 מ"מ</td><td>BioSpec&nbsp;</td><td></td><td></td>11079105</tr><tr><td>MPS 1000 מיני PCR צלחת ספינר</td><td>Labnet</td><td>LI-CF-P1000</td><td></td></tr><tr><td>Rainin BenchSmart 96 פיפטור חצי אוטומטי</td><td>מטלר טולדו</td><td>30296705</td><td>אפשרויות פחות יקרות זמינות, כולל כלי סיכה 96 באר מחורץ מ- VP Scientific</td></tr><tr><td>TempPlate חצי חצאית 96 באר PCR צלחת, חצאית ישרה, טבעי</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>1402-9220</td><td>חייב להיות פוליפרופילן לאוטם חום</td></tr><tr><td>רדיד אטם חום בונד תרמי</td><td>4titude 4tiude</td><td>4ti-0591</td><td>שמור על</td></tr><tr><td>צלחת מגש סטרילית, 128 x 85 מ"מ, פוליסטירן, סטרילי</td><td>SPL מדעי החיים</td><td>31001</td><td>להכנת לוחות אגר מלבניים</td></tr> <tr><td><חזקים>בניית פוטובוקס</חזקים></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&frac14; "-20 X ו-frac12; &rdquo; ברגים (X2)</td> <td>Amazon</td><td>ASIN: B07BP1WR3H</td><td>כדי לחבר את תושבת המצלמה. מותג לא חשוב. כל בורג 1/4 "-20 1/2" עובד.</td></tr><tr><td>&frac14; "-20 x &frac12; &rdquo; אום מחבר&nbsp;</td><td>UPC של אמזון</td><td>: 799862376780</td><td>AKA אום מכסה או בורג מחבר. זה מיועד לחיבור הגומיות על מחזיק הצלחת. מותג לא חשוב.</td></tr><tr><td>&frac14; "-20 x &frac34; &rdquo; ברגים (X3)</td> <td>אמזון</td><td>ASIN: B003QZSZY4</td><td>למחזיק הצלחת. מותג לא חשוב.</td></tr><tr><td>1/8 אינץ' x &frac12; &rdquo; מכונת כביסה</td><td></td><td>Amazon UPC: מכונת</td><td>כביסה 611982484599 לאומי הכובע מחוץ לקופסה. מותג לא חשוב. ריסוס צבע שחור לפני החיבור למיזוג עם האקריליק.</td></tr><tr><td><חזק>18 חוט מד </חזק> - חוט חשמל שני מוליכים - חוט חשמל <חזק>18 AWG &ndash; 10ft</חזק></td><td>Superbrightleds.com</td><td>WP18-2</td><td></td></tr><tr><td>22-10 AWG אגוז חוט אדום - WN-R2210 &ndash; <חזק>כמות 4</חזק></td><td>Superbrightleds.com</td><td>WN-R2210</td><td></td></tr><tr><td>22-18 AWG 3/16 אינץ' מחבר דחיפה נקבה - 22-18 AWG &ndash; <חזק>כמות 3</חזק></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SCFP-2218</td><td></td></tr><tr><td>4 אינץ' מחבר מגשר מהדק ללא הלחמה - 8 מ"מ נורות רצועת LED בצבע יחיד - <חזק>כמות 3</חזק></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-2</td><td></td></tr><tr><td>4 אינץ' מתאם צמה ללא הלחמה - 8 מ"מ נורות רצועת LED בצבע יחיד&ndash; <חזק>כמות 3</חזק></td><td>Superbrightleds.com</td><td>SBL-MA2P-8-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ידית מגירה בגודל 6 אינץ'</td><td>אמזון</td><td>ASIN: B07Z331P99</td><td>כל ידית מגירה צריכה לעבוד.</td></tr><tr><td>6 אינץ' מגלשות מגירה</td><td>Btibpse</td><td>UPC: 712243424979</td><td>חתוך את פקקי הגומי הרכים במחווני המגירות.</td></tr><tr><td>8-32 x ו-frac12; &rdquo; אגוזי כובע (x4)</td> <td>Amazon</td><td>ASIN: B00HYLZB98</td><td>מחבר ברגי החלקה למגירה מחוץ לקופסה. מותג לא חשוב. ניילון לא יפגע באקריליק. ריסוס צבע שחור לפני החיבור למיזוג עם האקריליק.</td></tr><tr><td>8-32 x ו-frac12; &rdquo; ברגי ניילון (x4)</td> <td>Amazon</td><td>ASIN: B07KX9T7NF</td><td>לחיבור שקופיות מגירה. מותג לא חשוב. כל בורג או בורג מכונה העומדים במפרט עובד. ניילון לא יפגע באקריליק ומאפשר לך לחתוך את הבורג עם האום. ריסוס צבע שחור לפני החיבור למיזוג עם האקריליק.</td></tr><tr><td>דבק אקרילי</td><td>SCIGRIP</td><td>Ean: 7844908489337</td><td>SCIGRIP Weld-On #4 דבק, חצי ליטר ובקבוק מוליך מרותך עם</td></tr><tr><td>אזיקוני כבלים שחורים מחט - 10 חבילות - באורך 4 אינץ'&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>CT-B04-10</td><td></td></tr><tr><td>מצלמה L-Bracket</td><td>WLPREOE, Vikerer, ASIN לא ממותג</td><td>: B09X46YKQZ</td><td>יש "להפוך" את התושבת מהתצורה המיועדת שלה כך שהמצלמה תהיה "בחוץ" של ה-L. חלק מהסוגריים מגיעים בשני חלקים ומאפשרים את התצורה החלופית הזו, חלקם לא, תזדקק לאחד שניתן להפוך. כמו כן צריכים להיות חורים בגודל 1/4 אינץ' לחיבור. WLPREOE, Vikerer, לא ממותג. מספר זיהוי סידורי של אמזון ניתן כדוגמה.</td></tr><tr><td>מצלמה מסדרת Canon T לאפשרות קשירה או</td><td>Canon, Panasonic, Sony, Nikon וכו'.</td><td>1894C002</td><td>המצלמות מסדרת Canon Ti הן אופציה טובה ויכולות להתחבר למחשב. השתמש עם עדשת הערכה הסטנדרטית 18-55 מ"מ. אפשרויות משומשות מומלצות מ-Canon T5 עד T7 (הדגם הנוכחי).</td></tr><tr><td>אורך מותאם אישית צבע יחיד LED רצועת אור - Eco Series סרט אור - 24V - IP20 - 250 lm/ft - כחול - 2 מטר</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BBLU-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>אורך מותאם אישית צבע יחיד רצועת LED אור - Eco Series סרט אור - 24V - IP20 - 250 lm/ft - ירוק &ndash; 2 מטר</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-BGRE-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>אורך מותאם אישית רצועת LED בצבע יחיד - אור קלטת מסדרת Eco - 24V - IP20 - 250 lm/ft - לבן טבעי 4000K &ndash; 2 מטר&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>STN-A40K80-B6A-08C1M-24V</td><td></td></tr><tr><td>מקדחה עם &frac14; ", 1/8" מקדחים</td><td>שחור & Decker</td><td>&lrm; BDCDD12PK</td><td>המותג לא חשוב.&nbsp;</td></tr><tr><td>ספריי צבע שחור שטוח, &nbsp; 2X Ultra-Matte</td><td>Rustoleum</td><td>331182</td><td>לצבוע את החלק הפנימי של הכל שחור שטוח. מותג לא חשוב.</td></tr><tr><td>קירות אקריליק בחיתוך לייזר</td><td>מסור כחול גדול</td><td>www.bigbluesaw.com</td><td>השתמש ב-PDF המצורף, מחק את כל הגזרות בחלק העליון למעט החור הרצוי למצלמה&nbsp;</td></tr><tr><td>ספק כוח מיתוג LED Mean Well - סדרת LPV 20-100W ספק כוח LED עם יציאה יחידה - 24V DC - 20 וואט&nbsp;</td><td>Superbrightleds.com</td><td>LPV-20-24</td><td></td></tr><tr><td>Panasonic ZS100 לחיבור wifi לטלפון, טאבלט או מחשב</td><td>Canon, Panasonic, Sony, Nikon וכו'.</td>ניתן לחבר באופן אלחוטי מצלמות <td>Panasonic DMC-ZS100K</td><td>למחשב להעברת נתונים ואפשרויות תריס מרחוק. אפשרויות משומשות טובות.</td></tr><tr><td>צלחת שחרור מהיר</td><td>Neewer אלומיניום 50 מ"מ צלחת שחרור מהיר QR Clamp 3/8 אינץ' עם 1/4 אינץ'</td><td>ASIN: B07417F21D</td><td>הוסף את זה לתושבת כך שניתן יהיה להסיר את המצלמה בקלות להחלפת מסנני צבע. מספר זיהוי סידורי של אמזון ניתן כדוגמה.</td></tr><tr><td>גומיות, גדלים שונים</td><td>BAZIC Products</td><td>Alliance Rubber 26649</td><td>גומיות עוברות על מחזיק הצלחת. מותג לא חשוב.</td></tr><tr><td>בסיסי הרכבה לקשירת כבל בורג/דבק - בסיס 3/4 אינץ' &ndash; <חזק>כמות 4</חזק></td><td>Superbrightleds.com</td> מתג נדנדה עגול <td>CTMB-20</td><td></td></tr><tr><td>SPST - ללא LED &ndash; <חזק>כמות 3</חזק>Superbrightleds.com</td><td></td> <td>מסנן RRS-SP</td><td></td></tr><tr><td>Tiffen 29 (אדום) 72 מ"מ&nbsp;</td><td>מסנן Tiffen</td><td>72R29</td><td></td></tr><tr><td>Tiffen 58 (ירוק) 72 מ"מ</td><td>Tiffen</td><td>7258</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ64</td><td>https://imagej.net/downloads</td><td>ללא N/A</td><td>. רק צטט: Schindelin, J., Arganda-Carreras, I., Frise, E., Kaynig, V., Longair, M., Pietzsch, T., &hellip; קרדונה, א' (2012). פיג'י: פלטפורמת קוד פתוח לניתוח תמונות ביולוגיות. שיטות טבע, 9(7), 676&ndash;682. doi:10.1038/nmeth.2019</td></tr><tr><td>MacOSX</td><td>Apple</td><td>N/A</td><td>יש תכונת שינוי שם אצווה שימושית ב-Finder כדי לשנות שם של קבוצת תמונות כדי להקל על הארגון והניתוח ב-Count-on-it.</td></tr><tr><td>Unix</td><td>BSD</td><td>N/A</td><td>64 סיביות</td></tr><tr><td>Windows</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>64 סיביות</td></tr></tbody></table>

ספירת יחידות יוצרות מושבה מהירה בתבנית צלחת 96 בארות המיושמת על מיקרוביום הדרוזופילה

Fast Colony Forming Unit Counting in 96-Well Plate Format Applied to the Drosophila Microbiome

המעיים של בעלי חיים מיושבים על ידי מיקרובים קומנסליים, שמשפיעים על התפתחות המארח, בריאותם והתנהגותם. כימות מדויק של הקולוניזציה חיוני לחקר יחסי הגומלין המורכבים בין המארח למיקרוב הן כדי לאמת את ההרכב המיקרוביאלי והן כדי לחקור את השפעותיו. Drosophila melanogaster, בעל מגוון מיקרוביאלי מקומי נמוך וחסכוני לגידול עם הרכב מיקרוביאלי מוגדר, התגלה כאורגניזם מודל לחקר המיקרוביום של המעיים. ניתוח המיקרוביום של אורגניזם בודד דורש זיהוי של אילו מינים מיקרוביאליים נמצאים וכימות השפע המוחלט שלהם. מאמר זה מציג שיטה לניתוח של מספר רב של מיקרוביום זבוב בודד. הזבובים מוכנים בלוחות של 96 בארות, מה שמאפשר לטפל במספר רב של דגימות בבת אחת. ניתן לכמת את השפע המיקרוביאלי על ידי ציפוי של עד 96 הומוגנטים של זבובים שלמים על צלחת אגר אחת במערך של כתמים, ולאחר מכן ספירת היחידות היוצרות את המושבה (CFUs) הגדלות בכל נקודה. מערכת ציפוי זו משולבת עם פלטפורמת כימות CFU אוטומטית, המשלבת צילום של הלוחות, הבחנה של מושבות פלואורסצנטיות וספירה אוטומטית של המושבות באמצעות תוסף ImageJ. היתרונות הם ש-(1) שיטה זו רגישה מספיק כדי לזהות הבדלים בין הטיפולים, (2) שיטת הציפוי הנקודתי מדויקת כמו שיטות הציפוי המסורתיות, ו-(3) תהליך הספירה האוטומטי מדויק ומהיר יותר מספירה ידנית. תהליך העבודה המוצג כאן מאפשר כימות בתפוקה גבוהה של יחידות CFU במספר רב של משכפלים וניתן ליישם אותו במערכות מחקר מיקרוביולוגיות אחרות, כולל מבחנה ומודלים אחרים של בעלי חיים קטנים.

שיטה זו מכמתת את השפע המיקרוביאלי באמצעות תבנית צלחת של 96 בארות ליחידות יוצרות מושבות לוחות (CFUs) ומיושמת על המיקרוביום Drosophila בדגימות הומוגניות של זבובים שלמים. יחידות CFU נספרות באמצעות תוכנת ניתוח תמונות אוטומטית המסופקת כאן.

The intestines of animals are colonized by commensal microbes, which impact host development, health, and behavior. Precise quantification of colonization ...

ספירת יחידות יוצרות מושבה, או CFUs, היא טכניקה סטנדרטית במיקרוביולוגיה, אך היא איטית והיא דורשת הרבה צלחות אגר. הטכניקה שלנו מספקת יתרון של פי מאה על פני שיטות ספירת CFU מסורתיות בשתי צלחות אגר הזמן. יישמנו את המתודולוגיה כדי למדוד את מיקרוביום המעיים של מודלים של בעלי חיים קטנים, במיוחד זבובי פירות.פרוטוקול זה הוא דרך פשוטה, מהירה ואוטומטית לכמת CFUs בזבובי גנוטוביוטיקה. פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה עם מכשור מפוברק DIY לצילום יחידות ה- CFU ותוכנה מותאמת אישית כדי להפוך את הספירה לאוטומטית. פרוטוקול זה יכול לשמש בכל ניסוי מיקרוביולוגי שבו שיטות יעילות יותר של ציפוי וספירת CFU יכולות להיות שימושיות.טיפול יעיל בזבובים ואיתור הצלחות דורשים מיומנות ידנית, ולכן יש לתרגל זאת. השימוש בתוכנת הספירה האוטומטית דורש שיקול דעת לגבי הסף, ולכן יש להשוות את הקבלות לספירות ידניות כדי לזהות את הפרמטרים הטובים ביותר לניסוי שלך הדגמת ההליך יהיה רן דודג', חוקר מהמעבדה שלי שפיתח את הטכניקה. כדי להתחיל, מוזגים חרוזי זכוכית בגודל 0.5 מיקרון על מגש מדידת החרוזים.מורחים את החרוזים על המגש כך שכל הבארות יהיו מלאות ומפולסות. לאחר מכן, הברישו את החרוזים העודפים לתוך צינור חרוטי. כעת, הניחו צלחת PCR חצי-חצאית הפוכה על מגש המדידה והתאימו אותה לבארות על ידי התאמתה לכניסה במגש המדידה.לאחר מכן, הפוך אותו במהירות כדי להעביר את החרוזים. הסר חרוזים עודפים ממשטח צלחת ה- PCR. ודא שכל הבארות מכילות חרוזים.במידת הצורך, השתמשו בכף מדידה כדי להוסיף חרוזים לבאר אחת. לאחר מכן, לכסות את הצלחת עם רדיד אלומיניום autoclave. לפני השימוש בצלחת, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של PBS לכל באר מיד לפני הוספת הזבובים באמצעות פייפטר 96 ערוצים.לעיקור פני השטח של הזבובים המורמים, העבירו זבובים מהבקבוקון לצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר באמצעות משפך קטן. מיד לרסס מיליליטר אחד של 70% אתנול לתוך הצינור, לסגור את הצינור, ולערבב על ידי היפוך במשך 10 שניות. לאחר מכן, שאפו את האתנול עם פיפטה P-1000 תוך הימנעות משאיפת זבובים.לאחר שטיפת PBS סופית, סגרו את הצינור והקישו עליו בחוזקה על הספסל מספר פעמים כשצד הכובע כלפי מטה כדי שהזבובים ייכנסו לכובע. לאחר פתיחת הצינור, יש לטפטף זבובים לתוך הבארות באמצעות מלקחיים ולהניח זבוב אחד בכל באר. יש להרדים את הזבובים על ידי שמירת הצלחת על הקרח בזמן הטעינה.הסר חרוזים תועים קרוב לבארות, שכן אלה יכולים לשבור את אטם נייר הכסף ולגרום לדליפה. ודאו שהצד העמום של רדיד האיטום מכוון כלפי מטה על הצלחת והצד המבריק פונה כלפי מעלה לכיוון אוטם החום. לחץ על איטום החום בחוזקה במשך חמש שניות ושרוף עם המוליך הידני כדי לאבטח את נייר הכסף.הומוגניזציה של הזבובים במשך חמש דקות. ודא כי הזבובים הם הומוגניים לחלוטין ואת הפתרון הופך צבעוני. כדי להסיר נוזלים מנייר האיטום, סובבו את צלחת החרוזים למשך 30 שניות בספינר צלחת קטן ב-350 G.הסירו את נייר הכסף תוך כדי החזקת הצלחת כדי למנוע התזת טיפות של הומוגנט זבוב.הניחו שלושה לוחות גידול מלבניים של MRS agar כשהמכסים שלהם פתוחים בארון הבטיחות הביולוגית לייבוש למשך 10 דקות לפחות. הכן שתי צלחות דילול על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של PBS לכל באר של צלחת סטרילית של 96 בארות באמצעות פייפטר של 96 ערוצים. טען מתלה של קצוות P-20 על הפייפטר בן 96 הערוצים.בצע דילול של 1:10 על ידי שאיפת 11.1 מיקרוליטרים של הומוגנט מצלחת הדגימה. כעת, חלקו אותו לצלחת הדילול הראשונה המכילה 100 מיקרוליטרים של PBS סטרילי לכל באר. שמור את צלחת הדילול על שייקר הצלחת למשך 10 שניות במהירות של 600 סל"ד.מערבבים שוב על ידי צנרת למעלה ולמטה לפחות 10 פעמים. העבירו 11.1 מיקרוליטרים מצלחת הדילול הראשונה לצלחת הדילול השנייה וחזרו על שלבי הערבוב לכל דילול נוסף. עבור לוחות תצפית, טען שני מיקרוליטרים מכל באר לתוך pipeter 96 ערוצים.הנמיכו את ראש הפיפטר באיטיות על הצלחת, תוך הימנעות מדקירה לתוך האגר, וודאו שכל הכתמים חולקו. לאחר מכן, בדוק כי כתמים נוזליים במהירות לספוג לתוך אגר ולא לרוץ יחד. חזור על תהליך הציפוי עבור לוחות הדילול הנותרים כמתואר בכתב היד.לאחר שהנוזל נספג לחלוטין באגר, הפכו את הלוחות ודגרו אותם עד שהמושבות הגיעו לגודל אופטימלי. ארגנו את הצלחות בצורה הגיונית ושמרו אותן בסדר מסוים בזמן הצילום. כוון אותם כך ש- A1 נמצא בפינה השמאלית העליונה עבור כל הלוחות.לאחר הסרת מכסה הצלחת, הניחו את הצלחת על הבמה עם כיוון A1 בפינה הנכונה. דמיינו את הלוחות. העבר את התמונות למחשב ושנה את שמותיהן, כולל שם הניסוי, סוג המדיה, גורם הדילול ופרטים רלוונטיים אחרים.ארגנו את התמונות שיעובדו לכימות בתיקייה. שמות הקבצים המבדילים בין הלוחות הופכים לכותרות עמודות עבור כל קבוצת ספירות בגיליון האלקטרוני של הפלט. צור תיקיות משנה בשם 'חתוך' ו'קבלות' בתיקיה.תיקיות אלה יקבלו את קבצי הפלט. כעת הפעל את תוסף Croptacular מ- ImageJ ולחץ על אישור כדי להתחיל לחתוך. תיבת דו-שיח לבחירת תיקיית המקור תופיע.לחץ על OK. בחר את תיקיית המקור ולחץ על פתח. לאחר מכן, לחץ על אישור בתיבת הדו-שיח לבחירת ספריית היעד. בחר את תיקיית היעד ולחץ על פתח.אם התמונה כבר ישרה, פשוט לחץ על רווח. אחרת, יישר את התמונה על-ידי ציור קו לאורך קצה שאמור להפוך לאופקי. ציירו מחדש את הקו כמה פעמים שצריך אם התמונה לא נראית ישרה.לאחר מכן, ציירו תיבת גבול לאזור הספירה והתאימו את גודלו ופרופורציה שלו עד שכל הכתמים יהיו בתוך התאים שלהם. גרור את הסמן אל מחוץ לתיבת הגבול כדי לרענן את הרשת. כאשר הרשת נראית טוב, לחץ על רווח.מכיוון שהתוסף מניח שכל התמונות מיושרות באופן זהה, ודא שהתמונה הבאה מסתובבת באופן אוטומטי לאותה זווית כמו התמונה הראשונה. אם זה מדויק, לחץ על רווח כדי להמשיך. אחרת, יישרו את התמונה כמו קודם.הרשת גם נזכרת באותו מיקום כמו בתמונה הקודמת. התאם במידת הצורך ולחץ על רווח. הפעל את Count-On-It ובחר Gridiron.קבעו את עוצמת מושבת הסף בהתבסס על ערך עוצמת פיקסלים עליון ותחתון. הפוך את הסף למחמיר ככל האפשר, תוך בחירת כל המושבות. לחץ/י על ״אישור״ בתיבת הדו-שיח ״פעולה נדרשת״ כאשר הסף משביע רצון ולאחר מכן לחץ/י על ״אישור״ כדי להמשיך.בתמונה הראשונה, ניתנת האפשרות להמשיך או לחזור לתפריט ההתקנה. כדי להמשיך בתהליך האצווה, לחץ על אישור. לאחר מכן, בחר תיקיה כדי לשמור על טבלת הקבלות והתוצאות. השתמש בתיקיה 'קבלות' שנוצרה קודם לכן.לאחר התמונה הראשונה, ברירת המחדל של התמונות הבאות תהיה באותו סף כמו ההגדרות הקודמות. לחץ על אישור כדי להשתמש בהגדרות אלה או להתאים את ההגדרות. סקור את קבלות הספירה המיוצרות על-ידי התוכנה ותקן באופן ידני שגיאות ספירה.התוסף ImageJ מדויק סטטיסטית, אך מתרחשות שגיאות. הוכחת הקבלות כדי לבחון חריגות ולזהות טעויות בחשבונות. התוכנה שומרת את נתוני CFU כקובץ CSV באותה תיקיה כמו הקבלות.עבור זבובים שהתיישבו עם לקטובצילוס פלנטרום, חלה ירידה משמעותית בחיידקים עבור זבובים שהועברו מדי יום למזון סטרילי, הועברו מדי יום, נשמרו על מזון סטרילי ארבע שעות לפני הניתוח, או הועברו מדי יום ונשמרו על אגר סטרילי ארבע שעות לפני הניתוח בהשוואה לזבובים שמעולם לא הועברו למזון סטרילי לאחר החיסון. תוצאות דומות נצפו בזבובים שניזונו מ-Acetobacter indonesiensis, שם זבובים שהועברו, הועברו ופונו הראו ירידה משמעותית ב-CFU, אך לשטיפה לא הייתה השפעה ניתנת למדידה, מה שמרמז על כך שהירידה ב-CFUs נבעה מסילוק חיידקים מהמעיים ולא מהקוטיקולה. ספירת CFU בנקודות עם 2 עד 25 מושבות לנקודה לא הראתה הבדל בהשוואה לשיטה המסורתית.כתמים בממוצע של 35 מושבות הראו CFUs נמוכים יותר מאשר לוחות התפשטות הבקרה. ייתכן שהפחתה זו נובעת ממושבות החופפות בנקודות צפופות. בצילומי צלחת, עוצמת המושבה הייתה גבוהה ב-300% מהרקע.המושבות החיוביות של לקטובצילוס פלנטרום mCherry הציגו עוצמה אדומה גבוהה ב-1, 000% בהשוואה למושבות שליליות ל-mCherry. מושבות חיוביות ל-GFP של Acetobacter indonesiensis הראו עוצמה ירוקה גבוהה ב-200% בהשוואה למושבות שליליות ל-GFP. תוסף Count-On-It עבור ImageJ הופך את ספירת CFU מתמונות הצלחת לאוטומטית.מושבות מזוהות במדויק, עם ספירות דומות לספירה ידנית. ניתן להשתמש בקבלות ספירה כדי לזהות ספירות שגויות. שינוי ספי הגודל ואורכי הגל הפלואורסצנטיים מאפשר לספור מורפולוגיות מושבות שונות בנפרד.חשוב לוודא שהצלחת אטומה היטב לפני חרוזים. חשוב גם לתכנן בקרות חיוביות כדי לכייל את המדידות. אנו משתמשים בטכניקה זו גם כדי לחקור אוכלוסיות של חיידקים במבחנה בלוחות של 96 בארות, מה שמאפשר לנו לחקור קהילות מעורבות של חיידקים.טכניקה זו מאפשרת גישות לסינון תפוקה גבוהה למדידת התיישבות במעיים, כמו גם שונות ביולוגית בקולוניזציה.

fast-colony-forming-unit-counting-96-well-plate-format-applied-to

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כדי להבין את קשר בין התגובה החיסונית ובהתנהגות, שאנו מתארים שיטה למדידת התנהגות רצוניים...

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה<em&gt; דרוזופילה</em

מיקרוביוטה של דרוזופילה משפיעה על התפתחות החיה, חסינותה והפיזיולוגיה שלה. סרטון זה מתאר שיטה לכימות חיידקים מזבובים על ידי קביעת יחידות היוצרות המושבה מתכשירי כל הגוף. הפרוטוקול המוצג מדגים את הטכניקה עם זבובים, המגודלים בתנאים גנוטוביוטיים באמצעות ארבעה מיני חיידקים.

Counting Colony Forming Units (CFUs): כימות חיידקים מגופי זבובים

מקור: Dodge, R., et al. ספירת יחידות יוצרות מושבה מהירה בפורמט צלחת של 96 בארות המיושמת על המיקרוביום של דרוזופילה . J. Vis. Exp. (2023)סרטון זה מדגים את הכימות של יחידות יוצרות מושבה (CFUs) של חיידקים הקשורים למעיים בזבובי דרוזופילה באמצעות גישת דילול וציפוי סדרתי. דגימות זבובים הומוגניות המכילות חיידקי מעיים מדוללות באופן סדרתי, מצופות על אגר ומודגרות כדי לאפשר צמיחת מושבה. לאחר מכן מנותחים תמונות של הלוחות באמצעות תוכנה ליישור, פילוח וספירת מושבות בכל נקודה, מה שמאפשר כימות מדויק של CFU.

כימות יחידות יוצרות מושבה של חיידקים הקשורים למעיים בזבובי דרוזופילה

בסרטון זה אנו מדגימים טכניקה למדידת עומס חיידקי E. coli לאחר הזרקת E. coli לבית החזה של Drosophila melanogaster.

מדידת עומס חיידקי E. coli ב- Drosophila melanogaster בעקבות זיהום E. coli

Drosophila melanogaster הוא אורגניזם מודל יוצא דופן לחקר מערכות חיסון מולדות וההשלכות הפיזיולוגיות של זיהום ומחלות. פרוטוקול זה מתאר כיצד לספק זיהומים חיידקיים חזקים וניתנים לחזרה כמותית ל-D. melanogaster, וכיצד למדוד לאחר מכן את חומרת הזיהום ולכמת את התגובה החיסונית של המארח.

זיהום חיידקים מערכתי וחיסון ביטחון פנוטיפים ב<em&gt; דרוזופילה melanogaster</em

שיטה לגידול תסיסנית בתנאי axenic ו gnotobiotic מוצגת. עוברי זבובים הם dechorionated ב חומצת נתרן, הועברו בסביבה נקיה מחיידקים לתזונה סטרילי, וגדלו במיכלים סגורים. ייחסתי דיאטה ועובר עם חיידקים מובילים עמותות gnotobiotic, ונוכחות חיידקים אושר על ידי ציפוי homogenates תסיסנית הגוף כולו.

גידול זבוב הפירות<em&gt; תסיסנית</em&gt; בתנאי Axenic ו Gnotobiotic

פנוטיפים של צמיחת שמרים נמדדים במדויק באמצעות הדמיה מקבילה מאוד של תאים משותקים הגדלים למיקרוקולוניות. במקביל, ניתן לעקוב אחר עמידות ללחץ, ביטוי חלבון ולוקליזציה של חלבונים, וליצור ערכות נתונים משולבות כדי לחקור כיצד הבדלים סביבתיים וגנטיים, כמו גם הטרוגניות של ביטוי גנים בקרב תאים איסוגניים, מווסתים את הצמיחה.

הדמיה חיה בעלת תפוקה גבוהה של מיקרוקולוניות למדידת הטרוגניות בצמיחה ובביטוי גנים

מאכיל המיקרו-לוח מציע שיטה חסכונית ובעלת תפוקה גבוהה לכימות צריכת מזון נוזלי בדרוזופילה. התקן מודפס בתלת-ממד מחבר מיקרו-לוחית בעלת 96 באר שבה זבובים שוכנים למיקרו-לוחית בעלת 1536 בארות שממנה זבובים צורכים תמיסת הזנה עם צבע מעקב. ירידת נפח הפתרון נמדדת באופן ספקטרופוטומטרי.

מאכיל מיקרו-תפוקה גבוהה לבדיקה לכימות הצריכה בדרוסופילה

Caenorhabditis elegans הוא מודל רב-עוצמה לבחינת הדטרמיננטים המולקולריים המניעים אינטראקציות בין המארח למיקרוביום. אנו מציגים צינור בתפוקה גבוהה המתאר את רמות ההתיישבות של מיקרוביום המעי בבעלי חיים בודדים יחד עם היבטים מרכזיים של הפיזיולוגיה של C. elegans.

יישום של ורמימטריית זרימה לכימות וניתוח של מיקרוביום המעי Caenorhabditis elegans

קביעת יחידות יוצרות מושבות (CFU) היא הטכניקה הסטנדרטית לכימות חיידקים, כולל Mycobacterium tuberculosis אשר יכול לקחת שבועות כדי ליצור מושבות גלויות. כאן אנו מתארים מיקרו-CFU לקביעת CFU עם יעילות זמן מוגברת, שטח מעבדה מופחת ועלות מגיב, ומדרגיות לניסויים בתפוקה בינונית וגבוהה.

בדיקת יחידה להקמת מושבות מיקרו להערכת יעילות חיסונים נגד שחפת

קווי תאים שימושיים במחקרים על אורגניזמים תוך-תאיים שלא ניתן לגדל מחוץ לתאים המארחים שלהם. למרות שקווים נגועים בוולבכיה אפשרו תגליות רבות, ההטרוגניות בתוך קווים אלה יכולה להוביל לתוצאות ניסוי משתנות. אנו מציגים פרוטוקול ליצירת שיבוטים של תאים בודדים ותרביות רציפות מתאי JW18 נגועים בוולבכיה.

יצירת תרביות חד-שבטיות מקו התאים של Drosophila melanogaster JW18 נגוע בוולבכיה

למד שיטה אוטומטית לספירת יחידות יוצרות מושבה בפורמט צלחת 96 בארות לניתוח מיקרוביום Drosophila. הפרוטוקול מציע יתרון של מאה מונים בזמן בהשוואה לשיטות מסורתיות.

ספירת יחידות יוצרות מושבה מהירה בתבנית צלחת 96 בארות המיושמת על מיקרוביום הדרוזופילה

גלה סרטונים נוספים