Name: הערכת הפעלת קספז להערכת מוות מולד של תאי מערכת החיסון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: למדו להעריך הפעלת קספאזים בתאי מערכת החיסון לזיהוי מסלולי מוות תאי כולל פירופטוזיס ואפופטוזיס. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה לניתוח מנגנוני מחלה ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מעבדת Kanneganti על הערותיהם והצעותיהם, ומודים ל- J. Gullett, PhD, על התמיכה בעריכה מדעית. העבודה במעבדה שלנו נתמכת על ידי מענקי המכונים הלאומיים לבריאות (NIH) AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 ו- CA253095 (ל- T.-D.K.) ועל ידי ארגוני הצדקה האמריקאים הקשורים ללבנון הסורית (ל- T.-D.K). התוכן הוא באחריותם הבלעדית של המחברים ואינו מייצג בהכרח את הדעות הרשמיות של המכונים הלאומיים לבריאות.

ט.-ד.ק. היא יועצת לפייזר.

ניטור הפיצול וההפעלה של הקספז מספק את אחת התמונות המקיפות ביותר של הפעלת PCD חיסוני מולד כחלק מהתגובה החיסונית המולדת. הפרוטוקול המתואר כאן מדגים אסטרטגיה לניטור הפעלת קספז בתגובה לזיהומים IAV, HSV1 ו- F. novicida והטריגר הסטרילי LPS + ATP, אך גירויים רבים אחרים יכולים לגרום ל- PCD וניתן להשתמש בהם בשיטה זו, כפי שהוכח במספר פרסומים 44,48,49,50,51,52,53,54,56<sup c...

מערכת החיסון המולדת פועלת כקו ההגנה הראשון במהלך זיהום ובתגובה לגירויים סטריליים, כגון פגיעה ברקמות ושינויים בהומאוסטזיס. חיישנים חיסוניים מולדים על פני התא ובציטופלסמה מגיבים לדפוסים מולקולריים הקשורים לפתוגן או נזק (PAMPs או DAMPs, בהתאמה) כדי להפעיל מסלולי איתות דלקתיים ותגובות תאיות. אחד התהליכים המרכזיים של התגובה החיסונית המולדת הוא השראת מוות תאי כדי להסיר תאים נגועים או פגומים ולהניע תגובות חיסוניות מולדות ונרכשות נוספות. מוות תאי מתוכנת (PCD) הוא תהליך שמור מאוד בין מינים, מה שמדגיש את חשיבותו האבולוציונית כמנגנון חיסוני מולד.
ישנם מספר מסלולי PCD חיסוניים מולדים שיכולים להיות מופעלים בכל סוגי התאים. קספזות הן משפחת מפתח של פרוטאזות תלויות ציסטאין שהשתמרו מאוד, תוך תאיות ותלויות ציסטאין, שהן קריטיות במסלולי PCD רבים, כולל מסלול אפופטוזיס לא דלקתי מסורתי, כמו גם מסלולי PCD דלקתיים כמו פירופטוזיס, נקרופטוזיס ו-PANoptosis 1,2,3,4,5 . ישנם 11 קספזות אנושיות ו -10 קספזות מורין המוגדרות היטב, כמו גם פסאודו-קספזות שעשויות להיות פונקציונליות, ורובן מבוטאות באופן מכונן כפרו-קספזות מונומריות או דימריות לא פעילות הדורשות מחשוף להפעלה 6,7. Caspases מכילים גם תחומים חשובים עבור גיוס והיווצרות של מתחמי multiprotein. אלה כוללים את תחום ההפעלה והגיוס של קספאז (CARD), שניתן למצוא בקספאז-1, קספאז-2, קספאז-4, קספאז-5, קספאז-9 וקספאז-11, או תחום אפקט המוות (DED), שנמצא בקספאז-8 ובקספאז-10. הן באמצעות הפעילות הפרוטאוליטית שלהם והן באמצעות יכולתם ליצור קומפלקסים של מולטי-חלבונים, קספזות הן מניעים קריטיים של PCD חיסוני מולד.
תפקידן של קספזות ב-PCD של מערכת החיסון המולדת זוהה לראשונה באפופטוזיס, כאשר הקספזות היוזמות, קספאז-2, קספאז-8, קספאז-9 וקספאז-10, מפעילות את קספזות התליינים, קספאז-3, קספאז-6 וקספאז-7, כדי לגרום למוות תאי 8,9,10,11,12. קספזות יוזמות יכולות להיות מופעלות על ידי מפל איתות מגוון; המסלול החיצוני מפעיל את קספאז-8 באמצעות איתות קולטן מוות חוץ-תאי המושרה על ידי ליגנד, והמסלול הפנימי מפעיל את קספאז-9 באמצעות הפרעה לשלמות המיטוכונדריה13. קספזות יוזמות מופעלות מנתקות את המקשר המפריד בין תת-היחידות הקטליטיות הגדולות והקטנות של קספזות התליין כדי לייצר את צורתן הפעילה. לאחר מכן, קספזות התליין קורעות את הסובסטרטים שלהן כדי לפרק את התא, וכתוצאה מכך מתפרקת הדנ"א, ממברנות מפוצלות, פיצול גרעיני ושחרור גופים אפופטוטיים14,15. תהליך זה מסתיים בדרך כלל בצורה לא ליטית ולא דלקתית של מוות תאי כאשר הוא יחד עם פינוי מיידי של התאים הגוססים על ידי אפרוציטוזה16. עם זאת, פגמים efferocytosis או חוסר תאים phagocytic יכול להוביל הצטברות של תאים אפופטוטיים, אשר לאחר מכן לעבור מוות תאים ליטיים ודלקתיים17,18.
הקספזות הדלקתיות, כולל קספאז-1 (אדם ועכבר), קספאז-4 וקספאז-5 (אדם) וקספאז-11 (עכבר), התגלו כמופעלות במהלך צורה של PCD (III-PCD) דלקתי של מערכת החיסון המולדת הנקראת פירופטוזיס. הפעלת קספאז-1 קשורה להיווצרות של דלקתיות, שהן קומפלקסים רב-חלבוניים המכילים חיישן חיסוני מולד ציטוסולי, מולקולת מתאם (חלבון דמוי גרגיר הקשור לאפופטוזיס המכיל CARD [ASC]) וקספאז-1. היווצרות קומפלקס זה מאפשרת לקספאז-1 לעבור אוטופרוטאוליזה בתיווך קרבה כדי לשחרר את צורתו הפעילה, אשר יכולה לבקע את מצעי המטרה כולל הציטוקינים מעודדי הדלקת אינטרלוקין (IL)-1β ו- IL-18 ומולקולה יוצרת הנקבוביות Gasdermin D (GSDMD)19,20,21,22,23 . קספאז-11, קספאז-4 וקספאז-5 יכולים גם להפעיל GSDMD ללא היווצרות מעלה הזרם של הדלקתיות לאחר חישה של PAMPs כגון ליפופוליסכריד (LPS)19,20. קספזות אלה עוברות דימריזציה ואחריה אוליגומריזציה ומחשוף עצמי להפעלה עם קשירה ל- LPS ציטוסולי, מה שמוביל להפעלה דלקתית לא קנונית 24,25,26 והפעלת קספאז-1 באופן פנימי לתאים כדי לגרום להבשלת IL-1β ו- IL-18 20. ההבשלה והשחרור של ציטוקינים מעודדי דלקת אלה מאפיינים קספזות אלה כ"דלקתיות". בנוסף, נמצא כי הקספאז-8 האפופטוטי מתמקם בדלקת, ומספק קשר בין תהליכים אפופטוטיים ופירופטוטיים. מחקרים מצאו כי קספאז-8 אפופטוטי הוא גם קריטי לוויסות צורה אחרת של PCD הנקראת נקרופטוזיס. אובדן קספאז-8 גורם לאינטראקציה ספונטנית של קולטן סרין-תראונין קינאז 3 (RIPK3) בתיווך שושלת מעורבת קינאז דמוי תחום פסאודוקינאז (MLKL) כדי להניע את מסלול III-PCD של נקרופטוזיס 27,28,29,30,31,32,33,34,35.
בעוד שקספזות סווגו בעבר כ"אפופטוטיות" או "דלקתיות" בהתבסס על סוג המוות התאי שהן יוזמות, עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שיש הצלבה נרחבת בין מסלולי PCD של מערכת החיסון המולדת דרך קספזות 3,4. לדוגמה, הקספאז-1 הדלקתי מדלקת קוטע את הקספאז-7 האפופטוטי באתר ההפעלה הקנוני שלו34. הפעלת קספאז-1 יכולה גם להוביל לפיצול של מצעים אפופטוטיים כגון פולי(ADP-ריבוז) פולימראז 1 (PARP1)36. בתאים חסרי GSDMD, קספאז-1 יכול גם לבקע קספאז-337,38. בנוסף, קספאז-3 אפופטוטי קנוני יכול לבקע gasdermin E (GSDME) כדי לגרום PCD17,18 וגם מעבד GSDMD לתוך צורהלא פעילה 40. יתר על כן, גיוס קספאז-8 לקומפלקס הדלקתי נצפה 39,40,41,42,43,44,45, וקספאז-8 הוא וסת מרכזי של הפעלה דלקתית קנונית ולא קנונית 39. ישנם גם תפקידים חופפים ומיותרים עבור קספאז-8 וקספאז-1 במצבים דלקתיים רבים, ו-PCD חיסוני מולד המאופיין בהפעלת רכיבים פירופטוטיים, אפופטוטיים ונקרופטוטיים, מתרחש על פני ספקטרום המחלה 39,46,47,48,49,50.
בהתבסס על קשר גומלין זה בין קספזות דלקתיות ואפופטוטיות, זוהה פער מרכזי בהבנה המכניסטית של חסינות מולדת ו- PCD, מה שהוביל לגילוי PANoptosis. PANoptosis היא צורה ייחודית של III-PCD המופעלת בתגובה לפתוגנים, PAMPs, DAMPs ושינויים בהומאוסטזיס ומווסתת על ידי PANoptosomes - קומפלקסים מקרומולקולריים רבגוניים המשלבים רכיבים ממסלולי מוות תאי אחרים 44,50,51,52,53,54,55 . מכלול ההשפעות הביולוגיות ב-PANoptosis אינו יכול להיות מוסבר באופן אינדיבידואלי על ידי פירופטוזיס, אפופטוזיס או נקרופטוזיס בלבד 3,4,35,36,39,46,47,48, שכן PANoptosis מאופיין בהפעלה של קספזות מרובות, כולל קספאז-1, קספאז-11, קספאז-8, קספאז-9, קספאז-3 ו/או קספאז-7, בהתאם להקשר 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,59,60,61,62 . PANoptosis היה מעורב יותר ויותר במחלות זיהומיות ודלקתיות, כמו גם בסרטן וטיפולים בסרטן 3,4,35,36,39,44,46,47,48,49,50,51,52,53 ,54,56 ,57,58,59,60,61,62,63,64,65,66.
בהתחשב בתפקיד החיוני של קספזות על פני מסלולי מוות תאי, כולל אפופטוזיס, פירופטוזיס, נקרופטוזיס, ו PANoptosis, חשוב לפתח טכניקות כדי לאפיין את ההפעלה שלהם ולהבין את המורכבות המלאה של מסלולי PCD. הפרוטוקול כאן מפרט שיטה לגרות תאים ולמדוד את ההפעלה הבאה של קספזות (איור 1). שיטה זו ממנפת את המחשוף הפרוטאוליטי של קספזות, הנדרש בדרך כלל להפעלתן, כאמצעי לחקור אותן. באמצעות כתמים מערביים, ניתן לקבוע את גודל החלבון, המאפשר הדמיה ברורה והתמיינות של פרו-קספזות לא פעילות וצורתן הפעילה והשסועה.
היתרונות העיקריים של פרוטוקול זה הם: 1) יכולתו להעריך את ההפעלה של מספר קספזות במקביל מאוכלוסייה אחת של תאים אנדוגניים כדי לקבוע בצורה מדויקת יותר את הפעלת PCD, 2) שימוש בטכניקות מעבדה פשוטות יחסית שאינן דורשות הכשרה מקיפה או ציוד יקר. פרוטוקולים קודמים השתמשו בכתם מערבי, בכתבים פלואורסצנטיים או בצביעת נוגדנים כדי לעקוב אחר הפעלת קספז בתרביות, בליזטים של תאים ורקמות, בתאים שלמים באמצעות מיקרוסקופיה, וב-in vivo 67,68,69,70,71, אך טכניקות אלה בדרך כלל מנטרות רק קספזה אחת או שתיים בדגימה. יתר על כן, בעוד שמצעים פפטידים סינתטיים המכילים אתרי מחשוף קספז הזורמים על המחשוף שימשו לניטור הפעלת קספז בליזטים של תאים או רקמות69, מצעים אלה יכולים לעתים קרובות להיבקע על ידי יותר מקספזה אחת, מה שמקשה לקבוע את ההפעלה הספציפית של קספזות בודדות במערכת זו. בנוסף, השימוש בכתם מערבי במקום שימוש בכתבים פלואורסצנטיים או שיטות מבוססות תגיות אחרות מאפשר לחוקרים להשתמש בתאים אנדוגניים במקום ליצור קווי תאים ספציפיים עם גנים של כתב. ישנם יתרונות רבים לשימוש בתאים אנדוגניים, כולל העובדה שקווי תאים אימורטליים רבים חסרים במולקולות מפתח של מוות תאי72,73, מה שעלול להשפיע על התוצאות. בנוסף, שימוש בתאים אנדוגניים מאפשר הערכה של סוגי תאים מגוונים, כגון מקרופאגים, תאי אפיתל ותאי אנדותל, ולא שושלת אחת. המלטות מערביות הן גם טכניקה פשוטה יחסית וחסכונית שניתן לבצע במעבדות ברחבי העולם ללא צורך בציוד גדול ויקר או התקנות מסובכות.
פרוטוקול זה מיושם באופן נרחב ברחבי הביולוגיה כדי להבין הן את התפקודים התלויים במוות תאי והן את התפקודים שאינם תלויים במוות תאי של קספזות, כולל תפקידי הפיגומים שלהם ותפקודם במסלולי איתות דלקתיים אחרים74. יישום שיטה זו מאפשר גישה אחידה בחקר מסלולי PCD חיסוניים מולדים ואיתות דלקתי על פני מחלות ותנאים, וניתן להשתמש בפרוטוקול זה כדי לזהות תהליכים רגולטוריים קריטיים וקשרים מכניסטיים שיסייעו בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות עתידיות.

<table><tbody><tr><td>0.45 &mu; מסנן m</td><td>Millipore</td><td>SCHVU05RE</td><td></td></tr><tr><td>מזרק 10 מ"ל</td><td>BD Biosciences</td><td>309604</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל פוליאקרילאמיד 12% עם 10 בארות&nbsp;</td><td>ביו-ראד</td><td>4561043</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 12 בארות&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>07-200-82</td><td></td></tr><tr><td>מחט 18 גרם&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>מחט 25 גרם&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>שפופרת 50 מ"ל&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-809-218</td><td></td></tr><tr><td>70 &mu; מסננת תאים M&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>431751</td><td></td></tr><tr><td>150 מ"מ צלחות תרבית רקמות</td><td>קורנינג</td><td>430597</td><td></td></tr><tr><td>182 ס"מ2 בקבוק תרבית רקמות</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-211</td><td></td></tr><tr><td>אביזר מגש טרנס לבן</td><td>Cytiva</td><td>29-0834-18</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; נוגדן caspase-1</td><td>AdipoGen</td><td>AG-20B-0042-C100</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; נוגדן קספאז-11</td><td>נובוס ביולוגי</td><td>NB120-10454</td><td></td></tr><tr><td>אנטי&ndash; caspase-3 נוגדן</td> טכנולוגיית <td>איתות תאים</td><td>9662</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; caspase-7 נוגדן</td> טכנולוגיית <td>איתות תאים</td><td>9492</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; caspase-8 נוגדן</td> טכנולוגיית <td>איתות תאים</td><td>4927</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; caspase-9 נוגדן</td> טכנולוגיית <td>איתות תאים</td><td>9504</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; נוגדן קספאז-3 שסוע&nbsp;</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>9661</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; נוגדן קספאז-7 שסוע&nbsp;</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>9491</td><td></td></tr><tr><td>Anti&ndash; נוגדן קספאז-8 שסוע&nbsp;</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>8592</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני מצומד HRP נגד עכברים&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>315-035-047</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני מצומד HRP נגד ארנב&nbsp;</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories</td><td>111-035-047</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן משני מצומד HRP נגד חולדות&nbsp;</td><td>מעבדות ג'קסון אימונו-מחקר</td><td>112-035-003</td><td></td></tr><tr><td>אנטי&ndash; &בטא;-נוגדן אקטין (C4) HRP</td><td>סנטה קרוז</td><td>sc-47778 HRP</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-atpl</td><td></td></tr><tr><td>BBL Trypticase מרק סויה</td><td>BD Biosciences</td><td>אמבט חרוזים 211768</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Chemglass Life Sciences</td><td>CLS-4598-009</td><td></td></tr><tr><td>ביופוטומטר D30</td><td>Eppendorf</td><td>6133000010</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>ברומופנול כחול&nbsp;</td><td>מגרדי תאים Sigma</td><td>BO126</td><td></td></tr><tr><td></td><td>CellTreat מוצרים מדעיים</td><td>229315</td><td></td></tr><tr><td>הדמיית כימילומינסנציה (אמרשם 600)&nbsp;</td><td>Cytiva</td><td>29083461</td><td></td></tr><tr><td>CO2&nbsp; תא</td><td>VetEquip</td><td>901703</td><td></td></tr><tr><td>Cuvettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-129</td><td></td></tr><tr><td>ניתוחי מספריים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>221S</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>43815</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר אלקטרופורזה&nbsp;</td><td>ביו-ראד</td><td>1658004</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>פארמקו</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp;</td><td>Biowest</td><td>S1620</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>Bio-Rad</td><td>1703965</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-327379</td><td></td></tr><tr><td>Francisella novicida (זן U112)</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13</td><td></td></tr><tr><td>משחרר ג'ל&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1653320</td><td></td></tr><tr><td>ג'נטמיצין</td><td>גיבקו</td><td>15750060</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>סיגמא</td><td>G7893</td><td></td></tr><tr><td>גליצין</td><td>סיגמא</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>סיגמא</td><td>H9892</td><td></td></tr><tr><td>בלוק חום</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>23-043-160</td><td></td></tr><tr><td>וירוס הרפס סימפלקס 1 (זן HF)</td><td>ATCC</td><td>VR-260</td><td></td></tr><tr><td>גלוקוז גבוה DMEM&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>D6171</td><td></td></tr><tr><td>אנטי אנושי; נוגדן קספאז-1</td><td>R& D Systems</td><td>MAB6215</td><td></td></tr><tr><td>Human Anti&ndash; נוגדן קספאז-8</td><td>Enzo</td><td>ALX-804-242</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור לח&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026282</td><td></td></tr><tr><td>תוכנת ניתוח תמונות</td><td>ImageJ</td><td>v1.53a</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12440-053</td><td></td></tr><tr><td>נגיף שפעת A (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8])&nbsp;</td><td>נבנה לפי הופמן ואחרים.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תאי L929</td><td>ATCC</td><td>CCL-1</td><td>קו תאים ליצירת מדיה מותנית L929</td></tr><tr><td>L-ציסטאין&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP376-100</td><td></td></tr><tr><td>Luminata Forte Western HRP מצע</td><td>Millipore</td><td>WBLUF0500</td><td>מצע HRP רגישות סטנדרטית</td></tr><tr><td>תאי MDCK</td><td>ATCC</td><td>CCL-34</td><td>קו תאים לקביעת טיטר ויראלי IAV</td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא</td><td>322415</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>75002401</td><td></td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות&nbsp;</td><td>ג'יבקו</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>אבקת חלב מיובש ללא שומן</td><td>תמיסת קרוגר</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NP-40&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>492016</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין וסטרפטומיצין&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>07-202-011</td><td></td></tr><tr><td>PhosSTOP</td><td>Roche</td><td>PHOSS-RO</td><td></td></tr><tr><td>מקור כוח&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>טבלית מעכב פרוטאז</td><td>Sigma</td><td>S8820</td><td></td></tr><tr><td>PVDF ממברנה&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>שייקר נדנדה</td><td>Labnet</td><td>S2035-E</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Sigma</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>נתרן דאוקסיכולאט</td><td>Sigma</td><td>30970</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>Sigma</td><td>72068</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי מרובעת</td><td>פישר FB0875711A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מדעי הפשטת מאגר</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>21059</td><td></td></tr><tr><td>סופר אות Femto HRP מצע</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>34580</td><td>מצע HRP רגישות גבוהה</td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td><td>תרמו פישר מדעי</td><td>75004524</td><td></td></tr><tr><td>מערכת Trans-Blot חצי יבשה&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>170-3940</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma</td><td>TRIS-RO</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>ליפופוליסכריד אולטרה-טהור (LPS) מבית E. coli 0111:B4</td><td>InvivoGen</td><td>tlrl-3pelps</td><td></td></tr><tr><td>תאי Vero קו תאים</td><td>ATCC</td><td>CCL-81</td><td>לקביעת טיטר ויראלי HSV1</td></tr></tbody></table>

הערכת הפעלת קספז להערכת מוות מולד של תאי מערכת החיסון

Evaluation of Caspase Activation to Assess Innate Immune Cell Death

חסינות מולדת מספקת את קו ההגנה הראשון הקריטי בתגובה לפתוגנים ולעלבונות סטריליים. מרכיב מכניסטי מרכזי בתגובה זו הוא התחלת מוות תאי מתוכנת חיסוני מולד (PCD) כדי לחסל תאים נגועים או פגומים ולהפיץ תגובות חיסוניות. עם זאת, עודף PCD קשור דלקת ופתולוגיה. לכן, הבנת ההפעלה והוויסות של PCD היא היבט מרכזי באפיון תגובות חיסוניות מולדות ובזיהוי מטרות טיפוליות חדשות על פני ספקטרום המחלה.
פרוטוקול זה מספק שיטות לאפיון הפעלת PCD חיסונית מולדת על ידי ניטור קספזות, משפחה של פרוטאזות תלויות ציסטאין הקשורות לעתים קרובות למסלולי PCD מגוונים, כולל אפופטוזיס, פירופטוזיס, נקרופטוזיס ו- PANoptosis. דיווחים ראשוניים אפיינו את קספאז-2, קספאז-8, קספאז-9 וקספאז-10 כקספזות יוזמות ואת קספאז-3, קספאז-6 וקספאז-7 כקספזות משפיעות באפופטוזיס, בעוד שמחקרים מאוחרים יותר מצאו שהקספזות הדלקתיות, קספאז-1, קספאז-4, קספאז-5 וקספאז-11, מניעות פירופטוזיס. כיום ידוע כי קיימת הצלבה נרחבת בין הקספזות לבין מולקולות אחרות של מערכת החיסון המולדת ומוות תאי על פני מסלולי PCD שהוגדרו קודם לכן, מה שזיהה פער ידע מרכזי בהבנה המכניסטית של חסינות מולדת ו-PCD והוביל לאפיון של PANoptosis. PANoptosis הוא מסלול PCD דלקתי חיסוני מולד ייחודי המווסת על ידי קומפלקסים של PANoptosome, המשלבים רכיבים, כולל קספזות, ממסלולי מוות תאים אחרים.
כאן ניתנות שיטות להערכת הפעלת קספזות בתגובה לגירויים שונים. שיטות אלו מאפשרות אפיון של מסלולי PCD הן במבחנה והן in vivo, כאשר קספזות פעילות עוברות מחשוף פרוטאוליטי שניתן להמחיש על ידי כתם מערבי באמצעות נוגדנים אופטימליים ותנאי כתש. נקבעו פרוטוקול וזרימת עבודה מערבית המאפשרים הערכה של הפעלה של קספזות מרובות מאותה אוכלוסייה סלולרית, ומספקים אפיון מקיף של תהליכי PCD. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על פני תחומי מחקר בפיתוח, הומאוסטזיס, זיהום, דלקת וסרטן כדי להעריך מסלולי PCD לאורך תהליכים תאיים בבריאות ובמחלות.

PANoptosis נצפתה בתגובה לזיהומים חיידקיים, נגיפיים ופטרייתיים רבים וגירויים דלקתיים אחרים, כמו גם בתאים סרטניים 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62</sup...

פרוטוקול זה מתאר שיטה מקיפה להערכת הפעלת קספאז (קספאז-1, קספאז-3, קספאז-7, קספאז-8, קספאז-9 וקספאז-11) בתגובה הן למודלים במבחנה והן ב-in vivo (בעכברים) של זיהום, עלבונות סטריליים וסרטן כדי לקבוע את התחלתם של מסלולי מוות תאי, כגון פירופטוזיס, אפופטוזיס, נקרופטוזיס ו-PANoptosis.

Innate immunity provides the critical first line of defense in response to pathogens and sterile insults. A key mechanistic component of this response is ...

פרוטוקול זה מספק הבנה רבת פנים של הפעלת תהליכי מוות תאי, אשר יכולה לספק תובנות קריטיות לגבי מנגנוני מחלה וליידע אסטרטגיות טיפוליות. פרוטוקול זה מסתמך על שימוש בטכניקה פשוטה יותר וכדי לגשת להפעלה של קספזות מרובות הכרחיות מאוכלוסייה אחת של תאים אנדוגניים כדי לקבוע במידה רבה את ההפעלה. מוות מולד של תאי מערכת החיסון היה מעורב בכל ספקטרום המחלות, מזיהומים, דרך מחלות דלקתיות ועד סרטן.הבנת המנגנונים המולקולריים של מוות תאי באמצעות הפעלת קספז יכולה לספק תובנות קריטיות על תהליכי מחלה. ד"ר ג'וליאן, עמיתת מחקר פוסט-דוקטורנטית ממעבדה, תדגים את ההליך. לאחר בידוד מח העצם והבחנה BMDMs, להדביק את התאים עם וירוס שפעת A.חשב את נפח הנגיף הדרוש בריבוי זיהום של 20 יחידות יוצרות פלאק. הסר את המדיה מן BMDMs ולשטוף את התאים פעם אחת עם 500 מיקרוליטר של PBS. הוסף 450 מיקרוליטר של וירוס שפעת A ב- DMEM גלוקוז גבוה ללא FBS מומת חום לכל באר, ודגר על הצלחות ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת באינקובטור לח כדי לאפשר ספיגה.בתום הדגירה של שעה, מוסיפים 50 מיקרוליטר של FBS מומת בחום ומחזירים את הצלחות לאינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות בסך הכל. לאחר 12 שעות דגירה, מוציאים את הצלחת מהאינקובטור. לשאוף 150 מיקרוליטר של supernatant ולהשליך או לשמור את זה לניתוח supernatant.אל תסיר את הסופרנטנט שנותר. כעת, צרו את פתרון

evaluation-of-caspase-activation-to-assess-innate-immune-cell-death

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים את ההפעלה של חלבוני קספז במקרופאגים אנושיים באמצעות חלבוני כתב משלים פלואורסצנטיים דו-מולקולריים. הפרו-תחומים של קספאז-1 מתמזגים עם מקטעים לא פלואורסצנטיים של חלבוני ונוס, המגויסים לקומפלקסים דלקתיים. הקרבה של inflammasomes גורם refolding ו fluorescence של שברי נוגה, המאשר הפעלת קספז במקרופאגים.

הדמיה של הפעלת קספז במקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים

סרטון זה מדגים את ההערכה של הפעלות קספז מרובות במקרופאגים שמקורם במח עצם באמצעות גירוי עם נגיף השפעת. בעקבות ליזה מקרופאגים, נטרול חום של ליזט וצנטריפוגה, נאספים קספזות תוך תאיות לניתוח חיסוני עוקב.

הערכת ההפעלה של קספזות מרובות במקרופאגים

מבחני זמנית יכולים לספק מידע מועיל למנגנונים תאיים בסיסיים ולמנוע בזבוז של חומרים כימיים וניסויים חוזרים מיותרים. אנו מתארים כאן assay פעילות זמנית caspase-3/7, תוך שימוש בשיטות ניאון ומבוסס זורח, כדי לקבוע כדאיות תא במודל ההיפותלמוס במבחנה הבאה אתגר חמצוני עם חומצה פלמיטית.

שימוש בcaspase ריבוב Assay לקביעת אפופטוזיס בדגם נייד ההיפותלמוס

כדי לזהות תאים בריאים בחיות כולה המכילות רמות נמוכות של פעילות caspase, את biosensor הרגישות הגבוהה המיועד CaspaseTracker נוצרה עבור תסיסנית. Caspase-תלוי בפעילות biosensor מזוהית בתאים בריאים האריך ימים ברחבי האיברים הפנימיים של בעלי חיים בוגרים שגדלו בתנאים אופטימיזציה בהיעדר גירויי מוות.

In vivo biosensor Tracks ללא אפופטוטיים caspase פעילות תסיסנית

אנו מתארים את הגילוי של הפעלת inflammasome NLRP3 על בסיס הסלולר באמצעות מיקרוסקופ פלורסצנטיות, צביעת עבור קספאז פעיל-1 ואת המתאם, עולה. Assay שחרורו לקטט דהידרוגנאז מוצג כדי לזהות פירוק pyroptotic על בסיס האוכלוסייה. טכניקות אלו ניתן להתאים ללמוד היבטים רבים של ביולוגיה inflammasome.

זיהוי של Inflammasome ההפעלה ומוות תא Pyroptotic של מקרופאגים הנגזרות מח עצם מאתר

כאן, מוצגת זרימת עבודה ניסיונית המאפשרת זיהוי של עיבוד caspase-8 ישירות בקומפלקס האיתות מעורר המוות (DISC) וקובעת את ההרכב של קומפלקס זה. למתודולוגיה זו יש יישומים רחבים, החל מחשיפת המנגנונים המולקולריים של נתיבי מוות תאים ועד למודל הדינמי של רשתות אפופטוזיס.

מדידת הרכב של CD95 מוות גרימת איתות מורכב ועיבוד של Procaspase-8 במתחם זה

פרוטוקול זה מתאר את זרימת העבודה להשגת מקרופאגים שמקורם במונוציטים (MDM) מדגימות דם אנושיות, שיטה פשוטה להחדרה יעילה של כתבי השלמה פלואורסצנטית דו-עינית (BiFC) של קספאזה דלקתית ל-MDM אנושי מבלי להתפשר על הכדאיות וההתנהגות של התאים, וגישה מבוססת הדמיה למדידת הפעלת קספאזה דלקתית בתאים חיים.

הדמיה של קספאזות דלקתיות המושרות קרבה במקרופאגים שמקורם במונוציטים אנושיים

זיהום בנגיף שפעת A (IAV) מפעיל את הקספאזות שמבקעות חלבונים פונדקאיים ונוגפיים, אשר בתורם הם בעלי תפקידים פרו-ויראליים. על ידי שימוש במעכבים, הפרעות RNA, מוטגנזה מכוונת אתר, וטכניקות כתם מערביות ו- RT-qPCR, זוהו קספאזות בתאי יונקים נגועים המבקעים קורטקטין מארח והיסטון דאקטילאזות.

זיהוי קספאזות והמוטיבים שלהן שמבקעים חלבונים במהלך הידבקות בנגיף שפעת A

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שתי שיטות למדידת פעילות הקספז באמצעות מצע פלואורוגני באמצעות ציטומטריית זרימה או ספקטרופלואורומטר.

מדידת פעילות קספז באמצעות בדיקה פלואורומטרית או ציטומטריית זרימה

Cell בתיווך (CML) מבחני lymphocytotoxicity ניתן להשתמש כדי לבדוק את התגובות autoreactive מנגנוני המחקר של מוות של תאים במבחנה. עם זאת, שימוש לחיות תאים confocal טכניקות הדמיה מיקרוסקופית עם צבעי ניאון, סוג קינטיקה של מוות של תאים, כמו גם את המסלולים מנוצל ניתן ללמוד ביתר פירוט.

שיטות להעריך מתווכת בטא מוות של תאים על ידי לימפוציטים מסוג T ציטוטוקסיות

למדו להעריך הפעלת קספאזים בתאי מערכת החיסון לזיהוי מסלולי מוות תאי כולל פירופטוזיס ואפופטוזיס. פרוטוקול זה מספק שיטה פשוטה לניתוח מנגנוני מחלה ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות.

הערכת הפעלת קספז להערכת מוות מולד של תאי מערכת החיסון

גלה סרטונים נוספים