איסוף זרע וניתוח זרע בעזרת מחשב במודל הטלוסט מדאקה היפנית (Oryzias latipes)

טכניקה זו מאפשרת דגימה של דג מדוגמנית קטנה, מדאקה יפנית, ולחקור את איכותו באופן עקבי. באופן ספציפי איסוף זרע על ידי עיסוי בטן מאפשר דגימה חוזרת על אותו דג כמו גישה זו אינה פולשנית. יתר על כן, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת עבור שימור זרע קריו מאדאקה.

איכות הזרע היא אינדיקטור חיוני להצלחת ההפריה, ולכן פרמטר חשוב לניתוח במחקרים פיזיולוגיים אקולוגיים ויצרניים שלמים. כדי להתחיל, הכינו ספוג אחיזה רך, על ידי חיתוך שלו כך שיתאים לצלחת פטרי. חותכים קו ישר באמצע הספוג, שהוא ארוך מספיק כדי להחזיק את הדג בצד הגחון שלו למעלה.

לאחר הרדמת הדג, יבשו את בטן הדג על ידי ניגוב עדין במגבת נייר. הניחו את הדג בשוקת של ספוג ההחזקה הלח כשצד הגחון כלפי מעלה, כך שהזימים שלו נחשפים לתמיסת ההרדמה שבספוג. אם האזור סביב הקלואקה רטוב, יבשו בעדינות את החלק התחתון של הבטן עם מגבון טישו חד פעמי.

תחת מיקרוסקופ מנתח, מניחים את המיקרו פיפטה עם צינור שואב שואב מחובר כנגד הקלואקה של הדג. כעת עסו את בטן הדג על ידי סחיטה עדינה עם מלקחיים חלקים בקצה קהה בתנועה רוסטרלית עד קאודלית. להתאוששות הדג, שחררו אותו מהספוג למי ההתאוששות שהוכנו קודם לכן לפני החזרת הדג למערכת האקווריום.

העבירו את המילט שנאסף לתוך צינור המכיל תמיסת הפעלה מחוממת מראש ותמיסת פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות מכלול צינור השואף. הומוגניזציה של הזרע המדולל בעדינות על ידי הזזת הצינורות לפני הניתוח. לאחר הרדמת הדג ייבשו אותו כפי שהוכח קודם לכן והניחו את הדג תחת מיקרוסקופ מנתח כאשר צדו השמאלי הצדדי פונה כלפי מעלה.

באמצעות מספריים קטנים לנתח, לחתוך דש dorsally מן cloaca ולאחר מכן על פני הצלעות אל הזימים כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. מאתרים את האשכים וחותכים את החיבור בשני הקצוות בעזרת מלקחיים עדינים. הסר את האשכים והעבר אותם לצינור מוכן המכיל תמיסת הפעלה מחוממת מראש.

השתמש מלקחיים כדי למחוץ את האשכים מספר פעמים נגד הצד של הצינור כדי לשחרר את הזרע, אשר ניתן לדמיין על ידי המראה מעונן מעט של הפתרון. כדי להתחיל בניתוח, פתח את תוכנת ניתוח הזרע ובחר את מודול התנועתיות. הגדר את התצורות בתוכנה עבור כל הפרמטרים.

הניחו שקופית חד פעמית של 20 מיקרומטר שחוממה מראש מתחת למיקרוסקופ על במה מחוממת, בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס. צמחו את הדגימה לתוך התא בשקופית עד שהיא מתמלאת, אך ללא מילוי יתר. נגבו בזהירות דגימות עודפות מכניסת החדר כדי למנוע תנועת סחף של תאים בתמיסה.

בחר נתח כדי להסתכל על הדגימה מתחת למיקרוסקופ. ודא שהמיקרוסקופ ממוקד ובחר לנתח שוב כדי להקליט את הזרע בשדה. העבר את השקופית לאזור חדש של הדגימה במסגרת וחזור על ההליך עבור שלושה עד חמישה שדות ראייה שונים, תוך הימנעות מבועות אוויר, מסות תאים או לכלוכים.

כדי להציג את התוצאות, בחר תוצאות ולחץ פעמיים על שדה כדי להציג באופן חזותי את השדה הבודד או כדי לבדוק באופן ידני אם קיימים זרעונים עם תווית שגויה או ללא מעקב. במידת הצורך, לחץ לחיצה ימנית על זרעונים בודדים כדי לתייג מחדש את התנועתיות. במחקר הנוכחי, ניתוח זרע בסיוע מחשב שימש לרישום פרמטרים שונים של מהירות ותנועה.

הערכים המחושבים כוללים את מדד הישרות, מדד הלינאריות והתנדנדות. האוסמולריות של פתרונות ההפעלה השפיעה על תנועתיות הזרע מנתיחת האשכים. הזרע היה תנועתי במי האקווריום, אך תנועתי ב- HBSS עם אוסמולריות גבוהה ונמוכה.

עם זאת, תנועתיות מופחתת באופן משמעותי ב 36 מילי אוסמול לקילוגרם, לעומת פתרונות osmolality גבוה יותר. תנועתיות הושפעה גם משיטת איסוף הזרע, שבה הזרע תנועתי יותר באופן משמעותי בשיטת ניתוח האשכים בהשוואה לעיסוי בטן. כמו כן, אחוז גבוה יותר מהתאים היו פרוגרסיביים ויותר תאים היו בינוניים או מהירים.

אחוז התנועתיות וההתקדמות גבוה משמעותית בזרע המאוחסן בארבע מעלות צלזיוס או על קרח, בהשוואה לאחסון של 27 מעלות צלזיוס. גם תנאי הסביבה והדיור השפיעו מעט על תנועתיות הזרע. לא נצפה הבדל משמעותי בתנועתיות הזרע שנאסף לאחר ההשרצה ולפניה.

זכרים ששוכנו ללא נקבות במשך חודש הראו תנועתיות גבוהה, אך ההבדל לא היה משמעותי. לאיסוף זרע על ידי עיסוי בטן, יש צורך באימון כדי ללמוד את הלחץ והתנועה הנכונים של מלקחיים ולמנוע זיהום צואה. טכניקה זו תהיה שימושית מאוד כדי לחקור למשל, את ההשפעות של מזהמים מגוונים על פוריות הגבר במחקרים אקוטוקסיקולוגיים, שבהם מדאקה היא מודל נפוץ.