Name: איסוף זרע וניתוח זרע בעזרת מחשב במודל הטלוסט מדאקה היפנית (Oryzias latipes) (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 49 s
Description: למד שיטות לאיסוף זרע מדגי מדאקה יפניים באמצעות עיסוי בטני או ניתוח אשכים, וניתוח איכות הזרע בעזרת מערכת CASA. השיטות מאפשרות דגימות חוזרות ומדויקות למחקרי פוריות ואקוטוקסיקולוגיה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו מומנה על ידי האוניברסיטה הנורבגית למדעי החיים ותוכנית פולברייט האמריקאית. המחברים רוצים להודות לאנתוני פלטייה וללורדס קאריון ג'י טאן מ-NMBU על תחזוקת מתקני הדגים ולגיום גורמלין מ-ISC LPGP ב-INRAE (צרפת) על כך שסיפקו לדגים ולמעבדה שטח לבדיקה נוספת של שיטות אלה.

כל הניסויים והטיפול בבעלי חיים נערכו בהתאם להמלצות על רווחת בעלי חיים ניסיוניים באוניברסיטה הנורבגית למדעי החיים (NMBU). הניסויים בוצעו באמצעות זכרי מדאקה (זן Hd-rR) זכרים בוגרים (בני 6-9 חודשים) שגודלו ב-NMBU (Ås, נורבגיה). השיטות נבדקו לזמן קצר גם במדאקה יפנית זכרית בת 9 חודשים (זן CAB) שגדלה במכון המחקר הלאומי לחקלאות, מזון וסביבה (INRAE, רן, צרפת).
1. הכנת מכשירים ופתרונות
<ol><li>הכן תמיסת מלאי הרדמה (0.6% טריקאין).<ol><li>יש לדלל 0.6 גרם של טריקאין (MS-222) ב-100 מ"ל של מלח 10x פוספט בופר מלח (PBS).</li>
		<li>Aliquot 2 מ"ל של תמיסת מלאי ההרדמה לתוך 50 צינורות פלסטיק 2 מ"ל ולאחסן ב -20 מעלות צלזיוס עד לשימוש בהרדמה או המתת חסד.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו מי התאוששות (0.9% תמיסת נתרן כלורי [NaCl]).<ol><li>הוסיפו 27 גרם של NaCl ל-3 ליטר מי אקווריום.</li>
		<li>יש לאחסן את התמיסה בטמפרטורת החדר (RT) עד לשימוש.</li>
	</ol></li>
	<li>התאם את מדיום ההפעלה במידת הצורך (תמיסת המלח המאוזנת של האנק [HBSS]). הערה: HBSS ניתן לרכוש באופן מסחרי או מיוצר במעבדה (טבלת חומרים).<ol><li>מדוד את ה- pH של HBSS באמצעות מד pH. התאם את ה- pH במידת הצורך, באמצעות חומצה הידרוכלורית או נתרן הידרוקסיד, כך שה- pH הסופי הוא 7.1-7.3.</li>
		<li>מדוד את האוסמוליות של HBSS באמצעות אוסמומטר לדיווח עתידי. הערה: הטווח במוצר המסחרי הוא 266-294 mOsmol/kg; במחקר הנוכחי, האוסמולליות הייתה 287 mOsmol/kg. זה יכול להיות מדולל עם מים מזוקקים כדי להפחית את osmolality אם תרצה, אבל זה לא הכרחי כמו אין הבדל גדול בהפעלת זרע medaka ב 150-300 mOsmol / kg HBSS.</li>
		<li>אחסן את הפתרון ב-RT עד לשימוש.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו את ספוג האחיזה.<ol><li>חותכים ספוג רך כך שיתאים היטב לצלחת פטרי.</li>
		<li>חתכו קו ישר במרכז הספוג שהוא ארוך מספיק כדי לקלוט את הדג (3-4 ס"מ) ובעומק של כ-1 ס"מ (איור 1A). חריץ זה בספוג יחזיק את צד הגחון של הדג כלפי מעלה כדי לחשוף את הקלואקה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. איסוף זרע
הערה: איסוף זרע יכול להתבצע בשתי שיטות שונות: עיסוי בטן או דיסקציה של האשכים.
<ol><li>איסוף זרע על ידי עיסוי בטן<ol><li>הכן תמיסת הרדמה של 0.03% על ידי דילול צינור אחד של מלאי טריקאין (0.6%) ב -38 מ"ל של מי אקווריום במיכל זכוכית של 100 מ"ל.</li>
		<li>הכן את המכשירים, כולל מלקחיים חלקים בקצה קהה ומכלול מיקרופיפטה מזכוכית מכוילת בגודל 10 μL ומכלול צינורות אספירטור (איור 1A). הרטיבו את ספוג ההחזקה שהוכן בשלב 1.4 עם תמיסת ההרדמה.</li>
		<li>הכן צינורות עם 36 μL של הפתרון המפעיל לניתוח מיידי. מחממים מראש את התמיסה המפעילה באמבט מים או באינקובטור המוגדר ל-27 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות. הערה: למרות שניתן לנתח דגימות מדגים בודדים, ניתן להפחית את השונות האינדיבידואלית על ידי איגום דגימות ממספר זכרים באותו פתרון הפעלה. בעת איגום דגימות ממספר דגים, השתמש ב-36 μL של תמיסה מפעילה לכל דג. ייתכן שיהיה צורך להתאים דילול זה בהתאם למתח או לתנאי הגידול של המדאקה המשמשים מכיוון שגורמים אלה יכולים להשפיע על ריכוז הזרע ונפחו. תוכנית CASA תציין אם הריכוז גבוה מכדי לזהות זרע.</li>
		<li>הרדמת הדג על ידי הכנסתו לתמיסת הרדמה למשך 30-90 שניות. הערה: משך ההרדמה חייב להיות מותאם כפי שהוא משתנה בהתאם לגודל הדג. כדי להבטיח כי הדג הוא מורדם לחלוטין, בעדינות לצבוט את peduncle caudal עם מלקחיים. אם הדג אינו מגיב, ניתן להתחיל את העיסוי.</li>
		<li>הוציאו את הדג מתמיסת ההרדמה והשתמשו במגבת נייר או נגבו בעדינות כדי לייבש את בטן הדג. הניחו את הדג בשוקת של הגחון הספוגי הלח כלפי מעלה, כך שהזימים שלו ייחשפו לתמיסת ההרדמה שבספוג (איור 1B).</li>
		<li>אם האזור סביב הקלואקה רטוב, יבשו בעדינות את החלק התחתון של הדג עם מגבון טישו חד פעמי.</li>
		<li>הניחו את הדגים בספוג ההחזקה תחת מיקרוסקופ מנתח והניחו את המיקרופיפטה עם צינור שואב שמחובר כנגד הקלואקה של הדג (איור 1C).</li>
		<li>עסו את הבטן של הדגים על ידי סחיטה עדינה עם מלקחיים חלקים בקצה קהה בתנועה רוסטרלית לקאודלית ובמקביל מציצה כדי לאסוף את המילט המגורש לתוך הפיפטה (איור 1D).</li>
		<li>שחררו את הדג מהספוג אל מי ההתאוששות. אפשרו להם להתאושש בתמיסה במשך 15 דקות לפחות לפני שתחזירו אותם למערכת האקווריום.</li>
		<li>מעבירים את המילט לצינור מוכן עם תמיסת הפעלה מחוממת מראש ופיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים על ידי מציצה ונשיפה על מכלול צינור השואף.</li>
		<li>הומוגניזציה של הזרע המדולל בעדינות על ידי הזזת הצינורות לפני הניתוח. הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, נתח דגימות מיד (לדוגמה, 5 שניות) לאחר ההפעלה. במדאקה, הניתוח עשוי להתעכב, במידת הצורך, מכיוון שהזרע נשאר תנועתי במשך מספר שעות, אך הזמן צריך להישאר עקבי בין הדגימות ככל שהתנועתיות פוחתת עם הזמן.</li>
	</ol></li>
	<li>איסוף זרע על ידי נתיחת אשכים<ol><li>הכן תמיסת המתת חסד של 0.08% על ידי דילול שתי שפופרות של מלאי טריקאין (0.6%) ב -26 מ"ל של מי אקווריום במיכל זכוכית של 100 מ"ל.</li>
		<li>הכינו כלי דיסקציה, כולל מלקחיים קהים ועדינים ומספריים קטנים לחיתוך (איור 1E).</li>
		<li>הכן צינור לכל דגימה עם 120 μL של פתרון הפעלה לניתוח מיידי. מחממים מראש את התמיסה המפעילה באמבט מים או באינקובטור המוגדר ל-27 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות. הערה: למרות שניתן לנתח דגימות מדגים בודדים, ניתן להפחית את השונות האינדיבידואלית על ידי איגום דגימות ממספר זכרים באותו פתרון הפעלה. לאיגום דגימות ממספר דגים, השתמש ב-120 μL של תמיסה מפעילה לכל דג. ייתכן שיהיה צורך להתאים דילול זה בהתאם למתח או לתנאי הגידול של המדאקה המשמשים מכיוון שגורמים אלה יכולים להשפיע על ריכוז הזרע ונפחו. תוכנית CASA תציין אם הריכוז גבוה מכדי לזהות זרע.</li>
		<li>להרדים את הדג על ידי הכנסתו לתמיסת ההרדמה של 0.08% למשך 30-90 שניות. הערה: משך הזמן תלוי בגודל הדג. כדי להבטיח שהדג מורדם, המתן עד שתנועות האופרקולום ייפסקו. הדגים לא צריכים להגיב למגע של מלקחיים.</li>
		<li>הסר את הדג מתמיסת המתת החסד ויבש בעדינות את הדג במגבת נייר או נגב בעדינות. הערה: בשלב זה, ניתן לשקול את הדג כדי לחשב מאוחר יותר את האינדקס הגונדוסומטי (GSI, משקל גונדל / משקל גוף).</li>
		<li>הניחו את הדג מתחת למיקרוסקופ חותך כשצדו השמאלי הצדדי פונה כלפי מעלה (איור 1F).</li>
		<li>באמצעות מספריים קטנים לנתח, חותכים דש באופן דורסלי מהקלואקה, ואז חוצים את הצלעות אל הזימים כדי לחשוף את האיברים הפנימיים (איור 1G).</li>
		<li>אתרו את האשכים, חתכו את החיבור בשני הקצוות בעזרת מלקחיים עדינים והסירו את האשכים (איור 1H). הערה: כדי לחשב את ה- GSI, ניתן לשקול את האשכים בשלב זה. יש לעבוד במהירות כדי למנוע ייבוש של הרקמה.</li>
		<li>העבירו את האשכים לצינור מוכן עם תמיסת ההפעלה שחוממה מראש.</li>
		<li>השתמש מלקחיים כדי למחוץ את האשכים מספר פעמים נגד הצד של הצינור כדי לשחרר את הזרע. שחרור הזרע בדרך כלל יכול להיות חזותי ויהפוך את הפתרון מעט מעונן.</li>
		<li>הומוגניזציה של הזרע המדולל בעדינות על ידי הזזת הצינורות לפני הניתוח. הערה: לקבלת התוצאות הטובות ביותר, נתח דגימות מיד (לדוגמה, 5 שניות) לאחר ההפעלה. במדאקה, הניתוח עשוי להתעכב, במידת הצורך, מכיוון שהזרע נשאר תנועתי במשך מספר שעות, אך הזמן צריך להישאר עקבי בין הדגימות ככל שהתנועתיות פוחתת עם הזמן.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64326/64326fig01.jpg"> איור 1: איסוף מילט על ידי עיסוי בטן (A-D) ודיסקציה של האשכים (E-H). (A) מכשירים לעיסוי בטן: ספוג מחזיק, מלקחיים חלקים קהים, ומיקרופיפט זכוכית מכויל חד פעמי 10 μL עם מכלול צינור אספירטור; (B) מיקום הדגים בספוג ההחזקה, כאשר הזימים חשופים להרדמה בספוג ובקלואקה הפונים כלפי מעלה; (C) מיקום של מלקחיים חלקים קהים על הבטן ומיקרופיפטה כנגד קלואקה; (D) מילט במיקרופיפטה לאחר עיסוי עדין ומציצה. (E) מכשירים לנתיחת אשכים: מלקחיים קהים, מלקחיים עדינים ומספריים קטנים; (ו) מיקום הדגים לצורך נתיחת אשכים; (ז) מבט רוחבי על איברים פנימיים; (H) הסר את האשכים על ידי חיתוך החיבור בשני הקצוות עם מלקחיים עדינים. סרגל קנה מידה: 2 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64326/64326fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>
3. ניתוח זרע עם מערכת CASA
<ol><li>מערכת CASA (SCA Evolution) צריכה להיות מוגדרת על פי המדריך עם מיקרוסקופ באמצעות מסנן ירוק ומטרה פי 10 עם ניגודיות פאזה.</li>
	<li>הכינו שקופיות חד פעמיות של 20 מיקרומטר על ידי חימום מראש על צלחת חימום או באינקובטור שנקבע ל-27 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות לפחות.</li>
	<li>פתח את תוכנת ניתוח הזרע ובחר את מודול התנועתיות.</li>
	<li>הגדר את התצורה של המדאקה כפי שמוצג באיור 2B.</li>
	<li>הניחו שקופית חד פעמית של 20 מיקרומטר מתחת למיקרוסקופ על במה מחוממת בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>צמחו את הדגימה לתוך התא בשקופית עד שהיא ממלאת את התא מבלי למלא אותו יתר על המידה. נגבו בזהירות דגימות עודפות מהכניסה לתא בעזרת קצה כותנה או נגבו בעדינות כדי למנוע תאים צפים.</li>
	<li>בחר נתח כדי להסתכל על הדגימה מתחת למיקרוסקופ. הערה: אם סמל המיקרוסקופ אדום, יש להתאים את תאורת המיקרוסקופ כדי שהתוכנית תעקוב אחר הזרע במדויק. התאם את בהירות המיקרוסקופ, כך שתנועת הזנב של הזרע נראית בבירור. הסמל צריך להיות כחול.</li>
	<li>ודא שהמיקרוסקופ ממוקד ובחר נתח שוב כדי להקליט את הזרע בשדה. הזז את השקופית כך שאזור חדש של הדוגמה יהיה במסגרת וחזור על הפעולה כדי ללכוד עבור 3-5 שדות תצוגה שונים. הימנע משדות עם בועות אוויר, מסות תאים או חפצים.</li>
	<li>בחר תוצאות כדי להציג את התוצאות. הערה: אם השדות בדף התוצאות מסומנים בקו אדום, פעל בהתאם להנחיות המערכת כדי למחוק את השדות המשתנים מדי בריכוז או בתנועתיות.</li>
	<li>לחץ פעמיים על שדה כדי להציג את התוצאות עבור השדה הבודד או כדי לבדוק באופן ידני אם קיימים זרעונים עם תווית שגויה או ללא מעקב. לחצו לחיצה ימנית על זרעונים בודדים כדי לסמן מחדש את התנועתיות, במידת הצורך (איור 2A).</li>
</ol><img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64326/64326fig02.jpg"> איור 2: צילום מסך של תוכנת SCA Evolution . (A) תוצאות מעקב זרע עבור שדה אחד. הצג נתוני שדה בצד ימין ולחץ פעמיים על זרעונים כדי להציג נתונים בודדים; (B) סיכום תוצאות עבור כל השדות עם תפריט תצורה פתוח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64326/64326fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של נתון זה.</a>

למחברים אין מה לחשוף.

אוסמולליות היא גורם חשוב בהפעלת זרע דגים36,37. באופן כללי, זרעונים הם תנועתיים באשכים והופכים תנועתיים במדיה שהיא היפרוסמוטית ביחס לנוזל הזרע עבור דגים ימיים, והיפו-אוסמוטי ביחס לנוזל הזרע עבור דגי מים מתוקים37. בדומה לדם, פלזמת הזרע בדגי מים מתוקים בדרך כלל נמוכה מזו של דגי ים (כ-300 מאוסמול/ק"ג לעומת 400 מאוסמול/ק"ג)22,37. לפיכך, זרע דגים מופעל בדרך כלל במגע עם המים שבהם הם חיים,...

מדאקה יפנית היא דג טלוסט קטן המטיל ביצים במים מתוקים שמקורו במזרח אסיה. מדאקה הפכה למערכת מודל מצוינת של בעלי חוליות עבור אקוטוקסיקולוגיה, גנטיקה התפתחותית, גנומיקה, ביולוגיה אבולוציונית ומחקרי פיזיולוגיה 1,2. בדומה לדגי הזברה הפופולריים, הם קלים יחסית לגידול ועמידים מאוד למחלות דגים נפוצות רבות 1,2. ישנם מספר יתרונות לשימוש במדאקה כמודל, כולל זמן דור קצר, עוברים שקופים 1,2 וגנום מרוצף3. שלא כמו דגי זברה, למדאקה יש גן הקובע את המין4 וכן טמפרטורה גבוהה (בין 4-40 מעלות צלזיוס) וסבילות מליחות (מינים אוריהלינים)5. כמו כן, כלים גנטיים ואנטומיים רבים, כמו גם פרוטוקולים 6,7,8,9,10,11,12, פותחו במדאקה כדי להקל על חקר הביולוגיה שלה.
רבייה היא פונקציה פיזיולוגית חיונית מכיוון שהיא מאפשרת למין להנציח. רבייה של בעלי חוליות דורשת מספר עצום של אירועים מתוזמרים במדויק, כולל ייצור ביציות אצל נקבות וייצור זרע אצל זכרים. זרע הם תאים ייחודיים, המיוצרים בתהליך מורכב של זרעונים, שבו ישנם מספר מחסומים במקום כדי להבטיח אספקה של מוצר באיכות גבוהה13. איכות הגמטה הפכה למוקד בחקלאות ימית ובחקר אוכלוסיות דגים בשל השפעתה על הצלחת ההפריה והישרדות הזחלים. איכות הזרע היא, אם כן, אינדיקטור חשוב לפוריות הגבר אצל בעלי חוליות.
שלושה גורמים שימושיים להערכת איכות זרע הדגים הם תנועתיות, התקדמות ואריכות ימים. תנועתיות באחוזים ותנועתיות פרוגרסיבית הם אינדיקטורים נפוצים לאיכות הזרע שכן תנועה פרוגרסיבית נחוצה ומתואמת מאוד עם הצלחת ההפריה14,15. משך התנועה הוא גם אינדיקטור חשוב בדגים שכן הזרע נשאר תנועתי באופן מלא במשך פחות מ -2 דקות ברוב מיני הטלוסט ומסלול הזרע הוא בדרך כלל פחות ליניארי מאשר ביונקים15. עם זאת, מחקרים רבים שהעריכו את תנועתיות הזרע בעבר הסתמכו על שיטות סובייקטיביות או כמותיות למחצה לניתוח זרע15,16. לדוגמה, תנועתיות הזרע במדאקה הוערכה בעבר באופן חזותי תחת מיקרוסקופ17. כמו כן, הוא הוערך על ידי רישום תנועת זרע ושימוש בתוכנת הדמיה למיזוג מסגרות ומדידת נתיב שחייה ומהירות18,19,20. גישות כאלה לעתים קרובות חסרות חוסן, ומספקות תוצאות שונות בהתאם לאדם המבצע את הניתוח 15,21.
ניתוח זרע בעזרת מחשב (CASA) פותח בתחילה עבור יונקים. CASA היא שיטה כמותית מהירה להערכת איכות הזרע על ידי הקלטה ומדידה של מהירות ומסלול באופן אוטומטי15. בדגים, הוא שימש במינים שונים כדי לפקח על ההשפעות של כמה מזהמי מים על איכות הזרע, לזיהוי אבות מעניינים כדי לשפר broodstock, כדי לשפר את היעילות של שימור בהקפאה ואחסון, כדי לייעל את התנאים להפריה15. לכן, זהו כלי רב עוצמה להערכה אמינה של איכות הזרע במינים שונים של בעלי חוליות. עם זאת, בשל המגוון החשוב באסטרטגיות הרבייה בין דגים, הזרע של דגי הטלוסט שונה מזה של יונקים וממין דג אחד למשנהו. לדגי טלוסט, המפרים בעיקר ביציות חיצונית על ידי שחרור גמטות למים, יש זרע מרוכז מאוד שהוא פשוט יחסית במבנה ללא אקרוזום, בניגוד ליונקים, אשר מפרים פנימית ולכן אינם צריכים לפצות על דילול במים, אך כן צריכים לעמוד בנוזלים צמיגים יותר14. בנוסף, זרע מרוב הדגים נע במהירות אך הוא תנועתי לחלוטין במשך פחות מ -2 דקות לאחר ההפעלה, אם כי ישנם מספר יוצאים מן הכלל15,22. מכיוון שהתנועתיות יכולה לרדת במהירות אצל רוב הדגים, יש לנקוט בזהירות רבה עם תזמון הניתוח לאחר ההפעלה בעת קביעת פרוטוקול ניתוח זרע לדגים.
רבייה היא אחד התחומים בביולוגיה שבהם טלאוסטים ומדאקה שימשו באופן נרחב כאורגניזמי מודל. ואכן, זכרי מדאקה מראים התנהגויות רבייה וחברתיות מעניינות, כגון שמירה עלהזדווגות 23,24. בנוסף, קיימים מספר קווים מהונדסים כדי לחקור את השליטה הנוירואנדוקרינית של רבייה במין זה25,26,27. דגימת זרע, הליך שהוא פשוט יחסית בדגים גדולים יותר, יכולה להיות מסובכת יותר בדגי מודל קטנים מכיוון שהם מייצרים פחות זרע והם עדינים יותר. מסיבה זו, רוב המחקרים הכוללים דגימת זרע בתמצית medaka milt (זרע דגים) על ידי ריסוק אשכים מנותחים 17,28,29,30. כמה מחקרים משתמשים גם בעיסוי בטן שונה כדי לבטא את המילט ישירות להפעלתמדיום 18,19,20; עם זאת, בשיטה זו קשה לדמיין את כמות וצבע של Milt שחולץ. אצל דגי זברה, עיסוי בטן משמש בדרך כלל כדי להביע milt, אשר נאסף מיד בצינור נימי31,32,33. שיטה זו מאפשרת להעריך את נפח המילט, כמו גם תצפית על צבע השפיכה, המהווה אינדיקטור מהיר ופשוט לאיכות הזרע32,33. לכן, פרוטוקול ברור ומתואר היטב לאיסוף וניתוח זרע חסר למדקה.
מאמר זה מתאר אפוא שתי שיטות לאיסוף זרע בדגם הקטן של דג מדאקה יפני: דיסקציה של האשכים ועיסוי בטן עם צינורות נימיים. הוא מדגים כי שתי הגישות אפשריות למדאקה ומראה כי ניתן לבצע עיסוי בטן מספר חוזר ונשנה של פעמים כאשר הדג מתאושש במהירות מההליך. הוא גם מתאר פרוטוקול לניתוח זרע בסיוע מחשב במדאקה כדי למדוד באופן מהימן מספר אינדיקטורים חשובים לאיכות הזרע של medaka (תנועתיות, התקדמות, אריכות ימים וריכוז זרע יחסי). הליכים אלה, המפורטים עבור מודל טלוסט קטן ושימושי זה, ישפרו מאוד את ההבנה של הגורמים הסביבתיים, הפיזיולוגיים והגנטיים המשפיעים על הפוריות אצל זכרים בעלי חוליות.

<table><tbody><tr><td>צינורות 1.5 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>ניתן להשתמש בכל מותג סטנדרטי</td></tr><tr><td>10 ומיקרו; L מכלול צינור מיקרופיפטה וצינור שואב זכוכית מכויל חד פעמי</td><td>Drummond</td><td>2-000-010</td><td></td></tr><tr><td>10x מטרה עם ניגודיות פאזה</td><td>ניקון</td><td>MRP90100</td><td></td></tr><tr><td>2 צינורות 2 מ"ל</td><td>Axygen</td><td>MCT-200-c-s</td><td>ניתן להשתמש בכל מותג סטנדרטי ניתן להשתמש</td></tr><tr><td>במלקחיים קהים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים חלקים קהים</td><td>Millipore</td><td>XX6200006P</td><td></td></tr><tr><td>חד פעמי 20 מיקרון תא ספירה שקופית</td><td>מיקרופטית</td><td>20.2.25&nbsp;</td><td>Leja 2 מגלשות קאמריות</td></tr><tr><td>ניתוח מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>SZX7</td><td>ניתן להשתמש בכל מותג סטנדרטי</td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>עדינים Fine Science Tools</td><td>11253-20</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Sigmaaldrich</td><td>H8264-1L</td><td></td></tr><tr><td>ספוג מחזיק מיקרוסקופ</td> הפוך <td>מתוצרת</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>עצמית Nikon</td><td>Eclipse Ts2R</td><td></td></tr><tr><td>SCA Evolution</td><td>Microptic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים לניתוח קטן</td><td>Fine Science Tools</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td> <td>Sigmaaldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת שולחן</td><td>Labnet</td><td>C1301B</td><td></td></tr><tr><td>טריקאין</td><td>Sigmaaldrich</td><td>A5040</td><td></td></tr></tbody></table>

איסוף זרע וניתוח זרע בעזרת מחשב במודל הטלוסט מדאקה היפנית (oryzias latipes)

Sperm Collection and Computer-Assisted Sperm Analysis in the Teleost Model Japanese Medaka (Oryzias latipes)

מדאקה יפנית (Oryzias latipes) היא דג טלוסט ומודל מתפתח של בעלי חוליות למחקר אקוטוקסיקולוגיה, התפתחות, גנטיקה ופיזיולוגיה. מדאקה משמשת באופן נרחב גם כדי לחקור רבייה של בעלי חוליות, שהיא פונקציה ביולוגית חיונית מכיוון שהיא מאפשרת למין להנציח. איכות הזרע היא אינדיקטור חשוב לפוריות הגבר, ובכך להצלחת הרבייה. טכניקות להפקת זרע וניתוח זרע מתועדות היטב עבור מינים רבים, כולל דגי טלוסט. איסוף זרע הוא פשוט יחסית בדגים גדולים יותר, אך יכול להיות מסובך יותר בדגים קטנים מכיוון שהם מייצרים פחות זרע והם עדינים יותר. מאמר זה, אם כן, מתאר שתי שיטות לאיסוף זרע בדג המודל הקטן, מדאקה יפנית: דיסקציה של האשכים ועיסוי בטן. מאמר זה מדגים כי שתי הגישות אפשריות עבור medaka ומראה כי עיסוי בטן יכול להתבצע מספר חוזר של פעמים כאשר הדגים מתאוששים במהירות מההליך. מאמר זה מתאר גם פרוטוקול לניתוח זרע בעזרת מחשב במדאקה כדי להעריך באופן אובייקטיבי מספר אינדיקטורים חשובים לאיכות הזרע של medaka (תנועתיות, התקדמות, משך תנועתיות, ריכוז יחסי). הליכים אלה, המפורטים עבור מודל טלוסט קטן ושימושי זה, ישפרו מאוד את ההבנה של הגורמים הסביבתיים, הפיזיולוגיים והגנטיים המשפיעים על הפוריות אצל זכרים בעלי חוליות.

סוג הנתונים שהתקבלו ניתוח תנועתיות זרע מתוכנת SCA Evolution מספק נתונים על תנועתיות (אחוז הזרע התנועתי והלא תנועתי), כמו גם על התקדמות (אחוז הזרע המתקדם והלא פרוגרסיבי), ומהירות (אחוז הזרע המהיר, הבינוני והאיטי). הוא גם משלב התקדמות ומהירות (פרוגרסיבי מהיר, פרוגרסיבי בינוני, לא פרוגרסיבי). תוויות אלה מבוססות על מדידות (איור 3A) וחישובים (איור3B) של תנועת זרעונים, המסופקים על ידי התוכנית (טבלה משלימה 1).</...

מאמר זה מתאר שתי שיטות מהירות ויעילות לאיסוף זרע מדאקה דג מודל קטן (Oryzias latipes), כמו גם פרוטוקול להערכה אמינה של איכות הזרע באמצעות ניתוח זרע בעזרת מחשב (CASA).

איסוף זרע וניתוח זרע בעזרת מחשב במודל הטלוסט מדאקה היפנית (Oryzias latipes)

Japanese medaka (Oryzias latipes) is a teleost fish and&#160;an emerging vertebrate model for ecotoxicology, developmental, genetics, and physiology ...

טכניקה זו מאפשרת דגימה של דג מדוגמנית קטנה, מדאקה יפנית, ולחקור את איכותו באופן עקבי. באופן ספציפי איסוף זרע על ידי עיסוי בטן מאפשר דגימה חוזרת על אותו דג כמו גישה זו אינה פולשנית. יתר על כן, טכניקה זו יכולה להיות מיושמת עבור שימור זרע קריו מאדאקה.איכות הזרע היא אינדיקטור חיוני להצלחת ההפריה, ולכן פרמטר חשוב לניתוח במחקרים פיזיולוגיים אקולוגיים ויצרניים שלמים. כדי להתחיל, הכינו ספוג אחיזה רך, על ידי חיתוך שלו כך שיתאים לצלחת פטרי. חותכים קו ישר באמצע הספוג, שהוא ארוך מספיק כדי להחזיק את הדג בצד הגחון שלו למעלה.לאחר הרדמת הדג, יבשו את בטן הדג על ידי ניגוב עדין במגבת נייר. הניחו את הדג בשוקת של ספוג ההחזקה הלח כשצד הגחון כלפי מעלה, כך שהזימים שלו נחשפים לתמיסת ההרדמה שבספוג. אם האזור סביב הקלואקה רטוב, יבשו בעדינות את החלק התחתון של הבטן עם מגבון טישו חד פעמי.תחת מיקרוסקופ מנתח, מניחים את המיקרו פיפטה עם צינור שואב שואב מחובר כנגד הקלואקה של הדג. כעת עסו את בטן הדג על ידי סחיטה עדינה עם מלקחיים חלקים בקצה קהה בתנועה רוסטרלית עד קאודלית. להתאוששות הדג, שחררו אותו מהספוג למי ההתאוששות שהוכנו קודם לכן לפני החזרת הדג למערכת האקווריום.העבירו את המילט שנאסף לתוך צינור המכיל תמיסת הפעלה מחוממת מראש ותמיסת פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים באמצעות מכלול צינור השואף. הומוגניזציה של הזרע המדולל בעדינות על ידי הזזת הצינורות לפני הניתוח. לאחר הרדמת הדג ייבשו אותו כפי שהוכח קודם לכן והניחו את הדג תחת מיקרוסקופ מנתח כאשר צדו השמאלי הצדדי פונה כלפי מעלה.באמצעות מספריים קטנים לנתח, לחתוך דש dorsally מן cloaca ולאחר מכן על פני הצלעות אל הזימים כדי לחשוף את האיברים הפנימיים. מאתרים את האשכים וחותכים את החיבור בשני הקצוות בעזרת מלקחיים עדינים. הסר את האשכים והעבר אותם לצינור מוכן המכיל תמיסת הפעלה מחוממת מראש.השתמש מלקחיים כדי למחוץ את האשכים מספר פעמים נגד הצד של הצינור כדי לשחרר את הזרע, אשר ניתן לדמיין על ידי המראה מעונן מעט של הפתרון. כדי להתחיל בניתוח, פתח את תוכנת ניתוח הזרע ובחר את מודול התנועתיות. הגדר את התצורות בתוכנה עבור כל הפרמטרים.הניחו שקופית חד פעמית של 20 מיקרומטר שחוממה מראש מתחת למיקרוסקופ על במה מחוממת, בטמפרטורה של 27 מעלות צלזיוס. צמחו את הדגימה לתוך התא בשקופית עד שהיא מתמלאת, אך ללא מילוי יתר. נגבו בזהירות דגימות עודפות מכניסת החדר כדי למנוע תנועת סחף של תאים בתמיסה.בחר נתח כדי להסתכל על הדגימה מתחת למיקרוסקופ. ודא שהמיקרוסקופ ממוקד ובחר לנתח שוב כדי להקליט את הזרע בשדה. העבר את השקופית לאזור חדש של הדגימה במסגרת וחזור על ההליך עבור שלושה עד חמישה שדות ראייה שונים, תוך הימנעות מבועות אוויר, מסות תאים או לכלוכים.כדי להציג את התוצאות, בחר תוצאות ולחץ פעמיים על שדה כדי להציג באופן חזותי את השדה הבודד או כדי לבדוק באופן ידני אם קיימים זרעונים עם תווית שגויה או ללא מעקב. במידת הצורך, לחץ לחיצה ימנית על זרעונים בודדים כדי לתייג מחדש את התנועתיות. במחקר הנוכחי, ניתוח זרע בסיוע מחשב שימש לרישום פרמטרים שונים של מהירות ותנועה.הערכים המחושבים כוללים את מדד הישרות, מדד הלינאריות והתנדנדות. האוסמולריות של פתרונות ההפעלה השפיעה על תנועתיות הזרע מנתיחת האשכים. הזרע היה תנועתי במי האקווריום, אך תנועתי ב- HBSS עם אוסמולריות גבוהה ונמוכה.עם זאת, תנועתיות מופחתת באופן משמעותי ב 36 מילי אוסמול לקילוגרם, לעומת פתרונות osmolality גבוה יותר. תנועתיות הושפעה גם משיטת איסוף הזרע, שבה הזרע תנועתי יותר באופן משמעותי בשיטת ניתוח האשכים בהשוואה לעיסוי בטן. כמו כן, אחוז גבוה יותר מהתאים היו פרוגרסיביים ויותר תאים היו בינוניים או מהירים.אחוז התנועתיות וההתקדמות גבוה משמעותית בזרע המאוחסן בארבע מעלות צלזיוס או על קרח, בהשוואה לאחסון של 27 מעלות צלזיוס. גם תנאי הסביבה והדיור השפיעו מעט על תנועתיות הזרע. לא נצפה הבדל משמעותי בתנועתיות הזרע שנאסף לאחר ההשרצה ולפניה.זכרים ששוכנו ללא נקבות במשך חודש הראו תנועתיות גבוהה, אך ההבדל לא היה משמעותי. לאיסוף זרע על ידי עיסוי בטן, יש צורך באימון כדי ללמוד את הלחץ והתנועה הנכונים של מלקחיים ולמנוע זיהום צואה. טכניקה זו תהיה שימושית מאוד כדי לחקור למשל, את ההשפעות של מזהמים מגוונים על פוריות הגבר במחקרים אקוטוקסיקולוגיים, שבהם מדאקה היא מודל נפוץ.

sperm-collection-computer-assisted-sperm-analysis-teleost-model

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

זוהי שיטה להפקת דיפלואידי gynogenetic עוברי דג הזברה (אשר עוברים רק תרומה גנטית מגיע מהאם) על ידי חסימת חלוקת meiotic מחרה מחזיק אחריה מיד לאחר ההפריה עם זרע אור אולטרה סגול מומת. עוברים EP אינם הומוזיגוטים במלואה עקב רקומבינציה במהלך החלוקה meiotic הראשון, אולם הם הומוזיגוטים בכלל לוקוסים שלא היה מופרד centromere שלהם על ידי רקומבינציה.

ביצוע דיפלואידי דג הזברה Gynogenetic על ידי לחץ מוקדמת

Medaka ו דג הזברה משלימות לניתוח גנטי של פונקציות הגנום החולייתנים. פרוטוקול זה מדגיש את נקודות המפתח עבור microinjection מוצלח לעוברי medaka, טכניקה חשובה לניתוח העוברית ואת גנטי באמצעות medaka ו דג הזברה במעבדה.

Microinjection עוברים Medaka לשימוש כמודל אורגניזם גנטי

אנו מדווחים כאן הביטוי חזק ויעיל של חלבוני ניאון לאחר הזרקת mRNA לביציות מופרה של lanceolatum מיתרני הראש. הפיתוח של טכניקת microinjection בchordate בסיס זה יסלול את הדרך למרחיקה לכת חידושים טכניים במערכת מודל מתפתח זה, לרבות בתחום ההדמיה vivo ומניפולציות גנטיות ספציפית.

ביטוי של חלבונים ניאון ב Lanceolatum מיתרני הראש על ידי הזרקת mRNA לביציות מופרה

דג הזברה הוא אורגניזם מודל חשוב לחקר הומאוסטזיס אנרגטי.  על ידי שימוש במחוון חמצון חיזור רגיש NADH2, alamar Blue, פיתחנו בדיקה המודדת את קצב חילוף החומרים של זחלי דג הזברה בפורמט צלחת של 96 בארות וניתן ליישם אותה לגילוי תרופות או גנים.

תפוקה גבוהה<em&gt; Danio rerio</em&gt; Assay הוצאה אנרגיה

דגי מעבדה קטנים הפכו למודלים פופולריים לחקר עצמות על המנגנונים העומדים בבסיס הפרעות בעצמות אנושיות ולסינון תרופות מווסתות עצם. בדוח זה, אנו מתארים פרוטוקול להערכת ההשפעה של אלנדרונאט על תאי עצם בזחלי מדקה עם נגעים אוסטאופורוטיים.

ותרופות טיפול<em&gt; In vivo</em&gt; הדמיה של אוסטאובלסטים-osteoclast אינטראקציות במודל אוסטאופורוזיס Medaka דגים

בפרוטוקול הנוכחי מתאר הליך של דגים זרע הערכה באמצעות ניתוח המחשב בסיוע זרע, התקני קירור. התוכנה נותנת מהירה, מדויקת, ניתוח כמותי של איכות הזרע דגים בהתבסס על spermatozoa מורפולוגית, יכול להיות כלי שימושי חקלאות מים כדי לשפר את ההצלחה רבייה.

הערכת זרע דגים באמצעות תוכנה, התקני קירור

פרוטוקולים עבור הקפאה קריוגנית, התבגרות, זרע, צלופח האירופית שופרו בשנים האחרונות. מאמר זה מתאר את הפרוטוקול הטוב ביותר הזמינים באמצעות גונדוטרופין כוריוני אנושי (hCG) עבור גרימת ההבשלה, מתנול כמו cryoprotectant.

טיפול וצלופחים טיפול של זכר האירופית (אנגווילה אנגווילה) התבגרות הורמונלית, הקפאה קריוגנית זרע

הפריה חוץ גופית היא טכניקה בשימוש נפוץ עם מגוון רחב של אורגניזמים מודל לשמור על אוכלוסיות מעבדה לייצר עוברים מסונכרנים עבור יישומים במורד הזרם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המיישם טכניקה זו עבור אוכלוסיות שונות של הדגים טטרה מקסיקני, Astyanaxמקסיקני.

אוסף המשחק ו הפריה חוץ גופית של Astyanax מקסיאנוס

המאמר מתאר פרוטוקול מהיר כדי gonadectomize ולדגום דם מדג הטלוסט הקטן, באמצעות medaka יפני(Oryzias latipes) כמודל, כדי לחקור את התפקיד של סטרואידים מיניים בפיזיולוגיה של בעלי חיים.

הליכי גונדקטומיה ודגימה בדם במודל טלוסט קטן מדאקה(Oryzias latipes)

טכנולוגיות CRISPR-Cas חוללו מהפכה בתחום עריכת הגנום. עם זאת, מציאת ובידוד עריכת קו הנבט הרצויה נותרה צוואר בקבוק משמעותי. לכן, פרוטוקול זה מתאר שיטה חזקה לסינון מהיר של זרע דג זברה מוזרק F0 CRISPR לעריכות קו הנבט באמצעות טכניקות PCR סטנדרטיות, תקציר הגבלה ואלקטרופורזה בג'ל.

בדיקת זרע לבידוד מהיר של עריכות נבט בדגי זברה

למד שיטות לאיסוף זרע מדגי מדאקה יפניים באמצעות עיסוי בטני או ניתוח אשכים, וניתוח איכות הזרע בעזרת מערכת CASA. השיטות מאפשרות דגימות חוזרות ומדויקות למחקרי פוריות ואקוטוקסיקולוגיה.

איסוף זרע וניתוח זרע בעזרת מחשב במודל הטלוסט מדאקה היפנית (Oryzias latipes)

גלה סרטונים נוספים