בידוד הלימפה המזנטרית הזורמת בעכברים לכימות קינטיקה של ספיגת שומנים תזונתיים והפרשת כילומיקרון
30 בנובמבר 2022
הפרוטוקול הנוכחי מתאר פרוטוקול כירורגי מפורט לבידוד לימפה זורמת במעי בתגובה לעירויי חומרים מזינים תוך תריסריונים בעכברים. זה מאפשר קביעה פיזיולוגית של ספיגת שומנים כוללת במעי וסינתזה והפרשה של כילומיקרון בתגובה לחומרים מזינים ניסיוניים שונים.
הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו למדוד ישירות את חילוף החומרים לאחר הלידה בלימפה מזנטרית זורמת. זה חזק כי אנחנו יכולים לקבוע כמותית את התנועה של חומרים מזינים מן המעי הדק לתוך הלימפה. ואנחנו יכולים למדוד ציטוקינים, שומנים תזונתיים, רכיבים תזונתיים אחרים ולימפוציטים.
טכניקה זו יכולה לעזור לנו לנתח את הדינמיקה של שומנים תזונתיים הנעים לתוך הלימפה, סינתזה והפרשה של כילומיקרון. למודל החד-יומי המוצג כאן יש כמה יתרונות. ראשית, זה מקטין את זמן הניסוי.
שנית, היא מפחיתה את הלחץ של בעלי החיים. זה מגביר את הישרדות בעלי החיים. ובסך הכל, מקטין את מספר הניסויים.
מי שידגים את הטכניקה שלנו היום יהיה מנתח המעבדה הבכיר שלנו, מר ניק דדוסיס. והמדען החוקר שלנו, ד"ר ליהונג טנג. לאחר הכנת העכבר לניתוח, לתפוס את העור עם פינצטה ולעשות חתך בטן קו האמצע עם מספריים קטנים.
לאחר מכן, חותכים לכיוון עצם החזה ומטה לשומן המפשעה. באמצעות retractor, להזיז את הקרביים הצפק מהדרך עד צינור הלימפה גלוי. בעזרת קצה Q ספוג במי מלח, הניעו את הכבד לכיוון הצד הימני העליון של הגוף ואת המעיים והקיבה לכיוון שמאל של החיה.
לאחר מכן לחשוף את העורק mesenteric העליון ואת צינור הלימפה המעי על ידי מתיחה התריסריון רוחבי לכיוון שמאל. הכינו צינורית באורך 30 עד 40 ס"מ על ידי החדרת מחט קהה. לאחר מכן, באמצעות מזרק של מיליליטר, שטפו כמות קטנה של הפרין דרך הצינור וחתכו שיפוע בקצה צינורית הצינורית באמצעות מספריים.
לאחר מכן, בצע חתך רדוד וצינור לימפה באמצעות מספריים הקשתית כמתואר בכתב היד. החזיקו את צינורית הצינורית בעזרת זוג מלקחיים עדינים והכניסו בעדינות את קצה השיפוע לצינור. מכיוון שצינור הלימפה שביר, השתמש בטיפת ציאנואקרילט כדי להדביק את צינורית הלימפה לתוך הלימפה המזנטרית במקום לקשור את הצנתר בתפר.
כעת, באמצעות מחט 18 מד, נקבו חור דרך האזור הפילורי של הקיבה האחורית לסוגר הפילורי, והכניסו את צינור העירוי התריסריון בקיבה מילימטר עד שני מילימטרים מעבר לסוגר הפילורי לתריסריון. לאחר מכן, הדקו את הצינור לקיבה באמצעות רצועת חוט ארנק באמצעות תפר משי 5/0 ואטמו בטיפת דבק ציאנואקרילט למניעת דליפה. התחל עירוי תריסריון של 5% גלוקוז ו 0.9% מלוחים.
להחליף את האיברים בחלל הגוף ולתפור את חתך קו האמצע. הנח את העכבר בעדינות באיפוק מתכרבל. לספק את העכברים עם עירוי intraduodenal מתמשך של מלוחים גלוקוז במשך שעה אחת.
בדוק את הצינורית עבור זרימת הלימפה ולהתחיל לחלוב את צינורית הלימפה כדי לשמור על הלימפה זורמת. בצע את עירוי השומנים הקלאסי של בולוס תחליב שומנים 0.3 מיליליטר דרך צינור העירוי תוך תריסריון. לאחר מכן, החזירו את העירוי ל-5% גלוקוז ו-0.9% מלוחים ב-0.3 מיליליטר לשעה ברציפות עד סוף הניסוי.
לאסוף את דגימות הלימפה מראש לשקול צינורות מיקרו צנטריפוגות במשך 60 דקות ולשמור את הלימפה על קרח. לשקול את הצינורות בפעם השנייה כדי לקבוע את משקל הלימפה מופרש כל 60 דקות. אספו את הקיבה, הצקום והמעי הגס והכניסו כל איבר לצינור זכוכית של 15 מיליליטר.
מחלקים את המעי הדק לשלושה או ארבעה מקטעים. חתכו אותו לאורכו ואספו את התוכן הלומינלי על ידי שטיפת הרקמה בשניים עד שלושה מיליליטר של PBS קר. הסר את רירית המעי המורכבת מתאי אפיתל ולמינה פרופריה הקשורה מהשכבה השרירית על ידי גירוד כל חלק בשניים עד שלושה מיליליטר של PBS קר עם טוויטר מעוקל.
מניחים את כל הרקמות, את המבודד הלומינלי והרירית, ואת השכבה השרירית בצינורות זכוכית. ריכוז הטריגליצרידים בלימפה עלה בתגובה לבולוס תוך תריסריון של 300 מיקרוליטר SMOFlipid. ריכוז שיא הטריגליצרידים מגיע בשעתיים עד שלוש שעות לאחר הבולוס ויורד בהתמדה במהלך שש השעות.
קצב זרימת הלימפה עולה מזמן עירוי בולוס אפס ועד סוף הניסוי. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה הייתה להפחית את העקה של בעלי חיים, להגדיל את שיעור ההישרדות ולקצר את זמן ההרדמה. לשם כך החלפנו את כלובי הריסון של בולמן להתכרבלות, והוספנו לחות, חום וחידוש נוזלים.
פרוטוקול פיסטולה צולעת ליום אחד שלנו מאפשר לנו למדוד בזמן אמת, in vivo, דינמיקה של ספיגת שומנים. זה גם מאפשר לנו לחקור את ההצלבה של איברי המעי, חילוף חומרים, ספיגת חומרים מזינים תזונתיים ופנוטיפים חיסוניים.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול לבידוד לימפה תוך-מעית זורמת בעכברים, המאפשר מדידה מדויקת של ספיגת ליפידים מעיתית כוללת וסינתזה של קילומיקרונים בעקבות עירוי רכיבי תזונה לתוך התריסריון. מטרת השיטה היא להבין את הדינמיקה של ספיגת ליפידים ותגובות חיסוניות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- מטבוליזם
- פיזיולוגיה של מערכת העיכול
- אימונולוגיה
רקע
- מטבוליזם לאחר האכלה הוא קריטי לספיגת רכיבים תזונתיים.
- מדידת זרימת הלימפה מספקת תובנות לגבי דינמיקה של ליפידים תזונתיים.
- הפחתת סטרס בבעלי חיים ושיפור שיעורי ההישרדות הם בעלי חשיבות עליונה בתכנון ניסויי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- טכניקות כירורגיות לקנולציה של צינורות הלימפה בעכברים
- מודל לאחר סעודה באמצעות עירוי רכיבי תזונה לתריסריון
- מדידה בזמן אמת של זרימת לימפה וריכוזי ליפידים
תוצאות עיקריות
- עירוי ליפידים מדגים ריכוזי טריגליצרידים שיא בתוך שלוש שעות.
- קצב זרימת הלימפה עולה באופן משמעותי לאחר העירוי.
- הפרוטוקול מקטין ביעילות את זמן ההרדמה ומשפר את שיעורי ההישרדות.
מסקנות
- הפרוטוקול בן היום האחד מאפשר תצפית בזמן אמת, in vivo, של דינמיקת ספיגת ליפידים.
- מחקר זה רלוונטי להבנת חילוף החומרים ואינטראקציות חיסוניות במעי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות ישיר של ספיגת ליפידים תזונתיים והפרשת קילומיקרונים in vivo נותן מענה לפער קריטי במחקר מחלות מטבוליות ובתיקוף מטרות טיפוליות. פרוטוקול זה מאפשר מדידה ברזולוציה גבוהה של זרימת חומרים מזינים ומתווכי חיסון לפני דילול מערכתי, ובכך תומך בביטחון חיזוי בשלבי גילוי מוקדמים ובמחקרים תרגומיים. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות לגבי תיק תכשירים על ידי אספקת בהירות מכניסטית בנוגע לאינטראקציות בין המעי לליפידים ולגורמי סיכון מטבוליים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של דינמיקת ספיגת ליפידים במעי וסינתזת קילומיקרונים.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים של מסלולים מטבוליים ודלקתיים הרלוונטיים למחלות קרדיווסקולריות ומטבוליות.
- מסייע בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי כימות זרימת רכיבי תזונה וציטוקינים בזמן אמת.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק מערכת in vivo הניתנת לשחזור לצורך הערכת התערבויות גנטיות או פרמקולוגיות בספיגת ליפידים.
- מספק נתונים כמותיים ברזולוציית זמן לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה והשוואתיות בין מחקרים.
- מאפשר איסוף סקלאבילי של לימפה לצורך אנליזות של ליפידים, הורמונים וציטוקינים בהמשך התהליך.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלות באמצעות שימוש בזני עכברים גנטיים לגילוי ביומרקרים תרגומיים.
- שומר על רצף מגילוי מכניסטי ועד לתיקוף פרה-קליני של אינטראקציות בין המעי, השומנים ומערכת החיסון.
- תומך בקידום מותאם-סיכון של תוכניות למחלות מטבוליות ודלקתיות.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
פרוטוקול זה משתלב בממשק שבין הגילוי המוקדם לתיקוף מודלים פרה-קליניים, ומגשר בין מחקרים מכניסטיים למחקר תרגומי במסלולי פיתוח למחלות מטבוליות.
- ביולוגיה של גילוי: מכמתה את ספיגת רכיבי התזונה והפרשת קילומיקרונים כדי להבהיר מסלולים מטבוליים ולתקף מטרות טיפוליות.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות וסטנדרטיות להערכת התערבויות ולפיתוח בדיקות.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של ליפידים, הורמונים וציטוקינים בלימפה לא מדוללת לצורך ניתוחים השוואתיים אמינים.
- מחקר תרגומי: מקלה על סנכרון ביומארקרים והמשכיות מכניסטית בין שלבי הגילוי לשלבים הפרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת in vivo הניתנת לשימוש חוזר עבור מחקרים מטבוליים ואימנולוגיים בתוכניות שונות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזואי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות מטבוליות.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של דגימה in vivo, הפחתת סטרס בבעלי חיים ושיפור השחזוריות.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של go/no-go וקידום פורטפוליו ביעילות הונית.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון של נכסים למחלות מטבוליות ודלקתיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות כירורגית בקנולציה של צינורות הלימפה ועירוי לדודנאם בעכברים.
- נדרשת תשתית אנליטית לכימות ליפידים, הורמונים וציטוקינים בדגימות לימפה.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים לאיסוף דגימות וניתוח נתונים.
- התאמה למערכות מודל אחרות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מגבלות מעשיות כוללות מורכבות טכנית והצורך בטיפול ייעודי בבעלי חיים.
