Name: בידוד הלימפה המזנטרית הזורמת בעכברים לכימות קינטיקה של ספיגת שומנים תזונתיים והפרשת כילומיקרון (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T13:20:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: למדו לבודד לימפה מזנטרית זורמת בעכברים למדידת ספיגת שומנים וסינתזת כילומיקרון בזמן אמת. פרוטוקול יום אחד זה מפחית מתח בבעלי חיים ומגביר שרידות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו אסירי תודה לקרן סיסטיק פיברוזיס (פרס פיילוט והיתכנות 1810, ל- ABK), לקרן ריינין (פרס סינרגיה, ל- PI GJ Randolph ו- Co-I ABK), ולמכונים הלאומיים לבריאות (R01DK118239, R03DK116011 ל- ABK) על תמיכתם במחקרים אלה.

כל ההליכים הכירורגיים אושרו על ידי הוועדה הפנימית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת פיטסבורג [פרוטוקול # 20047008] ועומדים במדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה. C57BL6/J עכברים זכרים, בני 8-14 שבועות, שימשו במחקר הנוכחי. העכברים התקבלו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים). כל העכברים שוכנו במחזור אור/חושך של 12 שעות עם גישה ל-ad libitum לצ'או ומים סטנדרטיים.
1. הכנת בעלי חיים
<ol><li>בהתאם לתכנון הניסוי, האכילו את העכברים או אפשרו להם לצום. הערה: צום לילה הוא מיותר אלא אם כן יש חששות לגבי הבדלים בקצב ריקון הקיבה.</li>
	<li>יש להשרות הרדמה ב-5% גז איזופלורן ולהבטיח הרדמה נאותה על ידי צביטת זנב ובוהן. לאחר ההרדמה, יש לשמור את העכברים במישור הרדמה מתאים עם 2%-3% גז איזופלורן ולמקם אותם עם סרט הדבקה על משטח הניתוח.</li>
	<li>שמרו על חום העכברים על משטח כירורגי מחומם המשתמש במים חמים (ראו טבלת חומרים).</li>
</ol>2. ניתוח ועיצוב ניסוי
<ol><li>התחל את הניתוח על ידי מריחת משחה וטרינרית על העיניים, גילוח הבטן ומריחת פילינג כירורגי חיטוי (ראה טבלת חומרים) על אתר הניתוח. פעולה זו מעקרת את החתך ומפחיתה את ייצור הפרווה המוטסת במהלך החתך בקו האמצע.</li>
	<li>שמור על אזור עבודה סטרילי על ידי שימוש במכשירים סטריליים, וילונות וציוד ואספקה אחרים הדרושים.</li>
	<li>הזריקו את המנה הראשונה של קרפרופן (ראו טבלת חומרים) לשיכוך כאבים (כלומר) במינון של 5 מ"ג/ק"ג.</li>
	<li>תופסים את העור בפינצטה ומבצעים חתך בטני בקו האמצע עם מספריים קטנים. חותכים לכיוון עצם החזה (לעולם לא מעל) וחותכים לשומן המפשעה. לאחר מכן, לחתוך דרך שכבת השריר בנפרד באמצעות מספריים. הערה: יש לעקר את כל הציוד לפני השימוש.</li>
	<li>באמצעות retractor, להזיז את הקרביים הצפק מהדרך עד צינור הלימפה גלוי.</li>
	<li>בעזרת Q-tip ספוג במי מלח (ראו טבלת חומרים), הניעו את הכבד לכיוון הצד הימני העליון של הגוף ואת המעיים והקיבה משמאל לחיה.</li>
	<li>מתחו את התריסריון לכיוון שמאל לרוחב כדי לחשוף את העורק המזנטרי העליון ואת צינור הלימפה של המעי.</li>
	<li>הכינו צינורית צינורית באורך 30-40 ס"מ על ידי החדרת מחט קהה לצינורית (ראו טבלת חומרים) ושטפו כמות קטנה של הפרין (1,000 U/L) דרך הצינורית באמצעות מזרק 1 מ"ל. הערה: זרימת הלימפה נעזרת על ידי כוח הכבידה לזרום למטה לתוך צינורות איסוף מיקרוצנטריפוגות על קרח. בהתאם למיקום דלי הקרח בצמוד למערך הניתוחי, ייתכן שיהיה צורך להתאים את אורך צינורית הצינורית.</li>
	<li>השתמש מספריים כדי לחתוך שיפוע בקצה צינורית.</li>
	<li>בצע חתך רדוד עם מספריים הקשתית (ראה טבלת חומרים) בצינור הלימפה כ -5 מ"מ מהופעתו במעי הדק.</li>
	<li>החזיקו את צינורית הצינורית בעזרת זוג מלקחיים עדינים והכניסו בעדינות את קצה השיפוע לצינור. הערה: חשוב לא לדחוף את הצינורית רחוק מדי לתוך הצינור כי זה עלול למנוע זרימת הלימפה כאשר האיברים הנסוגים מוחזרים למקומם המקורי.</li>
	<li>צינור הלימפה שביר מדי עבור המניפולציות הקשורות לקשירת הצנתר בתפר. במקום זאת, השתמשו בטיפת דבק ציאנואקרילט (ראו טבלת חומרים) כדי להדביק את צינורית הלימפה לתוך צינורית הלימפה המזנטרית.</li>
	<li>בדוק את הלימפה החלבית, הלבנה (אם לפני הניתוח נעשה שימוש בשמן זית) או לימפה צלולה (אם עכברים צמו לפני הניתוח) שמתחילה לזרום מיד דרך צינורית פיסטולה הלימפה. הערה: בדוק כי צינורית הלימפה ממוקמת בהצלחה הלימפה זורמת; המשך עם מיקום צינורית תוך תריסריון.</li>
	<li>באמצעות מחט 18 גרם, לנקב חור דרך האזור הפילורי של הבטן האחורית אל הסוגר הפילורי.</li>
	<li>הכנס את צינור העירוי של התריסריון (ראה טבלת חומרים) דרך חור זה בקיבה לכ-1-2 מ"מ מעבר לסוגר הפילורי לתוך התריסריון.</li>
	<li>מאובטח על ידי רצועת חוט ארנק באמצעות תפר משי 5-0 (ראה טבלת חומרים) עם מחט לקיבה ואטם עם טיפה של דבק ציאנואקרילט למניעת דליפה.</li>
	<li>התחל עירוי תוך תריסריון של 5% גלוקוז-0.9% מלוחים ב 0.3 מ"ל / שעה. הערה: בעת שימוש בעכברים עם שונות קטנה במשקל הגוף שהם בערך 25 גרם (~ 8 שבועות בגיל), עירוי 0.3 מ"ל / שעה של גלוקוז / מלוחים מתאים. אם העכברים גדולים באופן דרמטי, יש להתאים את קצב העירוי כלפי מעלה כדי להסביר את השינוי במשקל הגוף ובנפח הדם.</li>
	<li>להחליף את האיברים בחלל הגוף ולתפור (5-0) את רקמות השריר והעור בנפרד. הערה: צינורית הלימפה וצינורית ההזנה התוך תריסריונית שניהם חיצוניים דרך אותו חתך. אין קדימות להפרדת הצינורות בתפר ואין העדפה לזווית היציאה של הצינורות.</li>
	<li>לאחר הניתוח אך לפני הפסקת חומר ההרדמה, הניחו את העכברים בעדינות במעצורי התכרבלות (ראו טבלת חומרים) כדי להגביל את תנועתיותם. הערה: מעצורי ההתכרבלות מונעים מהעכברים לאחוז או לסובב את הראש כדי ללעוס את התפרים והצינורות.</li>
	<li>לאחר מכן, הניחו את העכברים בקופסת פרספקס שקופה על מסובב עם נדנוד עדין, והתחממו באמצעות כרית חימום דו-חיים/זוחלים מבוקרת טמפרטורה מסחרית המודבקת לצד קופסת ההכלה. לספק לחות גם בצורה של מיכלי מים סטריליים deionized בפינות של תיבת ההכלה (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>30 דקות לפני הוצאת האיזופלורן, יש לתת לעכברים את מנת שיכוך הכאב השנייה שלהם (Buprenex, 0.1 מ"ג/ק"ג, i.p).</li>
	<li>בהתאם לניסוי, לספק לעכברים עירוי תוך תריסריון רציף של 5% גלוקוז -0.9% מלוחים בקצב של 0.3 מ"ל / שעה במשך 1 שעות. הערה: תמיסת המלח 5% גלוקוז-0.9% מיוצרת באמצעות שקית מלח סטרילית (לשימוש אנושי, pH 7.4) מבית המרקחת ובקבוק סטרילי לשימוש אנושי של 50% דקסטרוז, בהתאם להנחיות מחמירות לסטריליות. יש להכין את התמיסה טרייה ולהשליך אותה אם חלפו תאריכי התפוגה שסופקו על שקית המלח או בקבוק הדקסטרוז.</li>
	<li>יש לתת לעכברים עם אחד הליפידים הרשומים בטבלה 1 כשופיד ניסיוני באמצעות צינורית תוך תריסריון (ראו טבלת חומרים). הערה: עבור כל הנתונים המוצגים באיור 1, SMOFlipid (תחליב הזרקת שומנים 20%, USP, ראה טבלת חומרים) היה עירור תוך תריסריון. עירוי זה הן לפני ואחרי תריסריון שומנים בולוס מחליף נוזלים אבודים המתנקזים דרך צינור הלימפה והוא דרישה מוחלטת. העכברים מוכנים כעת להחדיר להם מנת שומנים ניסיונית.</li>
	<li>בצע את עירוי השומנים הקלאסי של בולוס תחליב שומנים 0.3 מ"ל (SMOFlipid 20% תחליב הזרקת שומנים, USP) באמצעות צינור עירוי תוך תריסריון (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>לאחר עירוי בולוס של שומנים תוך תריסריון, יש להחזיר את העירוי ל-5% גלוקוז-0.9% מלוחים ב-0.3 מ"ל/שעה ברציפות עד סוף הניסוי.</li>
	<li>אספו את דגימות הלימפה בצינורות מיקרוצנטריפוגות שנשקלו מראש למשך 60 דקות ושמרו את הלימפה על קרח. לשקול את הצינורות פעם שנייה כדי לקבוע את משקל הלימפה כי הוא מופרש כל 60 דקות תקופה. הערה: צפו לאסוף כ-50-300 מיקרוליטר לימפה לשעה, לכל עכבר ב~6 שעות לאחר בולוס שומנים של 0.3 מ"ל.</li>
	<li>הלימפה יכולה לזרום עד 6 שעות לאחר עירוי השומנים. בנקודת הזמן של 6 שעות, הרדימו את העכברים באמצעות איזופלורן ונקע צוואר הרחם. הערה: מנתח ו / או טכנאי מעבדה צריכים להיות נוכחים כדי לפקח על בעלי החיים במהלך הניסוי. במהלך התצפית יש לשים לב לקרישי דם בניקוז הלימפה ולשינויים בהתנהגות בעלי החיים המעידים על כאב/מצוקה. אם צינור הלימפה סתום בשלב כלשהו במהלך הניסוי, הניסוי מופסק, ובעל החיים מורדם. טכנית ניתן להחזיק את בעל החיים בחיים עד 24 שעות לאחר הניתוח (בהתאם לכללי ניתוח הישרדות IACUC). עם זאת, שיעורי ההישרדות יורדים עם הזמן, ו -6 שעות היא תקופת הישרדות הניתנת לשחזור שבה ספיגת השומנים עדיין מחקה את הפיזיולוגיה in vivo , והחיה אינה נאבקת בהישרדות.</li>
	<li>בצע איסוף רקמות מסוף לאחר המתת חסד (שלב 3.1). הערה: ההבדל בפרופילי ספיגת השומנים בתזונה בעכברים שנשמרו במשך 6 שעות או 24 שעות לאחר הניתוח נבדק לאחרונה44. מצאנו כי הליך של 24 שעות מפחית את שיעורי ההישרדות של בעלי חיים ואת הזרימה של שומנים תזונתיים לתוך הלימפה. מסיבות אלה, אנו ממליצים בחום על גישת 6 שעות. תכנון כירורגי מעודכן זה מפחית מוות מיותר של בעלי חיים ואת הפוטנציאל למצוקה של בעלי חיים בתקופה שלאחר הניתוח. זה תומך במטרה מרכזית של האגודה האמריקאית להסמכת טיפול בחיות מעבדה, שהיא "החלפה, הפחתה, עידון" של בעלי חיים [ref PMID: 21595115].</li>
</ol>3. איסוף תוכן לומינלי ורקמת רירית
<ol><li>בתום 6 שעות עירוי שומנים, להקריב את העכברים באמצעות איזופלורן ונקע צוואר הרחם. קשרו את שני קצוות הקיבה, המעי הדק והצקום ב-5-0 תפרים כדי למנוע דליפה של תכולת הלומינל.</li>
	<li>אספו את הקיבה, הצקום והמעי הגס, והכניסו כל אחד מהם לצינור זכוכית בנפח 15 מ"ל. מחלקים את המעי הדק לשלושה או ארבעה מקטעים, ואוספים את התוכן הלומינלי על ידי שטיפת הרקמה ב 2-3 מ"ל של PBS קר לאחר חיתוך פתוח לאורך.</li>
	<li>הסר את רירית המעי המורכבת מתאי אפיתל ולמינה פרופריה הקשורים מהשכבה השרירית על ידי גירוד כל קטע ב 2-3 מ"ל של PBS קר עם טוויטר מעוקל.</li>
	<li>מניחים את כל הרקמות, המבודדות הלומינליות והריריות ואת השכבה השרירית בצינורות זכוכית ומוסיפים 8 מ"ל של 2:1 vol/vol CHCl3:MeOH לכל צינור.</li>
	<li>לקבוע את הרדיואקטיביות ו/או ריכוזי השומנים על ידי ספירת נוזלים ו/או ערכת בדיקת טריגליצרידים (ראה טבלת חומרים) לאחר מיצוי פולץ'45.</li>
</ol>4. כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC)
<ol><li>חלץ את סך השומנים של המבודד הלומינלי והרירית באמצעות מיצוי Folch שונה45.</li>
	<li>יבש את הליפידים שחולצו בממס תחת מאייד חנקן ולאחר מכן השהה אותם מחדש ב-2:1 vol/vol של CHCl3:MeOH לפני העמסתם על צלחת ג'ל סיליקה TLC (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>הפרידו את הליפידים באמצעות מערכת ממסים של אתר נפט, אתר אתילי וחומצה אצטית קרחונית (25:5:1 vol/vol/vol). השתמש אדי יוד עבור הדמיה של שומנים שונים, כולל סטנדרטים.</li>
	<li>יש לגרד את הכתמים על צלחת TLC המתאימים למונוגליצרידים/פוספוליפידים, דיגליצרידים, חומצות שומן, טריגליצרידים וכולסטרול אסטר לתוך בקבוקוני נצנוץ בודדים לפני הוספת 4 מ"ל של נוזל הנצנצים (ראה טבלת חומרים) לספירת נצנצים.</li>
	<li>בטא את הנתונים כאחוז ממינון השומנים הכולל של הבולוס או כשבריר מסך השומנים שזוהו עבור כל דגימה.</li>
</ol>5. בידוד ואפיון כילומיקרון
<ol><li>להעביר את דגימות הלימפה המשולבות מן 6 שעות post-lipid bolus (שלב 2.29) צינורות ultracentrifuge, מעורבב עם 0.9% NaCl (300-500 μL), ולאחר מכן בזהירות כיסוי עם נפח מתאים של 0.87% NaCl (300-500 μL).<ol><li>אולטרה-צנטריפוגה (ראה טבלת חומרים) הדגימות ב 110,000 x גרם ב 4 ° C במשך 16 שעות. אספו את החלק העליון המכיל כילומיקרונים מבודדים והעבירו אותם לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש.</li>
	</ol></li>
	<li>קבע ריכוזי טריגליצרידים כילומיקרון, כולסטרול ו- apoB לפי השלבים הבאים.<ol><li>קבע את ריכוזי הטריגליצרידים והכולסטרול באמצעות ערכת בדיקת טריגליצרידים וכולסטרול (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>בקצרה, לדגור 2 μL של הדגימות עם 200 μL של מגיב אנזים ב 37 ° C במשך 5 דקות בצלחת 96 באר. קרא את הצלחת באמצעות קורא צלחות ב 500 ננומטר עבור טריגליצרידים ו 600 ננומטר עבור כולסטרול. הערה: תקנים וחסר שימשו לחישוב ריכוזים. ריכוזי ApoB נקבעו באמצעות ערכת Mouse ApoB ELISA Kit (ראה טבלת חומרים).</li>
	</ol></li>
	<li>קבע את גודל חלקיקי chylomicron.<ol><li>השתמש בדגימות כילומיקרון טריות בריכוזי טריגליצרידים של כ -40 מ"ג / ד"ל להדמיית TEM. בקצרה, מניחים 5-10 μL מכל דגימה על רשת TEM ומייבשים.</li>
		<li>בחן את הרשת במיקרוסקופ אלקטרונים שידור וצלם תמונות. מדוד את גדלי חלקיקי הליפופרוטאין ונתח אותם באמצעות תוכנת ImageJ (ראה טבלת חומרים).</li>
	</ol></li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

הליך פיסטולה לימפה המקורי 2 יום תואר על ידי Bollman et al.25 ומתורגל על ידי המעבדה של פטריק טסו במשך 45 השנים האחרונות26,27. הפרוטוקול המוצג כאן הוא תוספת רבת עוצמה לשיטה קלאסית זו, סטנדרטית זהב, לזיהוי, כימות והבנה של הפרשות כילוס ייחודיות של המעי הדק, כמו גם את הדינמיקה in vivo של ספיגת חומרים מזינים תזונתיים ומטבוליזם, הורמוני מעיים וחסינות מעיים.
היתרונות של מודל זה כוללים: (1) היכולת לדגום באופן רציף לימפה מזנטרית לאורך כל תקופת ההזנה והתקופה שלאחר הלידה במקום דגימה סטטית בנקודת זמן אחת במהלך ספיגה, עיכול או הפרשה; (2) מדידת הורמוני מעיים וציטוקינים ישירות בתא הפיזיולוגי שלהם ולא בדם, שם הם מדוללים ומתפרקים אנזימטית17,44; (3) היכולת לבודד, לכמת ולאפיין את הליפופרוטאינים המופרשים במעי הדק לאחר בליעת ארוחה ליפידית והיעדר ליפאזות אנדותל בלימפה המזנטרית, המשמרת ריכוזי טריגליצרידים כילומיקרונים ומבנה כילומיקרון טבעי46,47; (4) היכולת למדוד ישירות את קצב זרימת הלימפה, תפוקת הטריגליצרידים והכולסטרול (או תרכובות אחרות המושרות בתריסריון), הרכב הכילומיקרון וריכוזי הורמוני המעי. לבסוף, פרוטוקול זה מאפשר איסוף כמויות גדולות יחסית של >50 מיקרוליטר לימפה בכל שעה במשך תקופה של 6 שעות. ככל שהנוזל מתחדש במי מלח תוך תריסריון ובעירוי גלוקוז, מודל פיסטולה הלימפה משופר משמעותית על פני טכניקות דגימה לימפות אחרות ומביא לבריכות זורמות ולא סטטיות של לימפה מזנטרית. מכיוון שנפח הוא מכשול עיקרי עבור גישות ליפיומיות, פרוטאומיות ומטבוליות, זהו חוזק משמעותי.
לפרוטוקול פיסטולה לימפה של עכבר ליום אחד המתואר כאן יש מספר יתרונות על פני פרוטוקול פיסטולה הלימפה המקורי, כולל הפחתה במספר הכולל של בעלי חיים ניסיוניים מפרוטוקולי פיסטולה לימפה של יומיים שתוארו קודם לכן26,27 בגלל שיעור הישרדות גבוה יותר לאחר ניתוח; צמצום זמן הניסוי הכולל מיומיים ליום אחד; ולבסוף, קיצור תקופת ההחלמה של עכברים מלילה (>18 שעות), שם עלולים להתרחש כאבים פורצי דרך או תוצאות גרועות לאחר הניתוח, לתקופה קלה יותר לניהול ~6 שעות לאחר הניתוח.
מאפיין של פרוטוקול יום אחד זה הוא ההתמקדות בשיקולים אנושיים ובנקודות קצה. אלה חייבים לקבל את העדיפות הגבוהה ביותר: (1) בעלי חיים חייבים לקבל נוזלים חלופיים תוך תריסריון או IV; (2) הם חייבים להישמר חמים וללא כאב ככל האפשר (עם Buprenex לאחר הניתוח ו / או carprofen, בהתאם לתכנון הניסוי ואת הצורך להימנע השפעות אנטי דלקתיות); (3) דימום, רעד, שלשול או סימני מצוקה הם כולם סיבות משכנעות לנקודת קצה אנושית. על פי הנחיות IACUC קפדניות, איזופלורן ואחריו נקע צוואר הרחם הוא נקודת סיום טובה. שיעורי ההישרדות הכירורגיים הם ~70% ליום אחד (לעומת ~40% בניתוח המקורי בן היומיים), אך החוקרים לא צריכים להסס לסיים את הניסוי בסימן מצוקה. יש לקחת זאת בחשבון בעת תכנון מספרי בעלי חיים.
במונחים של פתרון בעיות בטכניקה זו, מיקום מוצלח של צינורית הלימפה הוא צוואר הבקבוק העיקרי בהליך כירורגי זה. בעת תרגול הניתוח, זה עוזר gavage העכבר עם 0.3 מ"ל שמן זית כ 2 שעות לפני הניתוח. זה יגרום להפרשת כילומיקרונים לתוך צינור הלימפה mesenteric, מה שהופך אותו נראה "חלבי" גלוי יותר. ניתן להשתמש גם במתילן כחול, אך לעתים קרובות הוא פחות ברור מצינור הלימפה החלבי. אם לאחר המיקום של צינורית הלימפה ואת המיקום שלה עם דבק הלימפה mesenteric זורם בהצלחה דרך צינורית לתוך כלי איסוף, אז אפשר להמשיך עם המיקום של צינור עירוי התריסריון. לעיתים, הלימפה עשויה שלא לזרום ברציפות אך עשויה להתחיל לזרום שוב כאשר החיה מונחת על השולחן המסתובב. באופן קריטי, היזהרו מקרישי דם בתוך צינורות הלימפה. אלה צריכים להיות עיסוי מתוך צינורות כדי למנוע לחץ backflow על צינור הלימפה.
בנוסף להפרשת טריגליצרידים וקצב זרימת הלימפה, ניתן להשתמש בטכניקה זו כדי לקבוע את קינטיקה ספיגת השומנים הבאה ואת מאפייני כילומיקרון:
הפרשת כילומיקרון45,48,49 מיד לאחר ארוחה המכילה שומן, יש עלייה חולפת בטריגליצריד פלזמה במחזור. כמו טריגליצרידים הם הידרופוביים מטבעם, הם חייבים להיות מתחלבים תחילה כדי להיות מסיסים בדם50. אנטרוציטים במעי הדק מבצעים תפקיד זה ואורזים טריגליצרידים תזונתיים לחלקיקי תחליב כילומיקרון51. כילומיקרונים מכילים כולסטרול וטריגליצרידים תזונתיים בליבתם, מוקפים בפוספוליפידים ואפוליפופרוטאינים, כולל apoB-48, apoA-I, apoA-IV ו-apoC-III52,53,54,55. ApoB-48 הוא החלבון המבני החיוני, ולאפוליפופרוטאינים האחרים יש תפקידים שונים הדרושים למטבוליזם של כילומיקרון ולפינוי מהדם. כדי לקבוע את המאפיינים העיקריים של chylomicrons, כולל התוכן טריגליצרידים אפוליפופרוטאין שלהם, 1 יום פיסטולה פיסטולה המוצג כאן יש להשתמש. שיעור הפרשת כילומיקרון הוא אחוז הטריגליצרידים 3H המופרשים ללימפה ונמדדים על ידי נצנוץ על ידי ספירת דגימות לימפה לפי שעה. ניתן לשלב זאת עם אפיון כילומיקרון מפורט 48,49,56,57,58. דגימות לימפה לפי שעה ניתן לשלב או לשמור בנפרד. הלימפה מועברת לצינורות אולטרה-צנטריפוגה, מעורבבת עם 0.9% NaCl, ולאחר מכן מכוסה בזהירות עם 300-500 μL של 0.87% NaCl. לאחר מכן הדגימות עוברות אולטרה-צנטריפוגה בטמפרטורה של 110,000 x גרם ב-4°C למשך 16 שעות. השברים העליונים המכילים כילומיקרונים מבודדים נאספים ונבדקים לריכוזי טריגליצרידים באמצעות ערכת בדיקת הטריגליצרידים. בקצרה, 2 μL של chylomicron (דילול 1: 10) הוא מודגר עם 200 μL של מגיב אנזים בטמפרטורת החדר במשך 10 דקות בצלחת 96 באר. הצלחת נקראת על ידי קורא לוחות ב 500 ננומטר, ואת התקנים ואת החסר משמשים לחישוב ריכוזי טריגליצרידים. לאחר מכן ניתן לקבוע את גודל הכילומיקרון על ידי צביעה שלילית ומיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM)14,29. ניתן לכמת טריגליצרידים וכולסטרול על ידי בדיקות כימיות ותכולת אפוליפופרוטאין (apoB-48, A-I, C-II, C-III) על ידי ערכות ELISA או כתם מערבי.
קביעת האתר העיקרי של ספיגת שומנים48,59 על ידי בידוד תאי הלומינל והאפיתל של התריסריון, הג'ג'ונום והאילאום בשעה 6 שעות לאחר עירוי של 3 H-טריגליצרידים או ארוחה מעורבת המסומנת ברדיו, התוכן מופק כדי לקבוע כמה מ-3H-טריגליצרידים נספג על פני קרום תא האפיתל (נורמלי) או נשמר בלומן (לא תקין) לאורך המעי הדק48 . מחקרים אלה משפיעים במיוחד אם קיימים הבדלים פוטנציאליים בתנועתיות מערכת העיכול60,61,62, אם קיימת השערה לגבי חומצות מרה (פעילות מאוד לאורך ספיגת שומנים והן נספגות מחדש באילאום)63,64,65,66, או אם קיים חשש שחומרי מזון נספגים במיקום אנטומי לא נכון (אילאום או אפילו מעי גס)67 ,68,69,70.
זיהוי מנגנונים של 3 H-טריגליצרידים הנכנסים לתאי אפיתל סופגים48 זה מבוצע על ידי חישוב אחוז 3 H-טריגליצרידים הידרוליזה ל 3חומצת שומן ללא H בלומן המעי, נספג לתוך הרירית, ואסטרי מחדש לתוך תאית 3H-טריגליצרידים לפני הפרשה כמו chylomicrons. זהו סמן רב עוצמה של פגמים בספיגה/הפרשה, שכן ניתן לייחס אותו כדי להראות את התנועה של טריגליצרידים תזונתיים לתוך מוצרי הפירוק שלו ולאחר מכן אריזה לתוך כילומיקרון. ביטוי mRNA של מכונות ספיגת חומצות שומן (CD36, FABPs, ACSLs), מסלול אסטריפיקציה מחדש (MGAT, DGAT, MTTP, apoB) ואפוליפופרוטאינים (apoC-III, B-48, C-II, A-I, A-IV) ניתן לכימות נוסף על ידי RT-PCR.
יישומים עתידיים של טכניקה זו מוגבלים רק על ידי העניין בהצלבת איברי מעיים, חילוף חומרים, חסינות, ספיגת חומרים מזינים, מזהמים תזונתיים סביבתיים או כל מחלה אחרת בעלת תפקיד במערכת העיכול. סביר להניח כי ניסויים משכנעים רבים והשערות התעכבו בגלל הקושי לגשת למערכת הלימפה המזנטרית הקריטית, והמטרה של פרוטוקול חזותי זה היא להפוך טכניקה זו לזמינה יותר. בידוד כילומיקרונים והלימפה המזנטרית שבה הם שוכנים בתחילה הוא חלק קריטי בהבנת חילוף החומרים בגוף כולו; מודל פיסטולה לימפה של עכבר יום אחד הוא מודל פיזיולוגי רב עוצמה לחקר אירועים אלה.

החשיבות הפיזיולוגית של מערכת הלימפה המזנטרית הלימפה המזנטרית תוארה בצורה כלשהי מאז ~ 300 לפנה"ס כאשר הרופילוס תיאר את מערכת פורטל הכבד ואת כל "ורידים סופגים במעיים"1,2,3,4,5. במשך יותר מ -1,700 שנים לאחר תיאור ראשוני זה, מאפיין מגדיר של לימפה במעיים היה נוכחות של נוזל חלבי בלימפה mesenteric זמן קצר לאחר ארוחה3. כיום ידוע כי לימפה חלבית, המכילה כילומיקרון (לימפה "כילוס") אינה מתנקזת לווריד הפורטלי ולכבד אלא עוברת דרך ציסטרנה צ'ילי לתוך צינור בית החזה, ובסופו של דבר מצטרפת לדם בווריד התת-קלאבי השמאלי6. בשל סידור אנטומי זה, הלימפה chylous הראשון נוסע דרך הלב והריאות לפני מחזור דרך שאר הגוף. משמעות הדבר היא כי הלב והריאות מקבלים "מעבר ראשון" על הפרשות לתוך הלימפה mesenteric7.
תפקיד מרכזי של לימפה mesenteric הוא הובלה של שומנים תזונתיים מן המעי הדק 8,9,10. אנטומית, כילומיקרונים, תאי מערכת החיסון של המעי 11,12,13,14, הורמוני מעיים 15,16,17,18, אנטיגנים 19,20,21, תרכובות ליפופיליות שאינן כילומיקרון 22,23 ונוזלים עודפים נכנסים לקטלים שמתחת לקרום מרתף האנטרוציטים ולאחר מכן מרוכזים דרך נימי הלימפה לבלוטות הלימפה המזנטריות., סביר להניח שישנם מרכיבים לימפטיים מזנטריים רבים שאינם ידועים, כולל מטבוליטים, אנטיגנים, מזהמים סביבתיים, חומרים מזינים ומולקולות איתות.
מרכיבי הלימפה המזנטרית לא זוהו באופן שיטתי, בעיקר בשל הקושי לבודד לימפה מזנטרית. הגישה ללימפה המזנטרית תמיד הייתה אתגר רציני מכיוון שצינורות הלימפה הם חסרי צבע, ולמעט לאחר ארוחה שומנית כאשר הם הופכים לכיליים וחלביים, הלימפה המזנטרית מכילה נוזל לימפה חסר צבע 6,8,9,10.
שיטות נוכחיות ונפוצות לבידוד לימפה במעי לימפה מזנטרית אינה נגישה בבני אדם (למעט נסיבות נדירות וקיצוניות שבהן התרחשה טראומה חמורה במערכת העיכול)24. איסוף לימפה In vivo הוא מורכב ותובעני מבחינה כירורגית. הליך פיסטולה הלימפה המקורי בן יומיים תואר על ידי Bollman et al.25 ושופר והתמקצע על ידי מעבדתו של פטריק טסו במשך 45 השנים האחרונות26,27. הליך פיסטולה הלימפה מאפשר לחוקרים לאסוף לימפה זורמת מבעלי חיים מודעים במהלך 6 שעות עירוי שומנים בתריסריון.
מודל פיסטולה הלימפה שימש בעיקר בחולדות למדידת קצב זרימת הלימפה, תפוקת הטריגליצרידים והכולסטרול (או תרכובות אחרות המושרות בתריסריון), הרכב הכילומיקרון וריכוזי הורמוני המעי. במידה פחותה, טכניקה זו יכולה לשמש גם בעכברים, אם כי הישרדות כירורגית ונפח הלימפה סובלים. בשל הקשיים לראות צינורות לימפה מזנטריים, שיטות היסטוריות כללו קנולציה של לימפה מזנטרית בבעלי חיים גדולים יותר כמו מיני חזירים28, כבשים29, חזירים30, כלבים31 וחולדות17. העבודה עם מודלים גדולים אלה היא עתירת משאבים ואינה מאפשרת מחקרים במודלים של נוק-אין או נוק-אאוט.
נעשה שימוש גם בגישות חלופיות. ניתן לבודד כילומיקרונים מהדם במצב שלאחר הלידה (אם כי אלה יעברו הידרוליזה חלקית על ידי ליפופרוטאין ליפאז פלזמה)32,33,34,35. צינור החזה יכול גם להיות cannulated, אם כי הלימפה שנאספה שם מכיל תערובת של לימפה mesenteric וניקוז לימפה מחוץ למעיים26,36. במבחנה, תאי Caco-2 מפרישים חלקיק דמוי כילומיקרון בתגובה לטיפול בחומצות שומן, ותאים אלה יכולים להיות בתרבית משותפת עם תאי אנדותל לימפה או כלי דם רלוונטיים37,38. תרביות אורגנואידים במעיים של בני אדם ועכבר הוכחו כמעבדות שומנים אפיים ומפרישות כילומיקרונים 39,40,41,42. מודלים אלה הם בעלי יתרון רב ומאפשרים תובנות מכניסטיות על הפיזיולוגיה של המעי הדק, אך הם אינם יכולים לשכפל את המורכבות, השיפועים הפיזיו-כימיים או זרימת הלימפה הדינמית של לימפה מזנטרית באתרה.
היתרונות של מודל פיסטולה לימפה עכבר 1 יום המוצג כאן ביחס לשיטות אחרות אלה לבידוד ליפופרוטאינים במעי, טכניקת פיסטולה הלימפה של מעבדת Tso נחשבה באופן מסורתי לטכניקה הסטנדרטית למדידת ספיגת חומרים מזינים תזונתיים ללימפה מזנטרית. לטכניקת in vivo זו יש יתרון של לכידת היבטים פיזיולוגיים מרכזיים של ספיגת שומנים תזונתיים - המראה הדינמי של תרכובות לאורך תקופת הספיגה, הדורש דגימה חוזרת ונשנית של לימפה מזנטרית זורמת בבעלי חיים עם חומרים מזינים בתריסריון. טכניקה כירורגית זו מודדת גם הורמוני מעיים וציטוקינים ישירות בתא הפיזיולוגי שלהם ולא בדם, שם הם מדוללים ומתפרקים אנזימטית17,43.
אם שאלת הניסוי דורשת הבנה של דינמיקה של הפרשת שומנים או של ספיגה ומטבוליזם דינמיים של כל תרכובת או תרופה הידרופובית במערכת העיכול, אז טכניקה זו היא לא רק מתאימה, אלא היא גם הגישה היחידה שמבצעת אינטרפולציה של התוכן הלומינלי מהמעי הפרוקסימלי למעי הדיסטלי (הקיבה למעי הגס) ומהאפיקלי למשטח הבזולטרלי (תוכן לומינלי דרך אנטרוציט ללקטלים ומחזור הדם הפורטלי). מכיוון שטכניקה זו משתמשת בהעברה לומינלית של חומרים מזינים דרך הצנתר התוך תריסריון, ומכיוון שהלימפה המזנטרית הזורמת מוסטת ונאספת, כל מנגנון הספיגה נמצא תחת בקרה ניסיונית וניתן להשתמש בו כדי להעריך באופן איכותי פרופילי ספיגה של מעי דק.
מוצג כאן לראשונה ויזואלית עדכון משמעותי למודל פיסטולה הלימפה של Tso Lab, אשר (1) מקצר את זמן הניסוי ליום אחד של השתלה כירורגית ותקופת איסוף ניסיוני; (2) שיפור הישרדות העכבר ושיקולי רווחת בעלי חיים; ו-(3) מגביר את יכולת השחזור של הגישה בעכברים כדי לרתום את כוחם של מודלים גנטיים של עכברים. טכניקה זו חייבת להיחשב תקן זהב לכל שאלות הניסוי של הפרשות מעיים, ליפופרוטאינים, או ספיגת שומנים תזונתיים והיא הטכניקה הטובה ביותר לקביעת נאמנות גבוהה של קינטיקה ספיגת שומנים וכילומיקרונים.

<table><tbody><tr><td>0.9% הזרקת נתרן כלורי, USP&nbsp;</td><td>הוספירה סטרילית, לייק פורסט, אילינוי, ארה"ב</td><td>NDC 0409-4888-06</td><td></td></tr><tr><td>1.7 מ"ל צינורות אפנדורף</td><td>פישר סיינטיפיק, וולת'אם, מסצ'וסטס, ארה"ב</td><td>7200184</td><td></td></tr><tr><td>14C-כולסטרול: כולסטרול-[4-14C] (0.1mCi/mL)</td><td>American Radiolabeled Chemicals Inc., סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>ARC 0857</td><td></td></tr><tr><td>מחט</td> <td>18 גרםבקטון דיקינסון, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב</td><td>305199</td><td></td></tr><tr><td>2 מלקחיים מיקרו-ניתוחים של דומונט</td><td>כלי מדע עדין, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>2 מלקחיים</td><td>ROBOZ מכשיר כירורגי ושות', גייטרסבורג, MD, ארה"ב</td><td>RS-5130</td><td></td></tr><tr><td>3H-TAG:&nbsp; טריולאין [9,10-3H(N)] (3H-TG) (1mCi/mL)</td><td>American Radiolabeled Chemicals Inc., סנט לואיס, מיזורי, ארה"ב</td><td>ART0199</td><td></td></tr><tr><td>3H-TG טריולאין [9,10-3H(N)] (3H-TG)</td><td>American Radiolabeled Chemicals, INC. St. Louis</td><td>MO 63146</td><td></td></tr><tr><td>50% Dextrode Injection, USP 25 גרם/50 מ"ל&nbsp;</td><td>הוספירה סטרילית, לייק פורסט, אילינוי, ארה"ב</td><td>NDC-0409-6648-16</td><td></td></tr><tr><td>Analtech TLC Uniplates: מטריצת סיליקה ג'ל Z265500-1PAK</td><td>Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td>11-101-0007</td><td></td></tr><tr><td>BD CareFusion ChloraPrep Swabstick</td><td>Fisher Scientific, וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td>14-910-501</td><td></td></tr><tr><td>קרצוף כירורגי Betadine</td><td>Dynarex Corp., אורנג'בורג, ניו יורק, ארה"ב</td><td>1201</td><td></td></tr><tr><td>צינורית</td> <td>חתוכה משופעתבריינטרי סיינטיפיק.,&nbsp; בריינטרי, MA, ארה"ב</td><td>MRE025</td><td></td></tr><tr><td>בופרנורפין HCl הזרקת קרפוג'קט PFS 0.3 מ"ג/מ"ל 10/Bx (בופרנקס)</td><td>הנרי שיין, וורנדייל, פנסילבניה, ארה"ב</td><td>1278184</td><td></td></tr><tr><td>C57BL6/J עכברים זכרים</td><td>מעבדת ג'קסון, בר הרבור, מיין</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ChloraPrep</td><td>בקטון דיקינסון, פרנקלין לייקס, ניו ג'רזי, ארה"ב</td><td>260100</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת כולסטרול</td><td>FujiFilm Healthcare, לקסינגטון, MA, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>99902601 כולסטרול-[4-14C]</td> <td>כימיקלים אמריקאים עם תווית רדיו, INC. סנט לואיס</td><td>MO 63146</td><td></td></tr><tr><td>קופסת פרספקס שקופה L43 ס"מ X W26 X H 21 עם כרית חימום מבוקרת טמפרטורה ולחות</td><td></td><td></td><td>עיצוב ושינויים משלנו</td></tr><tr><td>זמינים מסחרית&nbsp; כרית חימום דו-חיים / זוחלים</td><td>ShenZhen XingHongChang Electric Co., LTD. שנז'ן, סין</td><td>XHC-F035D</td><td></td></tr><tr><td>אפליקטורים לקצה כותנה</td><td>פישר סיינטיפיק, וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td>22363156</td><td></td></tr><tr><td>צינור עירוי תריסריון - canuala</td><td>Braintree Scientific, Braintree, MA, US</td><td>MRE037</td><td></td></tr><tr><td>ודא</td><td>Abbott Nutrition, קולומבוס, OH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פלטפורמה כירורגית של כרית חימום עם שילוב משאבת מים חמים במחזור</td><td>Patterson Scientific, Waukesha, WI, US</td><td>Gaymar T/ משאבת</td> הזרקת נתרן הטרין קלאסית<td></td></tr><tr><td>, USP 1,000 יחידות/מ"ל</td><td>סטרילי מיילן, מורגנטאון, מערב וירג'יניה, ארה"ב</td><td>NDC-67457-384-31</td><td></td></tr><tr><td>תמונה J תוכנה</td><td>המכון הלאומי לבריאות, בת'סדה, מרילנד,</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מספריים איריס</td><td>ROBOZ מכשיר כירורגי ושות', גייטרסבורג, MD, ארה"ב</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Piramal Pharma Solutions, Riverview, MI, US</td><td>NDC 66794-017-25</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר אינדוקציה איזופלורן ומנגנון הרדמה</td><td>פטרסון סיינטיפיק, ווקישה, ויסקונסין, ארה</td><td></td>"ב תא <td>אינדוקציה</td></tr><tr><td>לעכבר דבק Krazy</td><td>מוצרי אלמר בע"מ, קולומבוס, אוהיו, ארה"ב</td><td>KG484</td><td></td></tr><tr><td>ליפוסין III 20% הזרקת שומנים</td><td>Hospira Inc. לייק פורסט, אילינוי, ארה"ב</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LS 6500 רב תכליתי מונה נצנוץ</td><td>בקמן קולטר, בריה, קליפורניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיציים מיקרו-ניתוחים</td><td>ROBOZ מכשיר כירורגי ושות', גייטרסבורג, MD, ארה"ב</td><td>RS-5602</td><td></td></tr><tr><td>עכבר apoB ELISA Kit</td><td>ABCAM Inc., וולת'אם, MA, ארה"ב</td><td>ab230932-1</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מחט</td><td>כלי מדע עדין, פוסטר סיטי, קליפורניה, ארה"ב</td><td>12002-12</td><td></td></tr><tr><td>מחזירים</td><td>קנט סיינטיפיק ושות', טורינגטון, קונטיקט, ארה"ב</td><td>SURGI-5001</td><td></td></tr><tr><td>רימדיל (קרפרופן)</td> <td>Zoetis Inc., Kalamazoo MI, ארה"ב</td><td>4019449</td><td></td></tr><tr><td>שולחן מסתובב Barnstead Thermolyne</td><td>Labquake, Z&uuml; עשיר, שוויץ</td><td>Barnstead Thermolyne</td><td></td></tr><tr><td>SMOתחליב הזרקה ליפיד 20% שומנים, USP</td><td>Fresenius Kabi, Warrendale, PA, US</td><td>NDC-63323-820-01</td><td></td></tr><tr><td>Snuggle</td><td>Lomir Biomedical Inc., Notre-Dame-de-l'&Icirc; le-Perrot, QC J7V 7M4, קנדה</td><td>MS 02.5PM</td><td></td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>ROBOZ מכשיר כירורגי ושות', גייטרסבורג, מרילנד, ארה"ב</td><td>RS-5912SC</td><td></td></tr><tr><td>תפר (5-0 משי עם מחט)</td> <td>DemeTECH, מיאמי לייקס, פלורידה, ארה"ב</td><td>DT-719</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים שידור (JEOL 1400-FLASH 120KV)</td> <td>JEOL, פיבודי, MA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת טריגליצרידים</td><td>מעבדות רנדוקס, קרומלין, בריטניה</td><td>TR210</td><td></td></tr><tr><td>ULTIMA GOLD XR נוזל נצנוץ</td><td>פרקין אלמר, חברון, קנטקי, ארה"ב</td><td>6013119</td><td></td></tr><tr><td>אולטרה-צנטריפוגה, רוטור S100AT4-497</td><td>SORVALL RC M120 GX</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד הלימפה המזנטרית הזורמת בעכברים לכימות קינטיקה של ספיגת שומנים תזונתיים והפרשת כילומיקרון

The Isolation of Flowing Mesenteric Lymph in Mice to Quantify In Vivo Kinetics of Dietary Lipid Absorption and Chylomicron Secretion

ליפופרוטאינים במעי, במיוחד כילומיקרונים עשירים בטריגליצרידים, הם גורם עיקרי לחילוף חומרים, דלקת ומחלות לב וכלי דם. עם זאת, בידוד ליפופרוטאינים במעיים קשה מאוד in vivo מכיוון שהם מופרשים לראשונה מהמעי הדק לתוך הלימפה המזנטרית. לאחר מכן הלימפה המכילה כילומיקרון מתרוקנת לתוך הווריד התת-קלאבי מצינור בית החזה כדי לספק רכיבים של הארוחה ללב, לריאות, ובסופו של דבר, למחזור הדם של כל הגוף. בידוד כילומיקרונים נאיביים אינו אפשרי מהדם, שכן טריגליצריד כילומיקרון עובר הידרוליזה מיד עם אינטראקציה עם ליפופרוטאין ליפאז וקולטני ליפופרוטאין אחרים במחזור. לכן, הליך פיסטולה הלימפה המקורי בן יומיים, שתואר על ידי בולמן ואחרים בחולדות, שימש היסטורית לבידוד לימפה מזנטרית טרייה לפני כניסתה לווריד בית החזה. פרוטוקול זה שופר והתמקצע על ידי מעבדתו של פטריק טסו במשך 45 השנים האחרונות, ומאפשר ניתוח של ליפופרוטאינים קריטיים אלה והפרשות מהמעיים. הליך פיסטולה לימפה Tso עודכן כעת ומוצג כאן באופן חזותי לראשונה. הליך מתוקן זה הוא טכניקה כירורגית של יום אחד להתקנת צינור הזנה לתריסריון, קנולציה של צינור הלימפה המזנטרי, ואיסוף לימפה לאחר ארוחה בעכברים מודעים. היתרונות העיקריים של טכניקות חדשות אלה כוללים את היכולת לשחזר לימפה מעכברים (אשר רותם את כוחם של מודלים גנטיים של עכברים); זמן ההרדמה המופחת לעכברים במהלך ההשתלה של צינור העירוי התריסריון וצינורית הלימפה; היכולת לדגום ברציפות לימפה לאורך כל תקופת האכלה ולאחר הלידה; היכולת למדוד כמותית הורמונים וציטוקינים לפני דילולם והידרוליזה אנזימטית בדם; ואת היכולת לאסוף כמויות גדולות של לימפה לבידוד ליפופרוטאינים במעי. טכניקה זו היא כלי רב עוצמה למדידה ישירה וכמותית של ספיגת חומרים מזינים בתזונה, סינתזת ליפופרוטאין במעי והפרשת כילומיקרון.

איור 2 מראה את הפרשת הטריגליצרידים בלימפה המזנטרית ואת קצבי זרימת הלימפה הממוצעים בעכברי n = 17 עכברי הבר האחרונים (WT) שעברו את הליך פיסטולה הלימפה החד-יומית המתוארת כאן. כפי שניתן לראות באיור 2A, ריכוז הטריגליצרידים בלימפה עולה בתגובה לבולוס תוך תריסריון של 300 μL של SMOFLipid. ריכוז שיא הטריגליצרידים מגיע ב~2-3 שעות לאחר הבולוס ויורד בהתמדה במהלך 6 שעות (מיד לפני המתת חסד). במקביל להפרשת טריגליצרידים, קצב זרימת הלימפה עולה מעירוי בולוס זמן 0 ועד סוף הניסוי (איור 2B).
תוצאות אלה מראות כי השתלה כירורגית הן של צינור הלימפה mesenteric והן צינורית intraduodenal התרחשו והם מייצגים של שליטה חיובית אשר תוכן לימפה אחרים (הורמונים, פפטידים, חומרים מזינים) יכול להיות benchmarked. אם אין שינוי בריכוז הטריגליצרידים בלימפה בתגובה לשומנים תוך תריסריים של בולוס, הדבר מאותת כי הניתוח גרם נזק משמעותי למעי הדק כך שיכולת ספיגת השומנים נעדרת, או, במודלים גנטיים שלא היו פנוטיפיים בעבר, הדבר מצביע על כך שלעכבר יש פגם בספיגת שומנים בעל משמעות פיזיולוגית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64338/64338fig01.jpg"> איור 1: ציר הזמן המוצע עבור מודל עכבר פיסטולה לימפה. T-4, T-3, T-2: קנולציה כפולה אורכת כ-2-4 שעות, ולאחריה מיקום העכברים בתאי התאוששות. T-1: ברגע שהעכברים נמצאים בתקופת ההחלמה, הם מקבלים עירוי תריסריון רציף של 5% גלוקוז-0.9% מלוחים. T0: העירוי התוך-תריסריון הרציף עובר מ-5% גלוקוז-0.9% מלוחים לעירוי של חומרים מזינים ניסיוניים. T0-T6: עכברים מקבלים גלוקוז תוך תריסריון רציף של 5% במי מלח או לחילופין חומרים מזינים רציפים. הלימפה נאספת מדי שעה בתקופה זו. נקודת קצה: עכברים מורדמים, וניתן לאסוף רקמות. הדמות נוצרה עם BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64338/64338fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64338/64338fig02.jpg"> איור 2: ריכוז טריגליצרידים של לימפה מזנטרית וקצב זרימה. עכברי בר צוידו בצינור הזנה תוך תריסריון וצינורית לימפה מזנטרית. עכברים קיבלו עירוי בולוס של 300 μL של שומנים. הלימפה נאספה במשך 6 שעות באליציטוטים לפי שעה ונשמרה על קרח. (A) תכולת הטריגליצרידים בלימפה נקבעה על ידי בדיקה כימית בכל אליציטוט של לימפה לשעה. (B) ב-6 השעות שלאחר עירוי הבולוס, זרימת הלימפה מסומנת כגרמים של לימפה המופרשים בשעה. נקודות הן אמצעים ± SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64338/64338fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>שיטות אספקת שומנים</td>
			<td colspan="6">המלצות/הוראות</td>
		</tr><tr><td>בולוס תחליב שומנים מעורב</td>
			<td colspan="6">ניתן להשתמש במינון של 0.3 מ"ל של ( A ) Liposyn III 20% הזרקת שומנים או (B) תחליב הזרקת שומנים SMOFlipid 20%, USP, באמצעות צינור עירוי תוך תריסריון. שומנים מתחלבים אלה שימושיים מכיוון שאין צורך להכין אותם מראש, הם נוזליים בטמפרטורת החדר, הם סטריליים, ומכיוון שהם מכילים תערובת "קלה לעיכול" של חומצות שומן חופשיות, טריגליצרידים, פוספוליפידים ונתרן טאורוכולט. זהו עירוי התחלה טוב עבור עכברים שעשויים להיות אי ספיקת לבלב או מרה.</td>
		</tr><tr><td>טריגליצרידים בולוס</td>
			<td colspan="6">0.3 מ"ל שמן זית מחומם בעדינות (או טריאולאין מטוהר) כשומני ניטרלי המשקף תזונה עשירה בשומן בלתי רווי, שומן חזיר (המשקף דיאטה עם תכולת שומן רווי גבוהה) או שמן קוקוס (המשקף דיאטה עם תכולת טריגליצרידים גבוהה בשרשרת בינונית) יכול להינתן על ידי צינור עירוי תוך תריסריון או גאוואז' אוראלי. אם הטריגליצרידים הניסיוניים רוויים, יש לחמם אותם כדי שיהיו נוזליים בטמפרטורת החדר.</td>
		</tr><tr><td>בולוס ארוחה מעורבת</td>
			<td colspan="6">0.3 מ"ל ניתן לתת באמצעות עירוי תוך תריסריון את הנוסחה המכילה 0.075 גרם שומן (21.6%), 0.5 גרם פחמימות (64.0%) ו-0.1125 גרם חלבון (14.4%) ומשקפת ארוחה מעורבת דלת שומן.</td>
		</tr><tr><td>בולוס שומנים רדיואקטיבי</td>
			<td colspan="6">5.0 μCi 3 H-labeled glycerol trioleate ו / או 1.0 μCi 14C- כולסטרול ב 0.3מ"ל של שמן זית ניתן לתת באמצעות עירוי תוך התריסריון. 14 C-כולסטרול: כולסטרול-[4-14C] עם פעילות ספציפית של 55Ci/mmol וריכוז של 0.1mCi/mL. 3 טריאולאין H-TG [9,10-3H(N)] (3H-TG) עם פעילות ספציפית של 60Ci/mmol וריכוז של 1mCi/mL</td>
		</tr><tr><td>מינון רציף</td>
			<td colspan="6">עירוי של כל אחד מתכשירים המזינים הניסיוניים הנ"ל בקצב של 0.3 מ"ל / שעה (במקום 0.3 מ"ל בולוס כולל), יביא לתפוקה קבועה של טריגליצרידים לתוך הלימפה. זה שונה מעירוי בולוס, שבו ריכוז הטריגליצרידים בלימפה מגיע לשיא של ~2-3 שעות, ואז חוזר לריכוזי הבסיס ב~6-8 שעות.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: טבלת חליטות שומנים.

הפרוטוקול הנוכחי מתאר פרוטוקול כירורגי מפורט לבידוד לימפה זורמת במעי בתגובה לעירויי חומרים מזינים תוך תריסריונים בעכברים. זה מאפשר קביעה פיזיולוגית של ספיגת שומנים כוללת במעי וסינתזה והפרשה של כילומיקרון בתגובה לחומרים מזינים ניסיוניים שונים.

Intestinal lipoproteins, especially triglyceride-rich chylomicrons, are a major driver of metabolism, inflammation, and cardiovascular diseases. However, ...

הפרוטוקול שלנו מאפשר לנו למדוד ישירות את חילוף החומרים לאחר הלידה בלימפה מזנטרית זורמת. זה חזק כי אנחנו יכולים לקבוע כמותית את התנועה של חומרים מזינים מן המעי הדק לתוך הלימפה. ואנחנו יכולים למדוד ציטוקינים, שומנים תזונתיים, רכיבים תזונתיים אחרים ולימפוציטים.טכניקה זו יכולה לעזור לנו לנתח את הדינמיקה של שומנים תזונתיים הנעים לתוך הלימפה, סינתזה והפרשה של כילומיקרון. למודל החד-יומי המוצג כאן יש כמה יתרונות. ראשית, זה מקטין את זמן הניסוי.שנית, היא מפחיתה את הלחץ של בעלי החיים. זה מגביר את הישרדות בעלי החיים. ובסך הכל, מקטין את מספר הניסויים.מי שידגים את הטכניקה שלנו היום יהיה מנתח המעבדה הבכיר שלנו, מר ניק דדוסיס. והמדען החוקר שלנו, ד"ר ליהונג טנג. לאחר הכנת העכבר לניתוח, לתפוס את העור עם פינצטה ולעשות חתך בטן קו האמצע עם מספריים קטנים.לאחר מכן, חותכים לכיוון עצם החזה ומטה לשומן המפשעה. באמצעות retractor, להזיז את הקרביים הצפק מהדרך עד צינור הלימפה גלוי. בעזרת קצה Q ספוג במי מלח, הניעו את הכבד לכיוון הצד הימני העליון של הגוף ואת המעיים והקיבה לכיוון שמאל של החיה.לאחר מכן לחשוף את העורק mesenteric העליון ואת צינור הלימפה המעי על ידי מתיחה התריסריון רוחבי לכיוון שמאל. הכינו צינורית באורך 30 עד 40 ס"מ על ידי החדרת מחט קהה. לאחר מכן, באמצעות מזרק של מיליליטר, שטפו כמות קטנה של הפרין דרך הצינור וחתכו שיפוע בקצה צינורית הצינורית באמצעות מספריים.לאחר מכן, בצע חתך רדוד וצינור לימפה באמצעות מספריים הקשתית כמתואר בכתב היד. החזיקו את צינורית הצינורית בעזרת זוג מלקחיים עדינים והכניסו בעדינות את קצה השיפוע לצינור. מכיוון שצינור הלימפה שביר, השתמש בטיפת ציאנואקרילט כדי להדביק את צינורית הלימפה לתוך הלימפה המזנטרית במקום לקשור את הצנתר בתפר.כעת, באמצעות מחט 18 מד, נקבו חור דרך האזור הפילורי של הקיבה האחורית לסוגר הפילורי, והכניסו את צינור העירוי התריסריון בקיבה מילימטר עד שני מילימטרים מעבר לסוגר הפילורי לתריסריון. לאחר מכן, הדקו את הצינור לקיבה באמצעות רצועת חוט ארנק באמצעות תפר משי 5/0 ואטמו בטיפת דבק ציאנואקרילט למניעת דליפה. התחל עירוי תריסריון של 5% גלוקוז ו 0.9% מלוחים.להחליף את האיברים בחלל הגוף ולתפור את חתך קו האמצע. הנח את העכבר בעדינות באיפוק מתכרבל. לספק את העכברים עם עירוי intraduodenal מתמשך של מלוחים גלוקוז במשך שעה אחת.בדוק את הצינורית עבור זרימת הלימפה ולהתחיל לחלוב את צינורית הלימפה כדי לשמור על הלימפה זורמת. בצע את עירוי השומנים הקלאסי של בולוס תחליב שומנים 0.3 מיליליטר דרך צינור העירוי תוך תריסריון. לאחר מכן, החזירו את העירוי ל-5% גלוקוז ו-0.9% מלוחים ב-0.3 מיליליטר לשעה ברציפות עד סוף הניסוי.לאסוף את דגימות הלימפה מראש לשקול צינורות מיקרו צנטריפוגות במשך 60 דקות ולשמור את הלימפה על קרח. לשקול את הצינורות בפעם השנייה כדי לקבוע את משקל הלימפה מופרש כל 60 דקות. אספו את הקיבה, הצקום והמעי הגס והכניסו כל איבר לצינור זכוכית של 15 מיליליטר.מחלקים את המעי הדק לשלושה או ארבעה מקטעים. חתכו אותו לאורכו ואספו את התוכן הלומינלי על ידי שטיפת הרקמה בשניים עד שלושה מיליליטר של PBS קר. הסר את רירית המעי המורכבת מתאי אפיתל ולמינה פרופריה הקשורה מהשכבה השרירית על ידי גירוד כל חלק בשניים עד שלושה מיליליטר של PBS קר עם טוויטר מעוקל.מניחים את כל הרקמות, את המבודד הלומינלי והרירית, ואת השכבה השרירית בצינורות זכוכית. ריכוז הטריגליצרידים בלימפה עלה בתגובה לבולוס תוך תריסריון של 300 מיקרוליטר SMOFlipid. ריכוז שיא הטריגליצרידים מגיע בשעתיים עד שלוש שעות לאחר הבולוס ויורד בהתמדה במהלך שש השעות.קצב זרימת הלימפה עולה מזמן עירוי בולוס אפס ועד סוף הניסוי. המטרה העיקרית של פרוטוקול זה הייתה להפחית את העקה של בעלי חיים, להגדיל את שיעור ההישרדות ולקצר את זמן ההרדמה. לשם כך החלפנו את כלובי הריסון של בולמן להתכרבלות, והוספנו לחות, חום וחידוש נוזלים.פרוטוקול פיסטולה צולעת ליום אחד שלנו מאפשר לנו למדוד בזמן אמת, in vivo, דינמיקה של ספיגת שומנים. זה גם מאפשר לנו לחקור את ההצלבה של איברי המעי, חילוף חומרים, ספיגת חומרים מזינים תזונתיים ופנוטיפים חיסוניים.

the-isolation-flowing-mesenteric-lymph-mice-to-quantify-vivo-kinetics

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שכבת פני שטח glycocalyx / אנדותל האנדותל היא למד באופן אידיאלי באמצעות מיקרוסקופ intravital. מיקרוסקופיה Intravital טכני מאתגרת באיבר מרגש כגון ריאות. אנחנו מדגימים איך brightfield סימולטני ומיקרוסקופיה ניאון ניתן להשתמש כדי להעריך את עובי שכבת פני שטח האנדותל שבנע...

במדידת vivo של שכבת פני שטח האנדותל ריאתי המאוסה

כאן אנו מתארים טכניקה לקנולציה של צינור הלימפה המזנטרי בחולדות המאפשרת כימות של הובלת שומנים ותרופות דרך מערכת הלימפה לאחר מתן המעי. ניתן להתאים את הטכניקה להערכת ריכוזי לימפה מזנטרית ו/או הובלה של נוזלים, תאי חיסון, פפטידים, חלבונים ומולקולות ליפופיליות.

לימפה Duct cannulated עכברוש דגם mesenteric: בקשה להערכה של המעיים הלימפה תרופות תחבורה

תאי Caco-2 יכולים לשמש כמודל במבחנה לחקר הובלת האנטרוציטים של שומנים, ותרופות/ויטמינים מסיסים בשומנים. מערכת הממברנה החדירה מפרידה בין התא האפיקלי לתא הבסיסי, בעוד שמערכת ביטוי ה-lentivirus מציעה שיטת ביטוי יתר יעילה של גנים. בידוד הליפופרוטאינים מאושר על ידי TEM.

באמצעות קאקו-2 תאים לחקר ליפידים תחבורה במעי

אנו מציגים הליך כירורגי לצנתור תא המטען של הלימפה במעי בחזירים יילודים כדי לאסוף כמויות גדולות של רכיבי חילוף חומרים של שומנים מלימפה זורמת.

צנתור לטווח ארוך של טרונק לימפה במעי וגביית הלימפה חזירים ילודים

יש עניין גובר באפיון הכמותי של לימפוציטים במעי עקב ההכרה הגוברת בכך שתאים אלה ממלאים תפקיד קריטי במגוון מחלות מעיים ומערכתיות. בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד לבודד אוכלוסיות תאים בודדים מתאי מעי דק שונים לאפיון ציטומטרי זרימה לאחר מכן.

אפיון בידוד תזרים Cytometric של Murine קטנים מעיים לימפוציטים

כאן נתאר פרוטוקול מפורט על הבידוד של לימפוציטים האתרים אינדוקטיבית כולל בלוטות לימפה mesenteric המנקזים ותיקונים של פייה רקמת הלימפה הקשורים הבטן, ואת האתרים אפקטור כולל את פרופריה. מוסקולריס ו אפיתל המעי של המערכת החיסונית קטנים במעיים.

לימפוציטים בידוד מן העכבר קטן המעי המערכת החיסונית

. הנה, נדגים את שיטות ויוו כימות של ליקוציט יציאה מן תמימה, מודלק, והעור מאתר ממאיר. אנו לבצע השוואת עפות בשני דגמים: transdermal FITC יישום, בחיי עיר photoconversion. יתר על כן, נדגים את התועלת של photoconversion עבור מעקב אחר ליקוציט היציאה של גידולים עורית.

לכימות ליקוציט היציאה דרך כלי הלימפה מ מאתר עור וגידולים

מאמר זה מספק שלוש גישות קלות ונגישות להערכת חילוף החומרים של השומנים בעכברים.

הערכת יכולת טיפול בליפידים בכל הגוף בעכברים

תפקוד מחסום אפיתל מעיים Dysregulated ותגובות חיסוניות הם סימני היכר של מחלות מעי דלקתיות שנותרו נחקרות בצורה גרועה בשל מחסור במודלים פיזיולוגיים. כאן, אנו מתארים מודל לולאת מעיים של עכברים המעסיק מקטע מעיים בעל כלי דם וחיצוניים כדי לחקור חלחיליות רירית וגיוס לויקוציטים ב- vivo.

הערכה תפקודית של חלחיליות מעיים ונדידה טרנס-אפיתלית נויטרופילית בעכברים באמצעות מודל לולאת מעיים מתוקננת

מאמר זה מתאר שיטה לבידוד מבוסס חרוזים מגנטיים של תאי אנדותל מורין מנימי לימפה עוריים. תאי האנדותל הלימפטיים המבודדים יכולים לשמש לניסויים במבחנה במורד הזרם ולניתוח ביטוי חלבונים.

Murine Dermal Lymphatic Endothelial Cell Isolation

פרוטוקול זה מתאר הליך הישרדות עבור לימפאדנקטומיה מזנטרית של עכברים בטוחה ונסבלת היטב, בכל אחת מארבע תחנות לאורך שרשרת בלוטות הלימפה המזנטריות. הליך זה ניתן להתאמה כדי לאפשר הפרעה סלקטיבית בתקשורת הלימפה עם המעי הגס הדיסטלי, המעי הגס הפרוקסימלי ו/או המעי הדק.

כריתת לימפאדנקטומיה מזנטרית של עכברים לשיבוש סלקטיבי בתקשורת לימפה עם מערכת העיכול הספציפית לאזור

למדו לבודד לימפה מזנטרית זורמת בעכברים למדידת ספיגת שומנים וסינתזת כילומיקרון בזמן אמת. פרוטוקול יום אחד זה מפחית מתח בבעלי חיים ומגביר שרידות.

בידוד הלימפה המזנטרית הזורמת בעכברים לכימות קינטיקה של ספיגת שומנים תזונתיים והפרשת כילומיקרון

גלה סרטונים נוספים