פענוח המנגנון המולקולרי והתפקוד של רעלנים יוצרי נקבוביות באמצעות לישמניה מז'ור
28 באוקטובר 2022
מוצג כאן פרוטוקול המשתמש בפרומסטיגוטים גדולים של לישמניה כדי לקבוע את הקשירה, הציטוטוקסיות והאיתות המושרים על ידי רעלנים היוצרים נקבוביות. הוכחת היתכנות עם סטרפטוליזין O מסופקת. רעלנים אחרים יכולים לשמש גם כדי למנף את המוטציות הגנטיות הזמינות בל' מז'ור כדי להגדיר מנגנונים חדשים של עמידות לרעלנים.
מנגנון ההתנגדות לרעלים היוצרים נקבוביות אינו מובן היטב. הפרוטוקול שלנו מאפשר תפקוד ומנגנון ליצירת רעלנים היוצרים נקבוביות באמצעות לישמניה מז'ור, מערכת הניתנת למתיחה גנטית ורלוונטית מבחינה פיזיולוגית. היתרון העיקרי של בדיקת הציטוטוקסיות הוא השוואת כדאיות התא של פנוטיפים מרובים ברמה של תא בודד במבחן בעל תפוקה בינונית כאשר מאותגרים עם רעלנים בזמן אמת.
חומרים המפריעים לממברנה כמו אמפוטריצין B הם טיפולים בחזית עבור לישמניה. בדיקה זו מאפשרת לזהות חומרים המחזקים אמפוטריצין B ו/או חומרים חדשים הפוגעים בממברנה. בדיקה זו מספקת תובנות לגבי תחומים כגון תגובת תיקון ומסלולי איתות הקשורים לתגובות לתיקון.
בדיקה זו יכולה להיות מיושמת על פרוטוזואנים כגון טריפנוסומה ו Naegleria fowleri. אנשים מתקשים להבין את סדרת דילול הרעלן. אז העצה הטובה ביותר שאני יכול לתת היא לצייר שרטוט של סדרת הדילול הסדרתי לפני שאתה מגדיר את הניסוי.
כדי להתחיל, שמור 0.5 מיליליטר של promastigotes מעובד בצינור נפרד כמו שליטה מוכתמת. הוסף שני מיליגרם למיליליטר פרופידיום יודיד, או PI, לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר לפרומסטיגוטים הנותרים. וורטקס במשך שלוש שניות.
הוסיפו פרומסטיגוטים מעובדים לכל באר של תחתית V, צלחת 96 בארות או צינורות מארש, והניחו את הצלחת או מתלה הצינורות על הקרח בזווית של כ-45 מעלות מהצפייה. הוסף 100 מיקרוליטרים של חיץ בדיקה עם פרופידיום יודיד לכל בקרה ללא רעלן. ודא שהפקד נוסף כראוי על-ידי זיהוי חזותי של צינורות עם נפח כולל של 200 מיקרוליטר שנראים בצבע כהה יותר.
הוסף את נפח הרעלן לדילול הגבוה ביותר. לאחר מכן, באופן סדרתי לדלל את הרעלן. פיפטה למעלה ולמטה לפחות שמונה פעמים כדי להבטיח ערבוב.
החל מריכוז הרעלן הנמוך ביותר, הוסיפו במהירות 100 מיקרוליטרים של רעלן לשורה הנכונה, והמשיכו עד שכל הרעלן נוסף לתאים. אטמו את הצלחת עם סרט איטום. לאחר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, לארוז ולהעביר את הצלחת ציטומטר זרימה.
לרכישת נתונים, התחל בהגדרת ציטומטר זרימה ותוכנת רכישה בהתאם להוראות היצרן ובהתאם למדיניות המתקן. באמצעות דגימת הפרומסטיגוטה L.major שלא הוכתמה, הגדר את השערים לפיזור קדימה ולצד ואת הפרמטרים הפלואורסצנטיים הראשוניים בהתבסס על הצבעים שנבחרו. באמצעות פקדים מוכתמים יחיד, הגדר את השערים לצבע הכדאיות ולכל רעלנים המסומנים באופן פלואורסצנטי.
עקוב אחר פיזור קדימה לעומת זמן עבור מיקרוקלוגים, ורכוש יותר מ -10, 000 אירועים מגודרים עבור כל דגימה בציטומטר. לצורך ניתוח נתונים, שער סך כל הפרומסטיגוטים החד-תאיים L.major על ידי פיזור קדימה וצד וזמן לפי הצורך. השתמש בגובה או באזור לפי המומלץ עבור ציטומטר הזרימה.
זהה ושער תאים מתים כ-PI גבוה. ארגן את עקומת המינון-תגובה ב- Excel לניתוח. קבע את אחוז ה-PI הממוצע הגבוה עבור כל תנאי בין שני המשכפלים הטכניים.
כלול ריכוז רעלנים ואחוז ממוצע של תזה ספציפית, יחד עם פרטים ניסיוניים ו/או חישובים גבוהים של אחוזי PI גולמיים. תייג ארבע עמודות נוספות כ'מדוגמלים', 'שיורית', 'פרמטרים' ו'ערכי פרמטרים'. ודא שהעמודות הראשונות תואמות לפרמטרים הניסוייים, לריכוז הרעלן ולאחוז הליזיס הספציפי.
אתחל את הפרמטרים L, k ו- c על-ידי הזנת הערכים בעמודה ערכי פרמטרים. בעמודה Modeled, צור את המודל הלוגיסטי. בעמודה שאריות, חשב את ריבוע ההפרש בין המספר הממודל לבין התזה הספציפית בפועל.
בעמודה ערכי פרמטרים, לצד SUM, סכם את כל הערכים בעמודה שיורית. בעמודה ערכי פרמטרים, לצד LC50, אתחל את המשוואה כדי לחשב את LC50 מהערכים שנקבעו. פתח את Solver מהכרטיסיה נתונים.
בחר את המטרה שנקבעה להיות התא המכיל את סכום השאריות שחושבו. הגדר אותו ל- Min. שנה את תאי המשתנים עבור ערכי הפרמטרים של L, k ו- c.
עבור ערכי k שליליים, שנה את המשוואות על-ידי חישוב משוואות שליליות מ-k כדי לשנות את k לחיובי. השתמש בשיטת הפתרון הלא ליניארי GRG ולחץ על פתור. בדוק את העקומה ושה- LC50 מחושב באופן אוטומטי.
אמת את ההתאמה על-ידי התוויית נתונים גרפיים הן של אחוזי תסיסה ספציפיים והן של מידול כנגד ריכוז רעלנים. פרומסטיגוטי הנוקאאוט SPT2 חסרי הספינגוליפידים היו רגישים ל-SLO הן ב-M199 נטול סרום והן בחיץ של טיירודה. פרומסטיגוטים מסוג Wild ו-SPT2 היו עמידים בפני SLO ב-M199 נטול סרום, אך היו להם פחות מ-20% תזה ספציפית במאגר של Tyrode.
הפרומסטיגוטים של הנוקאאוט SPT2 היו רגישים בערך פי שמונה ל-SLO בחיץ של טיירוד מאשר ב-M199. נתונים אלה מראים כי הרגישות לרעלנים עשויה להשתנות בהתאם למאגר שבו נעשה שימוש. רצועה של 120 קילו-דלטון נצפתה עבור פוספו-MEK בפרומסטיגוטים של L.major.
עבור MEK הכולל, נצפו להקות בכ-120 קילו-דלטון ו-55 קילו-דלטון, התואמות את הגדלים של MRK1 ו-LmxMKK, בהתאמה. Phospho-ERK זיהה פסים דומים, בעוד שכתם נוגדני ERK לא היה חזק בבדיקה זו. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור כאשר מנסים הליך זה הוא להבטיח את הטיפול הנכון של הרעלן.
ניתן להשתמש בלישמניה כמודל הניתן למתיחה גנטית כדי לחקור תיקון ממברנות פלזמה, ולספק תובנות חדשות על מכניקת תיקון ממברנות במהלך אינטראקציה של חיידקי לישמניה במידגוט החול.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה משתמש ב-promastigotes של Leishmania major כדי לחקור את מנגנוני ההיקשרות, הציטוטוקסיות והסיגנלינג המושרים על ידי רעלנים יוצרי נקבים (pore-forming toxins). הוא כולל הוכחת היתכנות באמצעות streptolysin O ומדגיש את הפוטנציאל לשימוש ברעלנים שונים לבחינת מנגנוני עמידות לרעלנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביולוגיה של התא
- מיקרוביולוגיה
רקע
- מנגנוני העמידות לרעלים יוצרי נקבים אינם מובנים היטב.
- Leishmania major משמשת כמודל הניתן לתמניפולציה גנטית לצורך חקר מנגנונים אלו.
- בדיקות ציטוטוקסיות יכולות להעריך את חיוניות התאים על פני פנוטיפים שונים.
- חומרים המשבשים את ממברנת התא, כגון amphotericin B, נמצאים בשימוש נפוץ בטיפול.
מטרת המחקר
- להביר את התפקוד והמנגנונים של רעלים יוצרי נקבים.
- לזהות חומרים המשפרים את היעילות של amphotericin B.
- לחקור חומרים חדשים הגורמים לנזק לממברנה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- שימוש בפרומסטיגוטים של *Leishmania major* במערכי בדיקה.
- הערכה בזמן אמת של חיוניות תאים בתגובה לרעלים.
- השוואה של פנוטיפים מרובים בפורמט בעל תפוקה בינונית.
- חקירה של תגובות תיקון ומסלולי איתות קשורים.
תוצאות עיקריות
- הדגמה של ההשפעות הציטוטוקסיות של רעלים יוצרי נקבים על Leishmania major.
- זיהוי של חומרים פוטנציאליים שיכולים להגביר את יעילותן של תרפיות קיימות.
- מתן תובנות לגבי מנגנוני תיקון תאיים.
- הדגשת התועלת של הבדיקה למחקר של עמידות לרעלים.
מסקנות
- הפרוטוקול מהווה כלי בעל ערך להבנת אינטראקציות של רעלים.
- הוא עשוי להוביל לגילוי של אסטרטגיות טיפוליות חדשות נגד Leishmania.
- מחקרים עתידיים יכולים להרחיב את ההבנה של מנגנוני העמידות לרעלים יוצרי נקבים (pore-forming toxins).
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסגרת ניהולית
מנגנוני עמידות לרעלים יוצרי נקבים (PFT) נותרו גורם לא ידוע קריטי בביולוגיה של מחלות זיהומיות ובגילוי תרופות המכוונות לממברנה. שימוש ב-Leishmania major כמודל רלוונטי פיזיולוגית וניתן לטיפול גנטי מאפשר חקירה בביטחון גבוה של דינמיקה של ממברנות ורגישות לרעלים, דבר המנחה באופן ישיר תיקוף מטרות בשלבים מוקדמים והסרת סיכונים מכניסטיים. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי עבור תרופיהות הפעילות בממברנה ובסיווג תיקי פיתוח של תרופות אנטי-זיהומיות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תיקוף פונקציונלי של מסלולי תיקון ממברנה ושל גנים הקשורים לרגישות לרעלנים.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי הבהרת התרומות של ליפידים וחלבונים לתגובה לרעלנים.
- מקל על ביצוע ניתוח השוואתי של פנוטיפים תחת חשיפה מבוקרת לרעלנים.
- מספק מערכת ניתנת למניפולציה גנטית לצורך בחינה מונחית-השערות של ביולוגיה של ממברנות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק בדיקות ציטוטוקסיות כמותיות ברמת תפוקה בינונית עבור תרכובות הפעילות בממברנה.
- מנstandardizes קריאות של חיוניות וליזיס באמצעות ציטומטריה של זרימה וצביעה ב-propidium iodide.
- מאפשר מידול מסיבי של תגובה למספר (dose-response) וקביעת LC50 לצורך הערכת תרכובות.
- תומך בסריקה הדירה של חומרים המגבירים או מעכבים נזק לממברנה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מקשר בין ממצאים הנוגעים לתיקון ממברנות ולרגישות לרעלנים לבין מודלים של פרוטוזואים הרלוונטיים למחלה.
- מאפשר רצף מגילוי במערכות in vitro למודלים של זיהום in vivo במערכות עכבריות.
- תומך בקידום מותאם סיכונים של תרפיה המכוונת לממברנה.
- מספק תובנות מכניסטיות הישימות לפתוגנים קשוריים ולמחלקה של תרופות הפועלות על ממברנות.
שילוב זרימת עבודה ומסלול עיבוד
פלטפורמה זו משלבת תהליכים החל משלב הגילוי המוקדם, דרך זיהוי מובילים (leads) ועד לתיקוף פרה-קליני עבור סוכנים הפועלים על ממברנות ואסטרטגיות אנטי-זיהומיות.
- ביולוגיה של הגילוי: תומכת בבדיקת היפותזות על תיקון ממברנות, הרכב ליפידים ומסלולי תגובה לרעלים.
- סריקה: מספקת נתונים כמותיים וניתנים לשחזור על ציטוטוקסיות וליזיס לצורך מיון תרכובות.
- אנליזה: מאפשרת מידול לוגיסטי, חישוב LC50 והשוואה סטטיסטית של פנוטיפים ותנאים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאים in vitro למודלים של זיהום in vivo להמשכיות תרגומית.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה ניתנת לשחזור וניתנת להרחבה למחקרים על ביולוגיה של ממברנות ומנגנוני רעלים במגוון סוכנים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי במנגנוני תרופות המכוונות לממברנה ובתיקוף מטרות.
- ערך תפעולי: מתקנן את זרימות העבודה של בדיקות ציטוטוקסיות ומאפשר בדיקות הדירות בעלות תפוקה בינונית.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות של go/no-go עבור תרכובים הפעילים בממברנה ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים טיפוליים אנטי-אינפקטיביים ופעילים בממברנה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול פרוטואזואים, ציטומטריה של זרימה וניתוח נתונים כמותי.
- נדרשת גישה למכשור ציטומטריה של זרימה ולתוכנה אנליטית למידול.
- דורש סטנדרטיזציה בין צוותים להגדרת הבדיקה, לבקרות ולפירוש הנתונים.
- ניתן להתאמה למודלים אחרים של פרוטואזואים בעלי ביולוגיה ממברנלית דומה.
- הרכב התמיכה והטיפול ברעלים הם קריטיים להשחזרות ולשלמות הנתונים.
