פענוח המנגנון המולקולרי והתפקוד של רעלנים יוצרי נקבוביות באמצעות לישמניה מז'ור

מנגנון ההתנגדות לרעלים היוצרים נקבוביות אינו מובן היטב. הפרוטוקול שלנו מאפשר תפקוד ומנגנון ליצירת רעלנים היוצרים נקבוביות באמצעות לישמניה מז'ור, מערכת הניתנת למתיחה גנטית ורלוונטית מבחינה פיזיולוגית. היתרון העיקרי של בדיקת הציטוטוקסיות הוא השוואת כדאיות התא של פנוטיפים מרובים ברמה של תא בודד במבחן בעל תפוקה בינונית כאשר מאותגרים עם רעלנים בזמן אמת.

חומרים המפריעים לממברנה כמו אמפוטריצין B הם טיפולים בחזית עבור לישמניה. בדיקה זו מאפשרת לזהות חומרים המחזקים אמפוטריצין B ו/או חומרים חדשים הפוגעים בממברנה. בדיקה זו מספקת תובנות לגבי תחומים כגון תגובת תיקון ומסלולי איתות הקשורים לתגובות לתיקון.

בדיקה זו יכולה להיות מיושמת על פרוטוזואנים כגון טריפנוסומה ו Naegleria fowleri. אנשים מתקשים להבין את סדרת דילול הרעלן. אז העצה הטובה ביותר שאני יכול לתת היא לצייר שרטוט של סדרת הדילול הסדרתי לפני שאתה מגדיר את הניסוי.

כדי להתחיל, שמור 0.5 מיליליטר של promastigotes מעובד בצינור נפרד כמו שליטה מוכתמת. הוסף שני מיליגרם למיליליטר פרופידיום יודיד, או PI, לריכוז סופי של 10 מיקרוגרם למיליליטר לפרומסטיגוטים הנותרים. וורטקס במשך שלוש שניות.

הוסיפו פרומסטיגוטים מעובדים לכל באר של תחתית V, צלחת 96 בארות או צינורות מארש, והניחו את הצלחת או מתלה הצינורות על הקרח בזווית של כ-45 מעלות מהצפייה. הוסף 100 מיקרוליטרים של חיץ בדיקה עם פרופידיום יודיד לכל בקרה ללא רעלן. ודא שהפקד נוסף כראוי על-ידי זיהוי חזותי של צינורות עם נפח כולל של 200 מיקרוליטר שנראים בצבע כהה יותר.

הוסף את נפח הרעלן לדילול הגבוה ביותר. לאחר מכן, באופן סדרתי לדלל את הרעלן. פיפטה למעלה ולמטה לפחות שמונה פעמים כדי להבטיח ערבוב.

החל מריכוז הרעלן הנמוך ביותר, הוסיפו במהירות 100 מיקרוליטרים של רעלן לשורה הנכונה, והמשיכו עד שכל הרעלן נוסף לתאים. אטמו את הצלחת עם סרט איטום. לאחר דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות, לארוז ולהעביר את הצלחת ציטומטר זרימה.

לרכישת נתונים, התחל בהגדרת ציטומטר זרימה ותוכנת רכישה בהתאם להוראות היצרן ובהתאם למדיניות המתקן. באמצעות דגימת הפרומסטיגוטה L.major שלא הוכתמה, הגדר את השערים לפיזור קדימה ולצד ואת הפרמטרים הפלואורסצנטיים הראשוניים בהתבסס על הצבעים שנבחרו. באמצעות פקדים מוכתמים יחיד, הגדר את השערים לצבע הכדאיות ולכל רעלנים המסומנים באופן פלואורסצנטי.

עקוב אחר פיזור קדימה לעומת זמן עבור מיקרוקלוגים, ורכוש יותר מ -10, 000 אירועים מגודרים עבור כל דגימה בציטומטר. לצורך ניתוח נתונים, שער סך כל הפרומסטיגוטים החד-תאיים L.major על ידי פיזור קדימה וצד וזמן לפי הצורך. השתמש בגובה או באזור לפי המומלץ עבור ציטומטר הזרימה.

זהה ושער תאים מתים כ-PI גבוה. ארגן את עקומת המינון-תגובה ב- Excel לניתוח. קבע את אחוז ה-PI הממוצע הגבוה עבור כל תנאי בין שני המשכפלים הטכניים.

כלול ריכוז רעלנים ואחוז ממוצע של תזה ספציפית, יחד עם פרטים ניסיוניים ו/או חישובים גבוהים של אחוזי PI גולמיים. תייג ארבע עמודות נוספות כ'מדוגמלים', 'שיורית', 'פרמטרים' ו'ערכי פרמטרים'. ודא שהעמודות הראשונות תואמות לפרמטרים הניסוייים, לריכוז הרעלן ולאחוז הליזיס הספציפי.

אתחל את הפרמטרים L, k ו- c על-ידי הזנת הערכים בעמודה ערכי פרמטרים. בעמודה Modeled, צור את המודל הלוגיסטי. בעמודה שאריות, חשב את ריבוע ההפרש בין המספר הממודל לבין התזה הספציפית בפועל.

בעמודה ערכי פרמטרים, לצד SUM, סכם את כל הערכים בעמודה שיורית. בעמודה ערכי פרמטרים, לצד LC50, אתחל את המשוואה כדי לחשב את LC50 מהערכים שנקבעו. פתח את Solver מהכרטיסיה נתונים.

בחר את המטרה שנקבעה להיות התא המכיל את סכום השאריות שחושבו. הגדר אותו ל- Min. שנה את תאי המשתנים עבור ערכי הפרמטרים של L, k ו- c.

עבור ערכי k שליליים, שנה את המשוואות על-ידי חישוב משוואות שליליות מ-k כדי לשנות את k לחיובי. השתמש בשיטת הפתרון הלא ליניארי GRG ולחץ על פתור. בדוק את העקומה ושה- LC50 מחושב באופן אוטומטי.

אמת את ההתאמה על-ידי התוויית נתונים גרפיים הן של אחוזי תסיסה ספציפיים והן של מידול כנגד ריכוז רעלנים. פרומסטיגוטי הנוקאאוט SPT2 חסרי הספינגוליפידים היו רגישים ל-SLO הן ב-M199 נטול סרום והן בחיץ של טיירודה. פרומסטיגוטים מסוג Wild ו-SPT2 היו עמידים בפני SLO ב-M199 נטול סרום, אך היו להם פחות מ-20% תזה ספציפית במאגר של Tyrode.

הפרומסטיגוטים של הנוקאאוט SPT2 היו רגישים בערך פי שמונה ל-SLO בחיץ של טיירוד מאשר ב-M199. נתונים אלה מראים כי הרגישות לרעלנים עשויה להשתנות בהתאם למאגר שבו נעשה שימוש. רצועה של 120 קילו-דלטון נצפתה עבור פוספו-MEK בפרומסטיגוטים של L.major.

עבור MEK הכולל, נצפו להקות בכ-120 קילו-דלטון ו-55 קילו-דלטון, התואמות את הגדלים של MRK1 ו-LmxMKK, בהתאמה. Phospho-ERK זיהה פסים דומים, בעוד שכתם נוגדני ERK לא היה חזק בבדיקה זו. הדבר החשוב ביותר שיש לזכור כאשר מנסים הליך זה הוא להבטיח את הטיפול הנכון של הרעלן.

ניתן להשתמש בלישמניה כמודל הניתן למתיחה גנטית כדי לחקור תיקון ממברנות פלזמה, ולספק תובנות חדשות על מכניקת תיקון ממברנות במהלך אינטראקציה של חיידקי לישמניה במידגוט החול.