גישת הדמיה תוך-חיונית פלואורסצנטית לחקר דינמיקת איתות סידן הנגרמת על ידי עומס באוסטאוציטים של עכברים
24 בפברואר 2023
המאמר הנוכחי מתאר ביצוע גישת הדמיה תוך-חיונית כדי לצפות באיתות סידן המושרה מכנית של אוסטאוציטים משובצים in vivo בזמן אמת בתגובה לעומס מכני ברמת הרקמה של המטטרסל השלישי של העכבר.
פרוטוקול זה מספק דרך לצפות באוסטאוציטים משובצים in vivo המייצגים התקדמות חשובה בחקר המכנוביולוגיה של העצם. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היכולת לצפות באירועים ברמה התאית והמולקולרית באוסטאוציטים in vivo, לשמור על הסידור המרחבי התלת-ממדי המקורי שלהם, זרימת הדם והתנאים האנדוקריניים, ולהתגבר על המגבלות המוטלות בדרך כלל על ידי ניסויים תאיים במבחנה. טכניקה זו מיועדת לחקירה מדעית בסיסית במודלים של עכברים. הם עדיין לא מרחיבים את הטיפול או האבחון, אך מספקים הזדמנות לתובנות המגדירות את הדור הבא של טיפולי העצמות.
[קריין] כדי להתחיל, בצע חתך אזמל דרך הדרמיס בין המטטרסל השני והשלישי, החל מהקצה הדיסטלי והתקדם באופן קרוב לאורך העצמות. בעזרת מלקחיים, פתח את אתר הניתוח על ידי משיכת העור לכיוון הקצוות המדיאליים או הצדדיים. כרתו את הגידים המאריכים באמצעות מספריים ישרים של Vannas כדי לחשוף את המטטרסל השלישי. הכנס את סיכת נקודת המשען המרכזית של מכשיר הטעינה המטטרסלית לחלל הקטן בקצה הדיסטלי שבו המטטרסל השלישי פוגש את הפלנגה הפרוקסימלית. לאחר מכן הזז את הסיכה קרוב עד שהיא מונחת באמצע המטטרסל השלישי. הקפד במיוחד להבטיח ממשק ישיר בין העצם לסיכה, למעט כל שריר ופאשיה. החזק את הקרסול עם מלקחיים והנח את כף הרגל לאמבט המים המלא DPBS. אבטח את הכפה במקומה עם תושבת הטעינה וחבר את התושבת לסידור תא העומס של המפעיל. הרם בזהירות את מערך התקן הטעינה עם העכבר והנח אותו על פלטפורמת המיקרוסקופ. התחל עם מטרת ההגדלה הנמוכה במצב אפיפלואורסצנטי כדי לאתר ולמרכז את אמצע הדיאפיזה של העצם. לאחר איתור אזור מעניין, עבור להגדלה אובייקטיבית גבוהה יותר של טבילה במים והעביר את האופטיקה לשני פוטונים. קבעו את צפיפות הפיקסלים בעזרת קביעות בקרת האזור Galvo/Resonance. כדי למנוע הלבנת תמונה, הפחת את ההספק באמצעות אפשרות בקרת הכוח והגדל את ה-PMT ampבהגדרות הבקרה של סורק Galvo/Resonance. זהה את פני העצם במצב שני פוטונים על ידי חיפוש האוטו-פלואורסצנציה הסיבית periosteum בתעלה הירוקה המשתמשת במסנן מעבר פס שמרכזו 525 ננומטר. אם יש תנועה גלויה של העצם במהלך ההעמסה, בחר אזור עניין אחר לאורך כיווני Y או Z כדי לוודא שהוא נמצא ישירות מעל סיכת נקודת המשען המרכזית. אם התנועה נמשכת, כוונן את המיקום הכירורגי של הסיכה באופן ידני מתחת למטטרסל השלישי. בצע הדמיית מחסנית Z עם טעינה בהתאם לתכנון הניסוי כדי לתעד את אירועי האיתות המורפומטריים, ולאחר מכן הדמיה מסדרת T עם טעינה כדי לתעד את אירועי האיתות המושרים על ידי עומס דינמי. תמונה של שני פוטונים במישור יחיד של אוסטאוציטים מטטרסליים המבטאים GCaMp6f in vivo מוצגת כאן. ביטוי אנדוגני של מבני מדווח סידן מספק מטרה פלואורסצנטית ללא צורך בדגירה. הקרנת Z תלת מימדית של אוסטאוציטים in vivo שנלכדו במיקרוסקופ שני פוטונים מוצגת באיור זה. החיתוך הרוחבי במישור ה-XY והחיתוך הסגיטלי מראים את עומק ערימת ה-Z. התמונה המייצגת מציגה מהלך זמן לדוגמה של אות פלואורסצנטי GCaMp6f מאוסטאוציט משובץ. במנוחה מוצגות תנודות רועשות ברמה נמוכה. עם ההעמסה, תנודות הסידן גדלות בגודלן ובסדירותן, ומתרחשות לעתים קרובות במקביל לטעינה מיושמת.
שיטה זו סוללת את הדרך לחוקרים לענות על שאלות מבוססות תפקוד הנוגעות למכניוביולוגיה של אוסטאוציטים in vivo שבעבר היו אפשריות רק במבחנה או ex vivo.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לדימוי תוך-חי (intravital imaging) לצורך תצפית על איתות סידן באוסטאוציטים בתגובה לעומס מכני in vivo. התקדמות זו מאפשרת תצפית בזמן אמת על אירועים תאיים תוך שמירה על הסביבה הטבעית של העצם.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מכנוביולוגיה של העצם
- טכניקות של דימוי תוך-חי (Intravital imaging)
- סיגנל Calcium באוסטאוציטים
רקע
- אוסטאוציטים ממלאים תפקיד מכריע במכנוביולוגיה של העצם.
- שיטות in vitro מסורתיות מגבילות את ההבנה של תגובות תאיות בסביבתם הטבעית.
- טכניקה זו מאפשרת תצפית על אוסטאוציטים תוך שימור הסידור המרחבי התלת-ממדי ותנאי הפיזיולוגיה שלהם.
- תובנות שיתקבלו עשויות להנחות אסטרטגיות עתידיות לטיפול בעצם.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה לצפייה בתאי עצם (osteocytes) בעצם (in vivo) במהלך העמסה מכנית.
- שיפור ההבנה של דינמיקת אותות הסידן בתאי עצם.
- יצירת תשתית למחקרים עתידיים בנושאי בריאות ומחלות של העצם.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- חתך בסקלפל להגעה למטאטרזל השלישי בעכברים.
- שימוש במכשיר להעמסת מטאטרזל להפעלת מאמץ מכני.
- מיקרוסקופיה דו-פוטונית להדמיה של אוסטאוציטים בזמן אמת.
- תיעוד אירועי איתות המושרים על ידי עומס דינמי באמצעות הדמיית Z stack ו-T series.
תוצאות עיקריות
- דימוי בזמן אמת חשף תנודות של סידן בתאי עצם (osteocytes) במהלך העמסה.
- עוצמת האותות הפלואורסצנטיים עלתה עם עליית המאמץ המכני.
- דימוי בתלת-ממד סיפק תובנות לגבי הסידור המרחבי של תאי העצם.
- הוכשחה יעילותה של הטכניקה לחקר המכנו-ביולוגיה של העצם.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר התקדמות משמעותית בחקר המכנוביולוגיה של העצם.
- דימות בזמן אמת של אוסטאוציטים עשוי להוביל להבנה טובה יותר של בריאות העצם.
- טכניקה זו עשויה לסלול את הדרך לאסטרטגיות טיפוליות עתידיות בטיפול בעצם.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי ישיר in vivo של איתות סידן באוסטאוציטים תחת עומס מכני נותן מענה לפער קריטי בהבנת התמסורת המכנית של העצם ברמה המולקולרית. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבי הגילוי המוקדמים על ידי מתן אפשרות לתצפית בזמן אמת על מסלולים של חישה מכנית בהקשרם הפיזיולוגי הטבעי. גישה זו תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים ומספקת מידע לתיקוף מטרות עבור תיקי מחקר של בריאות העצם ומחלות השלד.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה של מסלולי חישה מכנית של אוסטאוציטים בהקשר פיזיולוגי רלוונטי.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי שמירה על ארכיטקטורה תלת-ממדית טבעית והשפעות סיסטמיות.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של מטרות למנגנוני העברה מכנית בעצם.
- משפר את רמת הביטחון החזויה לצורך תיעדוף של מטרות הקשורות לעצם.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכת in vivo מתוּקפת לכימות דינמיקת אותות סידן בתגובה לעומסים מכניים מוגדרים.
- מאפשר קבלת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור של פעילות אוסטאוציטים לצורך פיתוח בדיקות המשך.
- תומך בסטנדרטיזציה של בדיקות מכנו-טרנסדוקציה להערכת תרכובות.
- מניח את היסודות לסריקה במערך רחב של מודולטורים המשפיעים על הרגישות המכנית של העצם.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מסנכרן תובנות מכניסטיות עם מודלי עצם רלוונטיים למחלה לצורך רציפות תרגומית.
- מאפשר קידום מותאם-סיכונים של התערבויות המכוונות לעצם, בהתבסס על נתונים מכניסטיים in vivo.
- תומך בזיהוי של סמנים ביולוגיים תרגומיים הקשורים לדינמיקה של איתות בתאי עצם (osteocytes).
- מקשר בין ממצאים משלב הגילוי לבין תיקוף פרה-קליני במערכות שלמות.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
שיטת הדמיה אינטרה-ויטלית זו משלבת בין שלב הגילוי המוקדם למחקר פרה-קליני, ומאפשרת בדיקה ישירה של היפותזות והבהרה של מסלולים ברקמת עצם חיה.
- ביולוגיה של הגילוי: תומך בבדיקת היפותזות מכניסטיות של תגובות אוסטוציטים לגירויים מכניים in vivo.
- סריקה: מספק מדידות כמותיות וניתנות לשחזור של איתות סידן לצורך מוכנות של הבדיקה.
- אנליטיקה: מספק קריאות פלואורסצנטיות דינמיות להשוואת איתות תחת תנאי העמסה שונים.
- מחקר תרגומי: מקשר בין אירועי איתות מולקולריים לתוצאות תפקודיות של העצם כולה במודלים רלוונטיים למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פלטפורמה לשימוש חוזר למחקרי מכנו-ביולוגיה בתוכניות מחקר של עצמות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר של התמרות מכניות בעצם.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של זרימות עבודה בדימות in vivo לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של go/no-go ומשפר את היעילות ההונית במחקר ופיתוח המכוונים לעצם.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תעדוף מותאם סיכון של נכסים בתחומי בריאות העצם ומחלות השלד.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בדימיון תוך-חי (intravital imaging) ובטכניקות ניתוח בבעלי חיים קטנים.
- מחייב גישה למיקרוסקופיה דו-פוטונית ולמכשור להפעלת עומס מכני מדויק.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית עבור פרמטרי ההדמיה וניתוח הנתונים.
- התאמה לאתרים אחרים בעצם או למודלים אחרים עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- מוגבל למחקרים במדעי הבסיס במודלים של עכברים, כפי שנתמך על ידי הנתונים הנוכחיים.
