הדמיה ברזולוציית על של חלבונים המופרשים על ידי חיידקים באמצעות הרחבת קוד גנטי

הרחבת הקוד הגנטי, או GCE, מתגברת על מגבלות של אסטרטגיות תיוג אחרות. זה מאפשר לנו לאתר חלבונים מסומנים ספציפית, ויש לנו פלואורופורים אורגניים בהירים המאפשרים הדמיה שלהם, כך שאנו יכולים להימנע מאסטרטגיות שיוצרות, למשל, איחוי חלבונים פלואורסצנטיים, שיכולים לשבש את תפקוד החלבון. שיטה זו יכולה להיות מיושמת על כל מערכת אחרת.

לדוגמה, השתמשנו בו כדי לתייג חלבון זיקה CO, וזה מאפשר לנו לספק ולייצר נגיף זיקה מסומן שנוכל לצפות בו מדביק תאים מארחים. כדי להתחיל, להעביר 100 מיקרוליטר של תרבית ראשונית לתוך חמישה מיליליטר של LB בינוני המכיל 35 מיקרוגרם למיליליטר chloramphenicol ו 100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין. דוגרים ב-37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב-250 סל"ד עד שהצפיפות האופטית ב-600 ננומטר מגיעה ל-0.6.

החלף את מדיום LB בתווך N-minimal שונה בתוספת TCO מילימולרי אחד, חומצת אמינו לא קנונית. ולגדל את החיידקים ב 34 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. מוסיפים 0.2% אראבינוז, 25 מיליגרם למיליליטר כלוראמפניקול ו-100 מיליגרם למיליליטר אמפיצילין, ומגדלים את התאים עוד שש שעות, תוך רעידות ב-250 סל"ד.

לאחר שש שעות, שטפו את החיידקים ארבע פעמים במרווח של 30 דקות עם מדיה טרייה של MgM ללא חומצות אמינו לא קנוניות או, ncAA. צנטריפוגו את החיידקים, השהו מחדש במאגר PBS, ודגרו במשך שעה אחת בארבע מעלות צלזיוס בחושך כדי להסיר עודפי ncAAs. לאחר שעה, צנטריפוגה את החיידקים ב 3, 000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס, ולאחסן אותם לשימוש נוסף.

עבור ניסוי בקרה, חזור על אותו ניסוי על ידי ביטוי חלבונים נושאי ncAA בהיעדר ncAA. השהיה מחדש של תאי סלמונלה המבטאים SseJ בשילוב עם TCO בהיעדר או נוכחות של TCO ב- PBS. התאימו את הצפיפות האופטית ב-600 ננומטר לארבעה ב-PBS, ודגרו על התאים עם 20 מיקרומולרי Janelia Fluor 646 tetrazene או 20 micromolar BDPFL tetrazine ב-37 מעלות צלזיוס בחושך, ונערו במשך שעה עד שעתיים ב-250 סל"ד.

יש לשטוף את התאים שלוש עד ארבע פעמים עם PBS המכיל 5% DMSO ו-0.2% F-127 פלורוני. יש להשעות מחדש את הגלולה ב-PBS המכילה 5% DMSO. לאחר הדגירה במשך הלילה בארבע מעלות צלזיוס בחושך, יש לשטוף שוב פעמיים עם PBS.

דמיינו את התאים מיד באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי, או קבעו אותם עם 1.5% פרפורמלדהיד ב-PBS למשך 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. תרבית ותחזוקת תאי HeLa בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-95% לחות ב-DMEM עתיר גלוקוז בתוספת 10% FBS בנוסף לפניצילין סטרפטומיצין. תרבית חיידקים יום לפני ההדבקה ותחסן מושבה אחת של סלמונלה פראית המכילה פלסמיד pEVOL המכיל זוג tRNA סינטטאז אורתוגונלי ופלסמיד pWSK29 המכיל גן SseJ בחמישה מילימטרים של אנטיביוטיקה המכילה מרק LB סטנדרטי למשך הלילה ב 37 מעלות צלזיוס עם טלטול ב 250 סל"ד.

לתקן מלאי תאים מדולל ב 100, 000 תאים למיליליטר זרע 50, 000 תאי HeLA לכל באר ב 500 מיקרוליטר של DMEM המכיל 10% FBS מדיום גידול בשקופית שמונה באר. שמור את התא מחליק באינקובטור למשך 24 שעות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-95% לחות. עבור זיהום חיידקי, תת-תרבית סלמונלה מסוג פרא המכילה פלסמיד pEVOL ופלסמיד pWSK29 המכיל גן SseJ על ידי דילול 100 מיקרוליטר של תרבית חיידקים בן לילה לשלושה מיליליטר של מדיום LB המכיל 35 מיקרוגרם למיליליטר כלוראמפניקול ו-100 מיקרוגרם למיליליטר אמפיצילין.

דוגרים ב-37 מעלות צלזיוס עם רעידות ב-250 סל"ד למשך חמש עד שבע שעות. כדי ליזום את זיהום תאי HeLa, לאחר הוצאת תאי HeLa מהאינקובטור, לשטוף את התאים עם DPBS שחומם מראש, ולהוסיף 500 מיקרוליטר של DMEM טרי המכיל 10% FBS לכל באר. הניחו את החלקת התא בחזרה באינקובטור הפחמן הדו-חמצני עד לתחילת הזיהום.

לאחר חמש עד שבע שעות של דגירה, לדלל את תרבית הסלמונלה כך שהצפיפות האופטית של 600 ננומטר היא 0.2 מיליליטר אחד של מדיום גידול DMEM, ולהוסיף את הכמויות הדרושות של חיסון הסלמונלה לכל באר של שקופית התא, כך שריבוי הזיהום הוא 100. לאחר הדגירה על התאים הנגועים באינקובטור פחמן דו חמצני במשך 30 דקות, שטפו את התאים שלוש פעמים עם DPBS שחומם מראש כדי להסיר סלמונלה חוץ-תאית. הגדר נקודת זמן זו לאפס שעות לאחר ההדבקה, והוסף 500 מיקרוליטר של מדיום שלם המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר של גנטמיצין למשך שעה אחת.

לאחר הדגירה, שוב, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם DPBS כפי שהוצג קודם לכן ולהוסיף 500 מיקרוליטר של המדיום המלא בתוספת 0.2% arabinose, 10 מיקרוגרם למיליליטר של gentamicin לכל באר של שקופית התא. בניסוי בקרה, לבצע זיהומים דומים של תאי HeLa ללא TCO. לאחר הדגירה על שקופית התא במשך 10 שעות באינקובטור הפחמן הדו-חמצני, יש להחליף את המדיום המלא בתווך שלם טרי ללא TCO, ולשטוף את תאי HeLa ארבע פעמים במרווח של 30 דקות כל אחד עם DPBS שחומם מראש.

לאחר מכן לשטוף את התאים עם מדיום שלם טרי ללא TCO. לאחר 12 שעות לאחר ההדבקה, לשאוף את התווך מן התאים ולשטוף את התא עם DPBS שחומם מראש פעמיים או שלוש פעמים. בקבוצה אחת של הבארות, להוסיף 500 מיקרוליטר של תערובת תמיסת צבע אחד, ובקבוצה אחרת של בארות של אותו שקופית החדר, להוסיף 500 מיקרוליטר של תערובת תמיסת צבע שניים.

הניחו את החלקת התא בחזרה לתוך אינקובטור הפחמן הדו-חמצני למשך שעה וחצי עד שעתיים. לאחר 13.5 עד 14 שעות לאחר ההדבקה, שטפו את תאי HeLa פעמיים עם DPBS שחומם מראש, והוסיפו 500 מיקרוליטר של DMEM טרי בתוספת FBS. לאחר הדגירה במשך 30 דקות, שטפו שוב את התאים עם DPBS שחומם מראש כפי שהוצג קודם לכן, ולאחר מכן שטפו עם DMEM טרי ארבע פעמים במרווח של 30 דקות.

ב 16 שעות לאחר ההדבקה, לתקן את תאי HeLa עם paraformaldehyde על ידי הוספת 200 מיקרוליטר של 4% paraformaldehyde לכל באר ולדגור במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר בחושך. לשאוף את paraformaldehyde. שטפו שלוש פעמים עם PBS, ואחסנו את התאים ב-PBS בארבע מעלות צלזיוס בחושך.

הביאו את התאים למיקרוסקופ, והניחו את תא ההדמיה על במת המיקרוסקופ במחזיק הדגימה. לאחר מכן שנה את המדיום בבאר עם 0.4 מיליליטר של חיץ הדמיה GLOX BME טרי. הפחת את עוצמת הלייזר לכמילי-וואט אחד כדי לזהות תא HeLa מעניין וכוונן את מישור המוקד ואת זווית קרן הלייזר תוך הארת הדגימה בצפיפות לייזר נמוכה של 647 ננומטר.

כוונן את זווית ההארה של HILO. צלם הפניה לתמונה מוגבלת חלקית של מבנה המטרה, והעבר את הפלואורופורים למצב כהה על ידי סיבוב הלייזר לעוצמתו המרבית. הגדר את רווח קדם-המגבר לשלוש והפעל את העברת המסגרת.

לאחר מכן הגדר רווח EM ל- 200 לרגישות גבוהה יותר במדידות dSTORM. כוונן את עוצמת הלייזר לרמה מתאימה שבה אירועי מצמוץ מופרדים במרחב ובזמן. הגדר את זמן החשיפה ל- 30 אלפיות השנייה והתחל ברכישה.

לרכוש 10, 000 עד 30, 000 מסגרות. חזור על רכישה דומה ב- ROI שונים. לשחזור התמונות של dSTORM, פתח את התמונה J וייבא את הנתונים הגולמיים.

פתח את תוסף סופת הרעמים והגדר את הגדרת המצלמה המתאימה להתקן. עבור אל הפעלת ניתוח והגדר את ההגדרות המתאימות, כגון סינון תמונות, שיטות לוקליזציה ולוקליזציה של תת-פיקסלים של מולקולות. לחץ על אישור כדי להתחיל בשחזור התמונה ולהתחיל בניתוח התוצאה הסופית שלאחר העיבוד.

סלמונלה המבטאת SseJ בשילוב TCO מטופלת עם Janelia Fluor 646 tetrazine ומצולמת עם Janelia Fluor 646 fluorescence בהיעדר או נוכחות של TCO. הפלואורסצנטיות של SseJ מזוהה רק כאשר TCO קיים. תאי HeLa נגועים בסלמונלה המכילה psseJ-HA למשך 16 שעות, קבועים ומוכתמים חיסונית בנוגדנים נגד HA, LPS ו- DAPI.

כצפוי, חוטים המושרים בסלמונלה תלויי SseJ, או SIFs, נוצרים בתאים הנגועים. בהיעדר TCO, קודון הענבר אינו מדוכא, ו- SIF תלוי SseJ נעדר בתאי HeLa נגועים. SIFs תלויי SseJ נצפים בנוכחות TCO, מה שמצביע בבירור על כך ש- SseJ ניצל על ידי ביטוי של SseJF10TCOHA באמצעות הרחבת קוד גנטי, או GCE.

ספציפיות התיוג של SseJF10TCOHA המופרש בתאי HeLa באמצעות תגובות לחיצה SPIEDAC באמצעות שתי תערובת צבע חלופית, אחת ותערובת צבע שתיים מוצגות כאן. צבע קליק Janelia Fluor 646 TZ שימש גם כדי לבחון אם יש תיוג רקע כלשהו בתאי HeLa נגועים בסלמנלה מסוג בר הנושא SseJ HA בנוכחות פלסמיד TCO ו- P vault. SseJ שוחרר לתוך הציטופלסמה של התא המארח ללא אותות פלואורסצנטיים תוך-תאיים או לא ספציפיים, מה שמוכיח כי האות הפלואורסצנטי היה ספציפי ל-SseJ.

הדמיה ברזולוציית על של GCE המסומנת SseJ בתאי HeLa מוצגת באיור זה. תמונת שדה בהיר של תא HeLa תחת תצפית מוצגת כאן. תמונת השדה הרחב מוגבלת העקיפה של SseJ המופרש המסומנת עם TCO ו- Janelia Fluor 646 ותמונת dSTORM המתאימה של SIF המעוטרים ב- SseJ מוצגים כאן.

ההוספה מציגה תצוגה מוגדלת של SseJ סופר פתור באזור התיבה. פתרונות מלאי NCAA הוכנו ב- NaOH. אל תשכחו לנטרל אותו לפני או אחרי התוספת לתקשורת.

לאחר תיוג חלבון מעניין, לשטוף את התא בהרחבה, כך אות הרקע הוא מינימלי. בעקבות הליך GCE שלנו, כעת, אנו יכולים לתייג כל גורם אלים בחיידקים ולעקוב אחר פעילותו באמצעות טכניקות ההדמיה שלנו.