מיקוד גנים יעיל ביותר בתיווך CRISPR/Cas9 בתאי גזע עובריים לפיתוח מודלים של עכברים שעברו מניפולציה גנטית

ייצור עכברים מהונדסים גנטית וניתוח הפנוטיפ שלהם מאפשרים לנו להבין פונקציות גנטיות ספציפיות בפירוט, in vivo. ממצאים חשובים רבים נחשפו באמצעות מודלים של בעלי חיים שעברו שינוי גנטי. השיטה שאנו מתארים כאן מאפשרת לדנ"א ארוך להשתיל תאי גזע ביעילות מקובלת ללא בחירת תרופות.

הטכניקה מועילה לא רק למדעי החיים הבסיסיים, אלא שהממצאים ייושמו גם במדעים יישומיים כמו מדע הרפואה ומדעי בעלי החיים. מי שידגימו את ההליך יהיו ד"ר צ'יהירו אמורי, פרופסור עוזר, וד"ר מנאבו אוזאווה, פרופסור חבר מהמעבדה שלי. לאחר הכנת הפיברובלסט העוברי של העכבר, מכינים את צלחת תרבית התאים המצופה בג'לטין כמתואר בכתב היד ודוגרים אותה במשך שעתיים באינקובטור לח.

הסר את תמיסת הג'לטין, לשטוף את המנה פעמיים עם PBS, ולאחסן אותו בטמפרטורת החדר עד לשימוש. הפשרת מלאי MEF קפוא ללא פעילות מיטוטית באמצעות אמבט מים ממוזג בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך דקה אחת. יום אחד לפני זריעת ESC, הניחו את ה-MEF על צלחת מצופה ג'לטין בקוטר 60 מילימטרים.

הפשירו שפופרת מלאי ESC קפואה כפי שהוצג קודם לכן והניחו פעם אחת 10 לתאי ה-ESC החמישים על צלחת בקוטר 60 מילימטרים המכילה MEF שנזרע מראש. לאחר מכן, הוסיפו ארבעה מיליליטרים של תרבית ESC מדיום ודגרה על המנה עד שה-ESC מגיע ל-50 עד 70% מפגש. לאחר שטיפת ESC מתורבת עם ארבעה מיליליטר של PBS, לעכל אותם עם 800 microliters של 0.25% טריפסין EDTA פתרון במשך חמש דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

לאחר שהטריפסין מושתק עם מיליליטר אחד של ESCM, מוסיפים מיליליטר אחד של ESCM טרי לתאים, מעבירים את המדיום לצינור, ופולטים את התאים על ידי צנטריפוגה ב-280 גרם למשך חמש דקות. לאחר החייאת התאים במיליליטר אחד של ESCM טרי, ספרו את ריכוז התאים באמצעות מונה תאים עם כתם כחול טריפאן. לאחר העברת פעם אחת 10 לתאי הגזע העובריים החמישי לצינור חדש של 1.5 מיליליטר ושטיפתם שלוש פעמים עם PBS על ידי צנטריפוגה, יש להשעות את גלולת ה-ESC ב-12 מיקרוליטרים של תערובת דנ"א Cas9 RNP ולערבב היטב על ידי פיפטינג עדין כדי למנוע מבעבע.

לאחר מכן, לשרת את ESC מושעה עבור אלקטרופורציה. לאחר מכן, תרבו את תאי הגזע העובריים האלקטרופולטיביים בצלחת של 60 מילימטר המכילה ארבעה מיליליטרים של ECSM עם MEF שאינו פעיל מיטוטית והמשיכו לשנות את המדיום מדי יום. שלושה עד חמישה ימים לאחר האלקטרופורציה, לשטוף את תאי גזע עובריים עם ארבעה מיליליטר של PBS ואז לעכל אותם עם 800 מיקרוליטר של 0.25% טריפסין EDTA ותרבית באינקובטור לח.

לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של ESCM כדי להפסיק את עיכול טריפסין. לאחר שתערובת התאים מתרוקנת, יש לתלות את הכדור במיליליטר אחד של ESCM טרי ולספור את ריכוז התאים באמצעות מונה תאים עם כתם כחול טריפאן. מעבירים את תאי הגזע העובריים באופן חד פעמי 10 לתאים השלישיים לכל צלחת של 60 מילימטר המכילה ESCM ו-MEF מזין.

הקפידו להחליף את המדיום עד שהמושבה תתרומם. חמישה עד שבעה ימים לאחר המעבר הראשון, ברגע שה-ESCM שואף מצלחת התרבית של ESC, הוסיפו ארבעה מיליליטר של PBS. באמצעות פיפטה של 20 מיקרוליטר, לאסוף מושבות ESC בודדות עם חמישה מיקרוליטרים של PBS תחת סטריאומיקרוסקופ.

מניחים את המושבות הבודדות בבאר של צלחת 96 באר בעלת תחתית עגולה המכילה 15 מיקרוליטרים של תמיסת EDTA של 0.25% טריפסין. לאחר דגירה של צלחת 96 באר, להפסיק את העיכול טריפסין על ידי הוספת 80 microliters של ESCM וניתוק מושבות ESC לתוך תאים בודדים על ידי פיפט. עבור גנוטיפ PCR, העבר 40 מיקרוליטרים של תרחיף ESC לצלחת מצופה ג'לטין, ללא מזין, 96 באר המכילה 50 מיקרוליטר של ESCM לכל באר.

כדי להפוך את מלאי ה-ESC הקפוא, העבירו את 60 המיקרוליטרים הנותרים של מתלי ESC לבאר של צלחת 24 בארות מצופה ג'לטין המכילה 500 מיקרוליטרים של ESCM ו-MEF מזין. שיבוטים בודדים של ESC שגודלו בתרבית בצלחת של 24 בארות עד שהם מגיעים למפגש של 60% עד 80% ומשחזרים שיבוטים בודדים של ESC על ידי טריפסיניזציה, כפי שהוכח קודם לכן. לאחר קבלת כדור התא על ידי צנטריפוגה, להשעות את 500 microliters של מדיום הקפאת תאים כדי להקפיא את התאים במינוס 80 מעלות צלזיוס.

עבור גנוטיפ PCR, תרבית ESC משתבטת כפי שהוכח קודם לכן ומסירה ESCM מכל באר על ידי שאיפה לפני שטיפתה עם 100 מיקרוליטרים של PBS פעמיים. לאחר שאיפת ה-PBS, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של חיץ ליזיס המכיל פרוטאינאז K וערבבו היטב. כעת מעבירים את ה-ESC לצינור חדש של 1.5 מיליליטר ושומרים אותו בתא חום בטמפרטורה של 65 מעלות צלזיוס למשך שעה לפחות.

לאחר שהדנ"א הגנומי מומס ב-20 מיקרוליטרים של מים נטולי DNase, קבע את הטוהר והריכוז של הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר. לאחר ביצוע PCR גנומי באמצעות ערכות פריימרים ספציפיות ללוקוס כדי להגביר את אזור המטרה, בדוק את הרצף ובחר את שיבוטי ESC עם רצפי הדפיקה הרצויים. לאחר הזדווגות הנקבות שטופלו בהורמון עם זכרי ה- ICR ואיסוף האובידוקט, הנח את האובידוקט שנאסף בטיפות FHM ושחזר את העוברים בעלי שני התאים או ארבעת התאים על ידי שטיפת האובידוקט עם FHM באמצעות מחט שטיפה המוחדרת לאינפונדיבולום.

שטפו את העוברים שנאספו על ידי העברתם למספר טיפות FHM טריות באמצעות פיפטה לפה. תרבית את העוברים ב-50 מיקרוליטרים של טיפות KSOM על צלחת תרבית תאים בקוטר 35 מילימטר מכוסה בשמן מינרלי כפי שהוכח קודם לכן במשך יום אחד עד להגעה לשלב שמונת התאים או המורולה. הכינו פיפטות זכוכית להחזקת העוברים והזרקת ESC באמצעות משיכה ומיקרופורג'.

לאחר שילוב פיפטה החזקה המכילה FHM לתוך מחזיק נימי המחובר למיקרו-אינז'קטור, הניחו אותו בצד שמאל של המיקרומניפולטור. חבר פיפטה הזרקה למיקרו-אינז'קטור אחר והגדר אותו בצד ימין. יישרו את שתי הפיפטות ישר בשדה התצוגה של המיקרוסקופ.

הכינו טיפות של חמישה מיקרוליטרים של 12% פוליוויניל פירולידון וטיפות של חמישה מיקרוליטרים של FHM על אותו מכסה של צלחת של 60 מילימטר, זו לצד זו. מכסים את הטיפות בשמן מינרלי. העבירו את העוברים בחמישה מיקרוליטרים של טיפת FHM והוסיפו אחד עד חמישה מיקרוליטרים של מתלה ESC לטיפת ה-FHM המכילה את העובר.

לאחר שטיפת פיפטה ההזרקה בפוליוויניל פירולידון, העבירו את פיפטה ההזרקה לטיפה המכילה את העוברים והמחלות העובריות. בחר שלושה כפילי ESC בודדים שזה עתה סיימו את חלוקת התאים שלהם בפיפטת ההזרקה. באמצעות פיפטה החזקה, להחזיק עובר בן שמונה תאים או שלב מורולה אשר השלים דחיסה על ידי שאיפה ולעשות חור ב zona pellucida עם פולס piezoelectric.

לגרש את ה-ESC בעל ששת התאים בתוך הזונה פלוצ'ידה ולשלוף את הפיפטה מתוך העוברים. שטפו את העוברים המוזרקים על ידי ESC עם מספר טיפות KSOM בעדינות באמצעות פיפטה בפה ודגרו אותם בטיפת KSOM חדשה של 50 מיקרוליטר מכוסה בשמן מינרלי, כפי שהוכח קודם לכן, עד שהעוברים התפתחו לשלב הבלסטוציסט. מתקבל אמפליקון PCR בגודל ספציפי ליעד הדפיקה ו-9 מתוך 22 שיבוטים הראו פס ספציפי לדפיקה.

תוצאות אלה יעילות וניתנות לשחזור עבור דפיקות גנים ללא כל בחירות של תרופות. איסוף הגודל האופטימלי של מושבות ESC הוא די חשוב עבור הליך זה. הימנעו מבחירת מושבות גדולות מדי או קטנות מדי.

עריכת גנום ישירה בתיווך CRISPR Cas9 באמצעות זיגוטה תהיה ישימה ליצירת עכברי נוקאאוט גנים פשוטים. פרוטוקול מיקוד גנים ESC זה בתיווך CRISPR Cas9 מאפשר ייצור של עכברים מהונדסים גנטית שונים לניתוח עתידי במדעי החיים.