בידוד וקטורי ריפוי גנטי מהדור הבא באמצעות הנדסה, ברקוד וסינון של גרסאות קפסיד הקשורות לנגיף אדנו (AAV)
18 באוקטובר 2022
יצירת ספריית תצוגה פפטידית AAV ותיקוף לאחר מכן באמצעות ברקוד של מועמדים עם תכונות חדשות ליצירת AAV מהדור הבא.
פרוטוקול זה סוגר פער משמעותי בין האבולוציה הטבעית של נגיפים לבין השימוש בהם כווקטורים רקומביננטיים לטיפול גנטי אנושי בכך שהוא מאפשר את הנדסאתם, גיוון וריבודם. טכניקה זו מאפשרת סינון מקבילי בתפוקה גבוהה עבור וירוסים חדשניים, מבודדים או מהונדסים הקשורים לאדנו, בקיצור AAV, וריאנטים, ובכך חוסכת במספר בעלי חיים, עבודה, עלות וזמן. גרסאות הקפסיד AVV שזוהו יכולות להגביר את היעילות והספציפיות של העברה מבוססת AAV של טרנסגנים טיפוליים, ובכך להפחית את המינון הנגיפי הנדרש.
זה יכול לשפר את הבטיחות ואת הישימות של ריפוי גנטי. אותה גישה יכולה לשמש גם להנדסה קפסידית או מקדמת של כלי העברת גנים אחרים, מה שמשפר את הבנתנו את הביולוגיה שלהם ואת השימוש בהם בריפוי גנטי. מי שיסייעו להדגים את ההליך יהיו הדוקטורנטים ג'ונאס בקר וג'ישין ליו, הפוסט-דוקטורנטיות ג'ואנה שומסקה ומרגריטה זיאס, כמו גם עוזרות המחקר אמה גרסטמן ואלן וידטקה מהמעבדה שלי.
התחל בניתוח נתוני ריצוף NGS עם Python 3 ו- Biopython. ניתוח NGS מורכב משני שלבים. בשלב הראשון, חפש בקובצי הרצפים רצפים העונים על קריטריונים ספציפיים, כגון איגוף רצפים, אורך ומיקום באמצעות סקריפט אחד, וקובץ תצורה המספק את המידע הדרוש.
עבור השלב השני, תרגם את הרצפים שחולצו החל מרצף AGWGGC באמצעות סקריפט מספר שתיים והתצורה ו- zuordnung. קובצי TXT המספקים את המידע הדרוש. הכן שתי תיקיות:סקריפט ונתונים.
העתק את הקבצים הדחוסים של Gzip הנובעים מהרצף לתיקיית הנתונים. לאחר מכן העתק את Python ואת קבצי התצורה לתיקיית הסקריפט כמתואר בכתב היד של הטקסט. לפני הפעלת הסקריפטים, פתח את zuordnung.
קובץ TXT והוספת שתי עמודות המופרדות באמצעות טאבים. הזן את שמות קובצי Gzip בעמודה הראשונה ואת השם הסופי הרצוי בעמודה השנייה. שנה את המשתנים בקובץ התצורה כמתואר בכתב היד של הטקסט.
באמצעות הפקודה הספציפית, התחל את זיהוי רצף הווריאנטים וחילוץ. הפלט יהיה קבצי TXT עם רצפי הדנ"א שחולצו ומספר הקריאות שלהם. כותרת הקובץ מכילה נתונים סטטיסטיים ונתונים אלה יועברו לקבצים הבאים.
נתוני TXT אלה יהיו קובץ הקלט עבור סקריפט מספר שתיים שבו רצפי הדנ"א מתורגמים, מדורגים ומנותחים. באמצעות הפקודה הספציפית, התחל תרגום PV וניתוח של קבצי פלט הטקסט של סקריפט אחד כמתואר בכתב היד של הטקסט. קבצי הפלט של סקריפט מספר שתיים ייקראו באמצעות העמודה השנייה של טבלת בדיקת המידע ב- zuordnung.
TXT עם הרחבות המבוססות על סוג הניתוח. ודא ששלושת קובצי הפלט כוללים נתונים סטטיסטיים בשורות הראשונות ועמודה ראשונה עם האינדקס של כל רצף DNA מקובצי הטקסט שהוקלטו. שאר העמודות צריכות לכלול את רצף הדנ"א, מספר הקריאות, קריאה קדימה או אחורה ורצף פפטידי מתורגם.
הרצפים הלא חוקיים צריכים לכלול NA ולא חוקיים בשתי העמודות האחרונות. הצג באופן חזותי את קבצי הפלט באמצעות תוכנה זמינה המבוססת על צרכי המשתמש. כדי לבצע את ניתוח נתוני רצף ה- NGS באמצעות קוד מותאם אישית בפייתון 3, זרימת העבודה כוללת זיהוי רצפי ברקוד מונחה על ידי רצפי איגוף, אורכם ומיקומם, כמו גם ניתוח העשרת ברקוד ופיזור על פני קבוצת הרקמות.
הכן שתי תיקיות:סקריפט ונתונים. העתק את הקבצים הדחוסים של Gzip הנובעים מהרצף לתיקיית הנתונים. לאחר מכן העתק את קבצי הפיתון והתצורה לתיקיית הסקריפט כמתואר בכתב היד של הטקסט.
לפני הפעלת הסקריפט, צור שני קובצי טקסט מופרדים בטאבים:capsidvariance. קובץ txt עם רצפי הברקוד שהוקצו לשמות וריאנטים של AAV capsid, והזיהום. קובץ TXT עם רצפי ברקוד שמקורם בזיהום אפשרי.
לבסוף, ערוך את קובץ התצורה כך שיכלול את פרטי הנתיב לתיקייה עם נתוני רצף, רצף אזורי איגוף של הברקודים, מיקומם וגודל החלון לזיהוי ברקוד. הפעל את סקריפט זיהוי הברקוד עם הנתיבים וקבצי התצורה שסופקו באמצעות הפקודה המתאימה. הפלט של ביצוע פקודה זו יהיה קבצי TXT עם ספירות חוזרות לכל וריאנט capsid ואת המספר הכולל של קריאות ששוחזרו מהנתונים הגולמיים.
כדי להעריך את ההתפלגות של קפסיד AAV ברקודי בין רקמות או איברים, ב zuordnung. קובץ TXT, הקצה את השם של כל קובץ טקסט המתקבל מהפעלת זיהוי הברקוד לשם רקמה או איבר. הוסף את שמות קובצי הטקסט בעמודה הראשונה ואת שמות הרקמות או האיברים המתאימים במשימה המופרדת באמצעות טאבים.
צור איבר. קובץ TXT עם רשימת השמות עבור איברים מופעלים ומחוצה לו, המתאימים לשמות שניתנו בהקצאה Zuordnung. קובץ txt.
לאחר מכן צרו normalization_organ. TXT ו- normalization_variant. קובצי טקסט מופרדים באמצעות כרטיסיות TXT עם ערכים מנורמלים עבור כל גרסאות Capsid וכל האיברים והרקמות.
בעמודה הראשונה עם normalization_organ. קובץ txt, כתוב את השמות שניתנו עבור כל איבר, ואת העמודה השנייה עם ערכי נורמליזציה עבור הרקמה המתאימה. מלא את העמודה הראשונה של normalization_variant.
קובץ TXT עם רשימת שמות Capsid, והעמודה השניה עם הערכים המנורמלים של ספירות הקריאה עבור כל Capsid בספריה המאוגמת. ערוך את קובץ התצורה על-ידי ציון הנתיבים המלאים לכל הקבצים הנוספים והפעל את סקריפט ניתוח הברקוד באמצעות פקודה ספציפית זו. סקריפט ניתוח הברקוד מפיק מספר קבצים, כגון קובצי טקסט עם ריכוז יחסי או ערכי RC של התפלגות קפסיד ברקמות שונות, בהתבסס על שלבי נורמליזציה מרובים שתוארו קודם לכן, וקובץ הגיליון האלקטרוני המשלב נתוני קובץ טקסט לנתוני מטריצה ממוזגים.
הצג את הנתונים באופן חזותי ובצע ניתוח אשכולות של נתוני המטריצה כמתואר בכתב היד של הטקסט. התסריט יזין את הריכוז היחסי. XLS קבצים וליצור שתי חלקות של מפת חום אשכול היררכית וניתוח רכיבים עיקריים.
כדי לשנות תרשימים או פרמטרים של PNG, פתח את הסקריפט R ופעל לפי ההוראות בסעיף ההערות. האזורים המכומתים של הגן AAV2 rep הראו כי 99.2% היו חיוביים עבור ITR, דבר המצביע על כך שהקפסידים של AAV הכילו את כל הגנום הנגיפי. בכל שלוש הקבוצות, הקריאות שחולצו בהתבסס על רצפי חתימות ספציפיים לספרייה ייצגו כ-94% מכלל הקריאות, מה שמצביע על איכות טובה.
מתוכם, יותר מ-99% היו קריאות PV תקפות ויותר מ-99% מהקריאות הפוטו-וולטאיות התקפות היו ייחודיות, מה שמרמז על כך שהספרייה הייתה מאוזנת עם מגוון פנימי גבוה. שני הענפים העיקריים בהיררכיית מפת החום שיקפו את ההבדל ביעילות ההולכה של גרסאות קפסיד. הענף השמאלי עם רוב גרסאות הקפסיד כלל את כל הקפסידים שהראו ערך ריכוז יחסי גבוה ברוב הרקמות.
מלבד סגוליות גבוהה להפליא של הכבד, שלושה קפסידים אחרים הפגינו ספציפיות בסרעפת, בשרירי השלד, בשרירי הזרוע ובמוח. הענף הימני של האשכולות ההיררכיים כלל את גרסאות הקפסיד עם יעילות התמרה נמוכה יותר, הניכרת ביותר בתריסריון ובלבלב. ניתוח המרכיבים העיקרי עבור תת-הקבוצה המקורית יוצר את אשכול גרסאות הקפסיד עם ספציפיות גבוהה של הכבד ומתאר את טרופיזם השרירים המצטיין של VAR60.
בעת ניסיון פרוטוקול זה, עליך לשים לב לשגיאות הקלדה. התחביר שונה גם אם אתה משתמש בשורת הפקודה של Windows בהשוואה ל- Linux. לאחר זיהוי וריאנטים חדשים של AAV, יש לאמת את הפוטנציאל הטיפולי והתרגומי במודל של בעלי חיים שנפטרו או גדולים יותר.
טכניקה זו מאפשרת השוואה ישירה זה לצד זה של גרסאות AAV בתנאים זהים והיא ורסטילית ביותר, וסוללת את הדרך לתרגומה בבעלי חיים גדולים, או אפילו בבני אדם.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתייחס להנדסה וגיוון של וירוסים קשורים לאדנו (AAVs) עבור יישומי טיפול גנטי. הוא מאפשר סינון תפוקה גבוהה של וריאנטים של AAV כדי לשפר את יעילותם וספציפיותם בהעברת טרנסגנים טיפוליים.
רכיבי מחקר עיקריים
תחום המדע
- טיפול גנטי
- הנדסת וקטורים ויראליים
- וירוסים קשורים לאדנו
רקע
- AAVs משמשים בדרך כלל כווקטורים רקומביננטיים לטיפול גנטי.
- הנדסת AAVs יכולה לשפר את יכולות ההעברה שלהם.
- סינון תפוקה גבוהה יכול להפחית את צריכת המשאבים במחקר.
- הבנת הביולוגיה של AAV היא חיונית ליישומי טיפול.
מטרת המחקר
- ליצור ספריית תצוגת פפטידים עבור AAVs.
- לאמת מועמדי AAV עם מאפיינים חדשים.
- להעצים את הספציפיות והיעילות של העברה גנטית מבוססת AAV.
שיטות ששימשו
- ייצור ספריות תצוגת פפטידים של AAV.
- ברקוד של מועמדי AAV לזיהוי.
- טכניקות סינון תפוקה גבוהה.
- שיתוף פעולה עם סטודנטים לתואר שלישי ועוזרי מחקר.
תוצאות עיקריות
- זיהוי וריאנטים חדשים של קפסיד AAV.
- הוכחת יעילות העברה משופרת.
- הפחתה במינונים ויראליים הנדרשים לטיפול.
- יישומים פוטנציאליים לכלי העברה גנטית אחרים.
מסקנות
- הפרוטוקול מגשר על פערים בהנדסת AAV לטיפול גנטי.
- הוא מציע מסגרת להעצמת ספציפיות וקטור ויראלית.
- יישומים עתידיים עשויים להתרחב למערכות העברה גנטית אחרות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
High-throughput engineering, barcoding, and screening of AAV capsid variants enable rapid identification of gene therapy vectors with optimized tissue specificity and transduction efficiency. This approach streamlines early vector discovery, reduces animal usage, and accelerates the translation of next-generation gene delivery systems. The methodology supports portfolio-wide de-risking and prioritization of candidates for preclinical advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables systematic interrogation of AAV capsid diversity for functional target validation.
- Supports biological de-risking by clarifying tissue tropism and transduction profiles.
- Facilitates predictive confidence in vector selection for downstream development.
Screening & Assay Development
- Prepares barcoded AAV libraries for robust, parallel in vivo screening across multiple tissues.
- Standardizes quantitative readouts via NGS-based barcode analysis for reproducibility.
- Enables scalable, side-by-side evaluation of capsid variants under identical conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns vector selection with disease-relevant tissue targeting and translational biomarker needs.
- Ensures continuity from discovery through preclinical validation by enabling direct comparison in relevant models.
- Supports risk-adjusted advancement decisions based on quantitative tissue distribution data.
Pipeline & Workflow Integration
This methodology integrates from early discovery through lead identification and preclinical vector validation, providing a reusable platform for gene therapy vector optimization.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of capsid function and tissue targeting via high-throughput screening.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative barcode-based outputs for robust variant comparison.
- Analytics: Provides statistical analysis of variant distribution, enrichment, and tissue specificity using NGS data.
- Translational Research: Enables alignment of vector properties with preclinical and disease-relevant endpoints.
- Enterprise Reuse: Offers a modular workflow adaptable to new capsid libraries and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in vector selection.
- Operational Value: Standardizes and scales vector screening, reducing resource and animal use.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital efficiency by focusing on high-performing candidates.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement of gene therapy vectors.
Implementation Considerations
- Requires expertise in molecular cloning, NGS library preparation, and bioinformatics analysis.
- Depends on access to sequencing infrastructure and computational resources for data processing.
- Demands rigorous cross-team standardization of barcode assignment and normalization protocols.
- Adaptable to various AAV libraries and tissue models with appropriate configuration.
- Attention to data integrity, file management, and error minimization is critical for reproducibility.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Introduction
1:16
Analysis of the AAV Viral Library (In Vitro) by NGS
3:42
Analysis of AAV Viral Library (In Vivo) by NGS
7:08
Results: Peptide Display AAV Capsid Engineering and Barcoded AAV Library Screening for Isolation of Next-Generation Gene Therapy Vectors
8:36
Conclusion
