מעקב אחר סחר בתאי T הנגרמים על ידי נוגדנים דו-ספציפיים באמצעות תאי T אנושיים מותמרים של לוציפראז

שיטה זו מאפשרת למשתמשים לעקוב בקלות אחר תאי T in vivo כדי להעריך את הקינטיקה של הביות ולנטר את ההתמדה של תאי T. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לחזור עליה במספר נקודות זמן על אותו בעל חיים מבלי לדרוש הקרבה בציטומטריית זרימה או אימונוהיסטוכימיה. טכניקה זו יכולה להיות שונה עבור מעקב אחר סוגים אחרים של תאים חיסוניים גם כן.

לתרבית תאי 293T, הכינו ליטר אחד של DMEM על ידי הוספת 110 מיליליטר של נסיוב בקר עוברי מומת בחום ו-11 מיליליטר של פניצילין סטרפטומיצין. הפשירו חמש פעמים 10 עד 293T השישי והעבירו אותם לבקבוק T175 המכיל DMEM. פצל את התאים אחד עד 10 כל שלושה ימים במשך שישה ימים לפני שהתאים הופכים ליותר מ- 90% נפגשים.

עבור transfection, להעביר 1.5 מיליליטר של מדיה לשני צינורות 50 מיליליטר באמצעות פיפטה. לצינור אחד, להוסיף 10 מיקרוגרם של פלסמיד VSVG, 20 מיקרוגרם של gag pol, ו 20 מיקרוגרם של חיפושית קליק אדום TDtomato או CBRTDR luciferase פלסמיד ולערבב. הוסף 100 מיקרוליטר של DNA מגיב transfection במבחנה לצינור אחר ולערבב.

דוגרים על שני הצינורות בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות. מעבירים את המדיה המכילה את מגיב הטרנספקציה של הדנ"א במבחנה טיפתית לצינור המכיל את פלסמידים של הדנ"א ומערבבים בעדינות עם פיפטה. יש לדגור בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

במהלך הדגירה, נתקו את תאי 293T על ידי הוספת חמישה עד 10 מיליליטר של 0.05% טריפסין. לאחר ניתוק התאים, הוסיפו 10 מיליליטר מדיה וצנטריפוגה ב-800 גרם למשך חמש דקות. להשעות את התאים ב 1.5 מיליליטר של מדיה.

הוסף את המדיה המכילה את מגיב הטרנספקציה של ה- DNA במבחנה ואת פלסמידים ה- DNA לתאי 293T ודגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר הדגירה, להעביר את המתלה לצלוחית T175. מוסיפים 18 מיליליטר של מדיה ודגרים על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, בזהירות לשאוף את התקשורת עם פיפטה זכוכית מבלי לנתק את התאים ולהחליף אותו עם 18 מיליליטר של מדיה טרייה. שוב, לדגור לילה ב 37 מעלות צלזיוס. למחרת, הסר את הסופרנאטנט הנגיפי באמצעות פיפטה שהונחה על קרח וצנטריפוגה ב 800 גרם למשך חמש דקות כדי לזרוק את התאים והפסולת.

סננו את הסופרנאטנט הנגיפי באמצעות מסנן 0.22 מיקרון והניחו אותו מיד על קרח. עבור הפעלה חוץ גופית של תאי T אנושיים, הוסף 10 מיליליטר של PBS המכיל 0.1% אלבומין בסרום בקר או BSA ושני מילימולרים EDTA לצינור סטרילי של 15 מיליליטר. לאחר מכן כדי לשטוף את החרוזים, להוסיף חרוזים לתוך צינור ומניחים את הצינור במדף מגנטי.

לאחר שתי דקות, הסר את PBS מהצינור. לאחר הכנת DMEM, להוסיף חרוזים שטופים אינטרלוקין-2 או IL-2 לריכוז סופי של 30 יחידות בינלאומיות למיליליטר. ספרו את תאי ה-T באמצעות ציטומטר המו וכתם כחול טריפאן.

לאחר הספירה, הוסף את המספר הרצוי של תאי T למדיה והפוך בעדינות את הצינור כדי לערבב. צלחת 2.5 מיליליטר של מדיה המכילה שני מיליון תאי T, חרוזים ו- IL-2 בכל באר של צלחת תרבית רקמה בת 24 בארות. תרבית ב 37 מעלות צלזיוס ב 5% פחמן דו חמצני לח.

בדוק את תאי T תחת מטרה 20X כל יום במשך שלושה ימים כדי לקבוע מתי להתמיר עם luciferase. לאחר מכן, כדי להכין צלחת RetroNectin, להוסיף שני מיליליטר של 20 מיקרוגרם למיליליטר RetroNectin ב PBS לבאר של צלחת שש בארות לא מטופל לדגור במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. שאפו את ה-RetroNectin מבלי לגרד את תחתית הצלחת והוסיפו שלושה מיליליטר של 2% BSA ב-PBS לכל באר בצלחת בעלת שש הקידוחים.

דוגרים במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר מכן, עבור spinoculation, לשאוף את BSA ולשטוף את הבארות פעם אחת עם שלושה מיליליטר של PBS. המשיכו או החליפו ב-PBS טרי והשאירו את הצלחת מכוסה בארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.

למחרת, להוסיף שני מיליליטר של CBRTDR luciferase supernatant נגיפי לכל באר צנטריפוגה ב 1, 240 G במשך 90 דקות ב 32 מעלות צלזיוס. לצורך התמרה, לאחר ספירת תאי T, שואפים את הסופרנאטנט הנגיפי ולוחצים שני מיליון תאי T לבאר בשישה מיליליטר DMEM המכילים 30 יחידות בינלאומיות למיליליטר של IL-2 אנושי. בדוק את תאי T במשך יומיים.

כאשר התאים כמעט נפגשים, שטפו אותם בעדינות מתחתית הצלחת באמצעות פיפטה והעבירו כל באר לצלוחית T75 נפרדת. הוסף תשעה מיליליטר מדיה לקבלת נפח כולל של 15 מיליליטר לכל בקבוק. למחרת, להוסיף 15 מיליליטר של מדיה ולאשר התמרה מוצלחת על ידי ביצוע ציטומטריית זרימה.

לאחר הרדמת העכבר, באמצעות מחט 26 מד, להזריק 20 מיליון תאי T ב 100 מיקרוליטר של מדיה רטרואורביטלית. לנהל 1, 000 יחידות של רקומביננטי IL-2 תת עורית כדי לתמוך בהישרדות תאי T in vivo. לאחר מכן לנהל את הנוגדן bispecific רטרוorbitally או intraperitoneally.

עבור הדמיה in vivo, לנהל 100 מיקרוליטר של שלושה מיליגרם של D-luciferin על ידי הזרקה retroorbital עם מחט 26 מד בעכבר מורדם. כדי ללכוד תמונות, מקם את העכבר בתא ההדוק של מכונת הצילום, כך שהאגף הנושא את הקסנוגרפט פונה כלפי מעלה לכיוון המצלמה. באמצעות לוח הבקרה של הרכישה, בחר זוהר, צילום ושכבת-על.

הגדר את זמן החשיפה לאוטומטי, את הקישור לבינוני ואת f-stop לאחד וקבל תמונות. לאחר התמונה הראשונה, הגדירו את זמן החשיפה כך שיתאים לזה שחושב אוטומטית לתמונה הראשונה, כך שניתן יהיה להשוות ישירות בין התמונות הבאות. צלם קבוצה נוספת של תמונות עם העכבר שכיבה כדי להעריך נוכחות תאי T בריאות.

תאי T חמושים נסחרו לגידול מהר יותר מתאי T לא חמושים, ועזבו את הריאות יומיים מוקדם יותר. כימות חדירת תאי T לגידולים לאורך זמן נמדדה על ידי ביולומינסנציה והתבטאה כסך להקות או זוהר לפיקסל המשולב על פני מתאר הגידול. סחר בתאי T יכול להיות מנוטר במשך 28 ימים לאחר הזרקת תאי T מותמרים לוציפראז, המאפשר מעקב אחר ביות תאי T והתמדה לאורך כל הטיפול.

מוצג סחר בתאי T לקסנוגרפטים שמקורם בסרטן שד אנושי חיובי ל-HER2 בעכברי DKO. לטיפול בנוגדן דו-ספציפי HER2 עם FC לא מושתק לא הייתה השפעה על צמיחת הגידול בהשוואה לנוגדן דו-ספציפי מבוקר. לעומת זאת, טיפול בנוגדן דו-ספציפי HER2 המכיל מוטציה N297A לבדו או בשילוב עם מוטציית K322A הצליח לעצור לחלוטין את צמיחת הגידול.

עבור קבוצות עם מוטציות ההשתקה, אות ההארה של תאי T הגיע לשיא גבוה יותר ביום השלישי שלאחר ההזרקה ונשאר ברמה גבוהה יותר בהשוואה לנוגדן דו-ספציפי מבוקר ונוגדן דו-ספציפי HER2 שלא הושתק. עכברים שנשאו קסנוגרפטים שמקורם בחולה נוירובלסטומה הדגימו דלדול של מקרופאגים חיוביים ל-Ly6C שהגדילו באופן משמעותי את ביות תאי T לגידולים, וכתוצאה מכך ירידה בצמיחת הגידול והישרדות ממושכת. ההשפעה הייתה בולטת יותר בקסנוגרפטים שמקורם באוסטאוסרקומה.

בקרב נוגדנים דו-ספציפיים המכוונים לאנטיגן הגידול STEAP1, פורמט IGGL SCFV הביא להחדרה משמעותית יותר של תאי T ביום השישי לאחר המנה הראשונה של תאי T שנמשכה למשך הטיפול. תצפיות כאלה לא נחזו על ידי מבחני ציטוטוקסיות חוץ גופית. לאחר מעקב אחר תאי T in vivo, משתמשים עדיין יכולים לבצע אימונוהיסטוכימיה כדי לקבוע באופן ספציפי יותר היכן תאי T ממוקמים בתוך הגידול או רקמות נורמליות אחרות.