מיקרוקוסמוסים של קומפוסט כסביבות טבעיות מגוונות מיקרוביאלית לחקר המיקרוביום ב-Caenorhabditis elegans

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגדל תולעים ומיקרוקוסמוסים של קומפוסט, מה שמאפשר לחקור במעבדה אינטראקציות בין פונדקאי למיקרוביום בהקשר דמוי טבע. שיטה זו מציעה אלטרנטיבה לבידוד תולעי בר מהטבע או שימוש בקהילות מיקרוביאליות סינתטיות בעלות מגוון מיקרוביאלי מוגבל. פרוטוקול זה הוא פשוט וניתן לביצוע בכל מעבדה והוא אפילו מתאים למתחילים.

כדי להתחיל, להשיג קומפוסט או אדמת גינה מכל מקור נוח ולאחסן אותו בתוך המעבדה במיכל פלסטיק סטנדרטי במטבח עם חורים לחתוך במכסה עבור אוורור. סתמו את החורים בצמר גפן כדי להרחיק זבובי פירות וחסרי חוליות אחרים. להעשיר את הקומפוסט או הקרקע עם תוצרת קצוצה או תערובת של תוצרת שונה בקרקע כדי לייצר יחס של שניים לאחד על ידי מסה.

מערבבים את הקומפוסט פעם ביום ומוסיפים מדיום M9 לפי הצורך כדי לשמור על הלחות מבלי להפוך אותה לבוצית. עבור כל מיקרוקוסמוס, הוסיפו 10 גרם קומפוסט מועשר לכוס זכוכית של 30 מיליליטר מכוסה בפח. מוסיפים 30 גרם קומפוסט מועשר לכל צינור 50 מיליליטר.

ממלאים את הצינור ב-M9 ובמערבולת. צנטריפוגה את הצינורות ב 560 G במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. באמצעות פיפטה סרולוגית, להסיר את supernatants מבלי להפריע את הכדור ולשלב אותם בצינור חדש 50 מיליליטר.

רכז את תמצית החיידקים על ידי צנטריפוגה של הצינור במהירות מקסימלית למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. החזירו את הכדורים למספיק M9 כדי שיהיו 200 מיקרוליטרים לכל מיקרוקוסמוס ו-200 מיקרוליטרים לצלחת שתשמש פרוקסי גלוי למיקרוקוסמוס. הוסיפו 200 מיקרוליטרים של תמצית מיקרוביאלית מרוכזת לכוס הקומפוסט האוטומטית וללוחית ה-NGM הנראית לעין.

הוסף 500 עד 1000 זחלי L1 לכל מיקרוקוסמוס ולצלחת הפרוקסי. מרפדים צינור PVC גלילי בנייר טישו. צילינדר זה צריך להיות בעל רשת ניילון של מילימטר אחד מודבקת בתחתיתו במשפך.

מניחים את הצילינדר במשפך בארמן יושב בתוך בקבוקון. הוסף 20 מיליליטר של M9 למיקרוקוסמוס התולעת. התסיסו את התערובת ואז שפכו את התערובת מהכוס לתוך הגליל המרופד בנייר טישו במערך המשפך של בארמן.

טבלו את הקומפוסט במשפך לחלוטין על ידי הוספת M9 נוסף. שחררו את המהדק כדי לשחרר את התסנין המכיל את התולעים שנקטפו לתוך צינור של 50 מיליליטר. לאחר מכן לרכז את התולעים על ידי צנטריפוגה של הצינור ב 560 G במשך שתי דקות בטמפרטורת החדר. חזור על שלבים אלה ומשוך את התסנין מסיבובים שונים אם רוצים תולעים נוספות.

הסר את supernatant עם פיפטה סרולוגית תוך השארת 15 מיליליטר בצינור. מעבירים את הנוזל הנותר לצינור של 15 מיליליטר וצנטריפוגה שוב למשך דקה אחת כדי לרכז עוד יותר את התולעים. הסר 14 מיליליטר של supernatant עם פיפטה סרולוגית.

במקביל, אספו גרם אחד מאדמת המיקרוקוסמוס הנותרת לתוך צינור של 1.5 מיליליטר תוך עיבוד דגימות הקרקע המכילות את קהילת החיידקים הסביבתית כפי שמתואר בכתב היד. מעבירים מיליליטר אחד של התולעים המרוכזות שנקטפו לצינור של 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה מזכוכית. דגירה במשך שתי דקות כדי לאפשר לתולעים להתיישב בתחתית הצינור.

הסר את supernatant תוך השארת 100 microliters של הכדור ללא הפרעה בתחתית הצינור. שטפו את הכדור עם 1.5 מיליליטר של M9 בתוספת טריטון X, ואפשרו לתולעים להתיישב בתחתית בכל פעם. מעבירים את התולעים השטופות בנפח של 100 מיקרוליטר לצינור חדש של 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה מזכוכית.

כדי לשתק את התולעים, להוסיף 100 microliters של 25 מילימולר levamisole הידרוכלוריד לדגור במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. מוסיפים 200 מיקרוליטרים של תמיסת 4% אקונומיקה ומדגרים במשך שתי דקות. הסר את הסופרנאטנט והשאר את 150 המיקרוליטרים התחתונים ביותר ללא הפרעה, ושטוף את כדור התולעת שלוש פעמים עם M9 בתוספת Triton X.ניתן לאחסן את התולעים המעוקרות על פני השטח במינוס 20 מעלות צלזיוס עד לשימוש וניתן להשתמש בהן מאוחר יותר ליישומים במורד הזרם.

השוואה בין המיקרוביום של מעי התולעים לבין קהילות סביבתיות באמצעות ניתוח קואורדינטות עקרוני המבוסס על מרחק UniFrac לא משוקלל או משוקלל, הראתה אשכולות מובחנים של מיקרוביום של מעי תולעים הרחק מאלה שבסביבות שלהם. בעוד שניתוח קואורדינטות עקרוני המבוסס על מרחקי UniFrac לא הבחינו בין מיקרוביום אדמה למיקרוביום של תולעים, אשכולות המבוססים על מרחקים משוקללים חשפו הפרדה ברורה בין מיקרוביום של מעי תולעים ומיקרוביום קומפוסט. במחקר זה, תולעים שגודלו במיקרוקוסמוס קומפוסט שימשו לריצוף 16S, אך ניתן להשתמש בהן גם כדי לבחון את ההשפעות של מיקרוביום סביבתי שונה על עמידות המארח לתנאים שליליים.

לחלופין, ניתן לבודד טקסונים חיידקיים חדשים מתולעים שנקטפו ממיקרוקוסמוסים של קומפוסט על מנת להרחיב את המגוון הטקסונומי והתפקודי הידוע של קומנסלים במעיים. לאחר פיתוחו, צינור המיקרוקוסמוס הקל על הערכת התרומות של גורמים סביבתיים לעומת גנטיים מארחים בעיצוב המיקרוביום של המעיים.