חילוץ, תיוג וטיהור של תאים ספציפיים לשושלת מזקיקים אנטראליים אנושיים

הפרוטוקול שהודגם כאן מאפשר תיוג ובידוד של שושלות תאים ספציפיות הקיימות בזקיקי השחלות החל משלבים אנטראליים מוקדמים, ובכך מאפשר ניתוח ותרבית ברזולוציה גבוהה. גישה מדויקת זו משתמשת בשילובים של נוגדנים מצומדים פלואורופורים כדי להתמקד בסמנים של פני השטח של התא המתבטאים באופן חזק וספציפי בין שושלות גרנולוזה בדידות, סטרומה ותקה. התחל על ידי הנחת השחלה בצלחת פטרי סטרילי, ויוצקים מדיום צונן עם זה כדי לחות את הרקמה, להבטיח כי השחלה היא חצי שקוע בתווך.

הסר את התפרים או חומר אחר, ונתח את שאריות הרקמה שמסביב הרחק מהשחלה. כדי לבודד את הזקיקים האנטרליים, זהה זקיקים בודדים ובחר זקיקים בריאים. אין לכלול זקיקים מלאי דם, כהים או לא סימטריים.

בודד את הזקיקים האנטראליים שנבחרו מהשחלה באמצעות אזמלים, תוך שמירה על שלמות האנטרום וכריתת רקמת קליפת המוח המקיפה את הזקיק. מניחים כל זקיק אנטראלי שלם שנכרת בבאר אחת מתוך שש פלטות הבאר. באמצעות סרגל הממוקם מתחת לצלחת, לקבוע את קוטר הזקיק למטרות תיאוריות.

באמצעות אזמל, לחתוך את הזקיק האנטלי שלם כדי להעריך את החלל האנטראלי ולהוסיף שישה מיליליטר של תווך ניתוק תאים אנזימטי לפני הדגירה על הצלחת באינקובטור לח במשך 10 דקות. לאחר הדגירה, יש להוסיף שישה מיליליטר של מדיום זמין המכיל 20% נסיוב בקר עוברי, או FBS, ולשטוף עם המדיום על ידי פיפטינג נמרץ חוזר ונשנה על הזקיקים המפוצלים עם מיקרופיפטה P-1000. לאחר מכן, לאסוף את המדיום ולהעביר אותו דרך מסנן 100 מ"מ.

לאחר צנטריפוגה של הסופרנאטנט המסונן ב-300 גרם וארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות לפני, שאפו את הסופרנאטנט. מניחים את הרקמה הנותרת בתערובת של 100 יחידות למיליליטר קולגנאז ויחידה אחת למיליליטר דיספאס מדולל בתמיסת מלח מאוזנת לפני 30 דקות של דגירה. משבשים מכנית את הרקמה על ידי פיפטינג נמרץ ונמרץ פעמיים לאחר 10 ו -20 דקות.

לאחר שתסיים, לשחזר את הרקמה ולשטוף באמצעות pipetting, דרך קצה micropipette P-1000, ומסננים דרך מסנן 100 מיליליטר. צנטריפוגה את הרקמה המתוחה ב 300 G וארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות לפני הנחת גלולת התא מועשר בתאי theca ותאי stroma על קרח עבור תיוג FACS. כדי לזהות תאי גרנולוזה ותאי תיקה, יש להשהות מחדש את כדורי התא בתמיסת חסימה המכילה נוגדנים מצומדים ישירות ולדגור בארבע מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.

לאחר שטיפה וצנטריפוגה של התאים, יש להשהות מחדש את התאים במאגר FACS המכיל 4-6 דיאמידינו-2-פנילינדול, או DAPI, ולהריץ את תרחיף התא באמצעות מכשיר FACS כדי ללכוד אוכלוסייה קטנה של התאים, תוך שימוש בעוצמה הפלואורסצנטית של נוגדנים מצומדים פלואורופורים לגטינג. חותכים את שארית השחלה. הבלו את medulla באמצעות מספריים עדינים מעוקלים אזמלים, הימנעות נזק קליפת השחלות.

המשך עיבוד ודילול קליפת המוח השחלתית על ידי גירוד עדין עד שתישאר מדולה מינימלית. מחלקים את רקמת קליפת המוח לרצועות ברוחב שניים עד שלושה מילימטרים לאורך השחלה. להקפאת רקמת השחלה, יש להניח רצועה אחת בקליפת המוח בכל בקבוקון קריוגני צונן המכיל את תמיסת ההקפאה.

נערו את הבקבוקונים הקריוגניים המכילים את רצועות קליפת המוח על צלחת מסתובבת במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. יצירת גבישי קרח גרעיניים על ידי נגיעה בכל בקבוקון קריו עם קצה כותנה שקוע לזמן קצר בחנקן נוזלי. תאי השחלה נאספו ושברי התאים מוינו מזקיקי האנטראלים לטוהר של יותר מ-95%.

CD99 שסומן באופן ספציפי כתאי גרנולוזה ב-PVRL1, או נטין, עבר יותר ויותר לוקליזציה לתא תאי הגרנולוזה של האופורוס ככל שהזקיקים האנטרליים גדלו. נראה כי נוגדנים נגד אנדוגלין או CD55 תיחם באופן ספציפי את כל תאי סטרומה ותקה וכי אלנין אמינופפטידאז התבטא באופן ספציפי על ידי תאי תקה אנדרוגניים. התאים סומנו בנוגדן המכוון נגד CD99 לזיהוי תאי גרנולוזה ונוגדנים נגד CD45 שימשו להרחקת תאים המטופויטיים.

נוגדנים נגד PVRL1 הפרידו את אוכלוסיית תאי הגרנולוזה לתאי אופורוס וציורי קיר. לאחר עיכול אנזימטי עם collagenase dispase, תכשירי התאים המסומנים עם נוגדנים נגד CD55, CD34, ואלנין aminopeptidase אפשרה ללכוד את כל תאי סטרומה או theca או תאי theca אנדרוגניים עם הרחקת תאי אנדותל מאוכלוסיות תאי theca. יש להקפיד במיוחד להימנע משיבוש האנטרום של הזקיקים במהלך בידוד הזקיקים הראשוני על ידי חיתוך בשוליים בטוחים סביב גבולות הזקיק.

במורד הזרם של הליך זה, התאים יכולים לשמש לניתוח מולקולרי או אבחוני או לחילופין בתרבית במבחנה למחקרי טוקסיקולוגיה, ניתוח ניסיוני, או שחזור של מיקרו-סביבה של זקיקים. עד כה, שיטות אלה שימשו כדי למדל הפרעות אנדוקריניות המערבות את השחלה ולזהות תת-אוכלוסיות חדשות של תאים הקשורים לזקיק.