כימות הפעילות האנטי פטרייתית של פפטידים נגד קנדידה אלביקנס

פפטידים נחקרים כמולקולות אנטי-פטרייתיות חדשניות. פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר היעילות האנטי פטרייתית נגד הפתוגן הפטרייתי האנושי קנדידה אלביקנס. טכניקה זו מספקת נתונים כמותיים על פעילות אנטי פטרייתית תוך הפחתת זמן הניסוי ופסולת פלסטיק בהשוואה לשיטות אחרות הדורשות יצירה על אגר.

בנוסף לבדיקת הפעילות נגד קנדידה אלביקנס, פרוטוקול זה יכול לשמש לבדיקת הפעילות כנגד תאים יוצרי שמרים אחרים ולבדיקת פעילותם של חומרים אנטי-פטרייתיים בעלי מולקולות קטנות. התחילו בחיסון זן קנדידה אלביקנס הרצוי ל-10 מיליליטר של תמצית שמרים נוזלית-פפטון-דקסטרוז, או מדיום YPD, בצינורית תרבית. הגדילו את התרבית למשך הלילה ב-30 מעלות צלזיוס וב-230 סל"ד על שייקר סיבובי. תת-תרבית של תרבית הלילה של C.albicans וגדלה לצפיפות אופטית של כ-1.0 עד 1.2 באורך גל של 600 ננומטר.

ממיסים כל פפטיד במים סטריליים ומדללים אותו לריכוז הגבוה ביותר הרצוי, ולאחר מכן מוסיפים 40 מיקרוליטר של תמיסות מלאי הפפטיד הרצויות לבאר הראשונה של כל שורה בצלחת עגולה בעלת תחתית של 96 בארות. לאחר מכן, הוסף 20 מיקרוליטר של מים סטריליים טהורים במיוחד לעמודות 2 עד 12 של השורות המכילות את הפפטיד. כדי לדלל באופן סדרתי את תמיסות מלאי הפפטידים על פני הצלחת עד לעמודה 10, העבירו 20 מיקרוליטר מעמודה 1 לעמודה 2 וערבבו אותה על ידי פיפטציה למעלה ולמטה.

חזור על תהליך הדילול עד עמודה 10 אשר יכיל 40 מיקרוליטר של תמיסת פפטיד בדילול של 1 עד 512 של ריכוז עמודה 1. לאחר שתסיים, הסר 20 מיקרוליטר של תמיסת פפטיד מעמודה 10 והשלך אותה. מעבירים את תת-התרבות C.albicans לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר וצנטריפוגה ב -3, 900 גרם למשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.

הסר את supernatant על ידי pipetting או decanting. השהה מחדש את הגלולה עם 1 מיליליטר של חיץ נתרן פוספט 2 מילימולר ולהעביר את המתלה לצינור צנטריפוגה 1.7 מיליליטר. משחררים את התאים על ידי צנטריפוגה ומשליכים את הסופרנטנט.

שוב, להשעות מחדש את הגלולה במיליליטר 1 של חיץ נתרן פוספט 2 מילימולרי ולשטוף 2 פעמים נוספות כדי להשאיר את התאים שטופים 1 מיליליטר של חיץ פוספט נתרן. לקבוע את צפיפות התאים של תרחיף התא שטף לדלל את התרחיף ל 5 פעמים 10 לתאים 5 למיליליטר במאגר נתרן פוספט 2 מילימולרי. קח תרחיף תאי C.albicans מדולל והוסף 20 מיקרוליטר לעמודות 1 עד 10 ולעמודה 12 בכל שורה, ולאחר מכן הוסף 20 מיקרוליטר של חיץ נתרן פוספט 2 מילימולרי לעמודה 11.

מכסים את צלחת 1 ומניחים אותה באינקובטור בחום של 30 מעלות למשך 30 דקות. הכינו צלחת תרבית חדשה בת 96 בארות לכימות הכדאיות על ידי הוספת 100 מיקרוליטר של YPD לכל הבארות של צלחת מספר 2, ולאחר מכן הוסיפו 100 מיקרוליטר של חיץ נתרן פוספט 2 מילימולרי לכל הבארות של צלחת 2. כדי לדלל את הדגימות בצלחת 1, שלפו את צלחת 1 מהאינקובטור, והוסיפו 280 מיקרוליטר של חיץ נתרן פוספט 1 מילימולרי בכל באר.

לאחר ערבוב התוכן היטב עם פיפטה, להעביר 8 מיקרוליטר מצלחת 1 לבאר המתאימה של צלחת 2. לאחר שתסיים, הניחו את הצלחת המכוסה 2 על שייקר צלחת מיקרוטיטר במהירות 350 סל"ד למשך 17 שעות ב-30 מעלות צלזיוס. מערבבים את כל הבארות בצלחת 2 על ידי צנרת למעלה ולמטה, ומבטיחים שכל התאים מרחפים מחדש.

קבל קריאות צפיפות אופטית באורך גל של 600 ננומטר עבור כל באר בלוח 2 באמצעות קורא לוחות בליעה. התווה את הירידה בכדאיות כפונקציה של ריכוז הפפטיד כדי לחשב את אחוז עיכוב הצמיחה ולקבוע את השפעת הפפטידים על צמיחת C.albicans. לאחר הדגירה על הפפטידים עם תאי C.albicans, כומתה הפעילות האנטי-פטרייתית באמצעות יחידות יוצרות מושבה, או שיטת ספירת CFU והפרוטוקול המתואר המשלב מדידות צפיפות אופטיות.

הנתונים באמצעות קריאות הצפיפות האופטית היו ניתנים לשחזור במידה רבה, כפי שעולה מסטיות התקן הקטנות של המשוכפלים. בביצוע פרוטוקול זה, שמרו על תאי קנדידה אלביקנס בצורת שמרים על ידי דגירה של התאים בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס מכיוון שמדידות הצפיפות האופטית אינן אמינות בתאי ההיפל. יעילותה של שיטה זו אפשרה לחוקרים לבצע מחקרים משולשים גבוהים על פעילות הפפטידים על ידי בדיקת מספר גדול יותר של פפטידים וריכוזי פפטידים.