Name: בידוד זקיקים פרה-אנטרליים קטנים משחלת הבקר באמצעות שילוב של פיצול, הומוגניזציה וסינון סדרתי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: למדו שיטה מכנית לבידוד זקיקים פרה-אנטרליים משחלת בקר באמצעות פיצול, הומוגניזציה וסינון סדרתי. טכניקה זו מאפשרת מחקר מתקדם בביולוגיה רבייתית ושימור פוריות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרויקט זה מומן בחלקו על ידי פרויקט רב-מדינתי של USDA W4112 ופרס UC Davis Jastro Shields ל-SM.
המחברים רוצים להרחיב את הערכתם ל-Central Valley Meat, Inc. על אספקת שחלות הבקר המשמשות בכל הניסויים. המחברים גם מודים לאוליביה סילברה על הסיוע בעיבוד השחלות ובבידוד הזקיקים.

למחברים אין מה לחשוף.

הפרוטוקול הנוכחי מפרט שיטה הניתנת לשחזור לשליפת זקיקים פרה-אנטרליים בשלב מוקדם, במיוחד בשלבים ראשוניים ומשניים מוקדמים, משחלות הבקר. פרוטוקול זה מסתמך על דוחות קודמים 20,25,30,34,35,36 ומספק אופטימיזציות המביאות לבידוד מספר משמעותי של זקיקים משחלה בודדת. זקיקים פרה-אנטרליים שבודדו בשיטה זו הם ברי קיימא וניתן להשתמש בהם ליישומ...

זקיקי השחלות הם היחידות הפונקציונליות של השחלה, האחראיות על ייצור הגמטה (ביצית) וכן הורמונים קריטיים לתפקוד הרבייה ולבריאות הכללית. זקיקים קדמוניים נוצרים בשחלה במהלך התפתחות העובר או בתקופת היילודים בהתאם למין1, והם מהווים את שמורת השחלות של הנקבה. צמיחת הזקיקים מתחילה בהפעלת זקיקים קדמוניים העוזבים את בריכת המנוחה ונכנסים לשלב הגידול. פוליקולוגנזה פרה-אנטרלית, המקיפה את כל שלבי הזקיקים לפני התפתחות אנטרום, היא תהליך דינמי ביותר הדורש שינויים מורפולוגיים ומטבוליים סינכרוניים בביצית ובתאי הגרנולוזה הסובבים אותה, המונעים על ידי תקשורת הדוקה בין שני סוגי תאים אלה 2,3. זקיקים פרה-אנטרליים מהווים את רוב יחידות הזקיקים הנמצאות בשחלה בכל זמן נתון4. ההתפתחות בשלבים הפרה-אנטרליים של folliculogenesis מוערכת כארוכה בכמה שבועות מהתפתחות אנטרלית 5,6, והפעם היא הכרחית כדי שהביציות והתאים הסומטיים ירכשו בגרות מספקת כדי להיכנס לשלב הסופי של ההתפתחות (כלומר, השלב האנטרלי), ולהתכונן לביוץ, להפריה ולהתפתחות עוברית 7,8,9.
חלק גדול מהידע הנוכחי על פוליקולוגנזה פרה-אנטרלית של השחלות מגיע ממודלים של עכברים10,11,12,13, בין היתר בשל הקלות בהחלמת מספר גדול של זקיקים אלה משחלה קטנה יותר וסיבית פחות. אף על פי שהדיווחים על בידוד של מספר גדול של זקיקים פרה-אנטרליים משחלות בקר מתוארכים לסביבות 30 שנהו-14, הבנה מלאה יותר לגבי התהליכים המסדירים את התפתחותם של זקיקים אלה בשלב מוקדם נותרה בלתי ממומשת, בעיקר בשל היעדר שיטות אופטימליות, יעילות וחוזרות על עצמן כדי לאחזר מספר מספיק של זקיקים פרה-אנטרליים בני קיימא, במיוחד בשלבים מוקדמים של התפתחות. עם העניין הגובר בשימור הרזרבה השחלתית לשימוש עתידי ברבייה בסיוע בבני אדם, פרות הופכות למודל אטרקטיבי בשל מבנה השחלות הדומה יותר שלהן15. עם זאת, שחילת הבקר עשירה יותר בקולגן בהשוואה לשחלה של העכבר16, מה שהופך את הבידוד המכני בשיטות המתוארות עבור העכבר לבלתי יעיל מאוד. המאמצים להרחבת טכניקות שימור הפוריות כוללים גידול חוץ גופי מלא של זקיקים פרה-אנטרליים לשלב האנטרלי, ולאחר מכן הבשלה חוץ גופית (IVM) של הביציות הסגורות, הפריה חוץ גופית (IVF), וייצור והחזרת עוברים17. עד כה, כל התהליך הזה הושג רק בעכברים18. בבקר, ההתקדמות לקראת גידול זקיקים במבחנה מוגבלת למספר דיווחים עם שלבי זקיק משתנים בתחילת התרבית, כמו גם אורך משתנה של תרבית בין פרוטוקולים17,19.
השיטות המתוארות בספרות לקצירת זקיקים פרה-אנטרליים משחלת הבקר השתמשו בעיקר בטכניקות מכניות ואנזימטיות, מבודדות או בשילובשל 2,14,17,20. הדו"ח הראשון של פרוטוקול לבידוד זקיקים פרה-אנטרליים של בקר השתמש בהומוגנייזר רקמות וסינון סדרתי כדי לעבד שחלות שלמות20. בעקבות מחקר זה הגיעו דיווחים ששילבו פרוצדורות מכניות ואנזימטיות שהשתמשו בקולגנאז14. מוטיב חוזר בעת שימוש בקולגנאז לעיכול רקמת השחלות הוא הסיכון הפוטנציאלי לנזק של קרום המרתף הזקיקי, שעלול לפגוע בכדאיות הזקיקים 14,21,22,23. לכן, נעשה שימוש בשילובים שונים של שיטות מכניות, כגון שימוש במסוק רקמות ופיפטינג חוזר או מסוק רקמות בשילוב עם הומוגניזציה20,24,25,26. טכניקה מכנית נוספת שתוארה משתמשת במחטים כדי לנתח זקיקים פרה-אנטרליים ישירות מרקמת השחלות, וזה שימושי במיוחד לבידוד זקיקים משניים גדולים יותר (>200 מיקרומטר). עם זאת, תהליך זה גוזל זמן, אינו יעיל לבידוד זקיקים פרנטרליים קטנים יותר, והוא תלוי בכישורים כאשר מנסים להשתמש בשחלות בקר 19,27,28.
תוך ניצול הטכניקות השונות המתוארות בספרות, פרוטוקול זה נועד לייעל את הבידוד של זקיקים פרה-אנטרליים משחלות בקר בודדות באופן פשוט, עקבי ויעיל המונע דגירה בתמיסות אנזימטיות. שיפור השיטות לבידוד זקיקים פרה-אנטרליים יספק הזדמנות לשפר את ההבנה של שלב זה של פוליקולוגנזה ולאפשר פיתוח של מערכות תרבית יעילות לפיתוח זקיקים פרה-אנטרליים לשלב האנטרלי. הנהלים המפורטים המתוארים כאן לבידוד זקיקים פרה-אנטרליים מיונק גדול כמו מין הבקר יהיו חיוניים לחוקרים השואפים לחקור פוליקולוגנזה מוקדמת במין שאינו מורין הניתן לתרגום לבני אדם.

<table><tbody><tr><td>5-3/4 אינץ' סודה ליים חד פעמית זכוכית פסטר פיפטה</td><td>דוראן וויטון קימבל</td><td>63A54</td><td>פיפטת פסטר שניתן להשתמש בה כדי לעקור זקיקים מפסולת תוך כדי חיפוש בתוך צלחת הפטרי</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>מדולל ל-4%; קיבוע זקיקים לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>20 מ"ל מזרק Luer-lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>Z116882-100EA</td><td>מזרק המשמש עם מחט 18 G כדי לעקור זקיקים מה-40 &mu; מסננת תאים m</td></tr> <tr><td>#21 להב אזמל סטרילי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-365-023</td><td>משמש לחיתוך השחלות והסרת המדולה</td></tr><tr><td>40 &mu; m מסננת תאים</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>22-363-547</td><td>משמש לסינון המסנן מה-300 &mu; מסננת תאים</td></tr><tr><td>m 104 מ"מ משפך פלסטיק</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10-348C</td><td>הגודל יכול להשתנות, אך ודא שבד הגבינה נחתך כראוי ושההומוגנט השחלתי לא יישפך מעל</td></tr><tr><td>300 &mu; מסננת תאים</td><td>m pluriSelect&nbsp;</td><td>43-50300-03</td><td>משמש לסינון המסנן מבד הגבינה&nbsp;</td></tr><tr><td>500 מ"ל בקבוק ארלנמאייר</td><td>פישר FB500500 מדעי</td><td></td><td>משפך ובקבוק המשמשים לתפיסת סינון מבד הגבינה&nbsp;</td></tr><tr><td>מחטים סטריליות Air-Tite 18 G</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14-817-151</td><td>18 G מציע מספיק לחץ כדי לעקור זקיקים מה-40 &mu; מסננת תאים</td></tr><tr><td>m מחטים סטריליות Air-Tite 27 G 13 מ"מ</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-817-171</td><td>מחטים שניתן להשתמש בהן כדי לתפעל כל פסולת שבה תקועים זקיקים</td></tr><tr><td>BD Hoechst 33342 Solution</td><td>Fisher Scientific</td><td>BDB561908</td><td>כתם DNA פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G&nbsp;</td><td>רכיב של מדיית שטיפת זקיקים</td></tr><tr>מדעי <td>מיקרוסקופיה</td> <td>אלקטרונית מבד גבינה</td><td>71748-00</td><td>שלב סינון ראשון של ההומוגנט השחלתי שנועד להסיר פסולת רקמות גדולות</td></tr><tr><td>סכיני גילוח בטיחותיים קלאסיים כפולים סכיני גילוח</td><td>Wilkinson Sword</td><td>N/A</td><td>סכיני גילוח המתאימים ביותר לקוצץ הרקמות של McIlwain ואינם משעממים במהירות</td></tr><tr><td>נוגדן משני חמור-אנטי ארנב, Alexa Fluor 488</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-21206</td><td>נוגדן משני לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>נורות פיפטה לטקס Eisco</td><td>Fisher Scientific</td><td>S29388</td><td>נורת גומי לשימוש עם פיפטות</td></tr><tr><td>פסטר HEPES Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>רכיב של אמצעי שטיפת זקיקים</td></tr><tr><td>הומוגנייזר</td><td>VWR</td><td>10032-336</td><td>הומוגניזציה של רקמת השחלה לשחרור זקיקים&nbsp;</td></tr><tr><td>ImageJ/Fiji</td><td>NIH</td><td>v2.3.1</td><td>תוכנה המשמשת לניתוח פלואורסצנטי-אימונולוקליזציה</td></tr><tr><td>קוצץ רקמות McIlwain</td><td>Ted Pella</td><td>10184</td><td>משמש לחיתוך רקמת שחלה קטנה מספיק להומוגניזציה</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ - סטריאוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>SZX2-ILLT</td><td>מיקרוסקופ דיסקציה המשמש לחיפוש וקצירת זקיקים</td></tr><tr><td>ממיקרוסקופ הסינון - ניקון הפוך</td><td></td><td>מיקרוסקופ הפוך Diaphot 300</td><td>המשמש להדמיית שדה בהיר בהגדלה גבוהה של זקיקים מבודדים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ -</td> הפוך <td>ECHO</td><td>Revolve R4</td><td>מיקרוסקופ הפוך המשמש להדמיית שדה בהיר בהגדלה גבוהה ואפיפלואורסצנטי של זקיקים מבודדים</td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410-1L</td><td>שמן לכיסוי טיפות מדיום שטיפת הזקיקים למניעת אידוי במהלך החיפוש</td></tr><tr><td>חומצות אמינו לא חיוניות (NEAA)</td><td>Gibco</td><td>11140-050</td><td>רכיב של מדיום שטיפת זקיקים</td></tr><tr><td>סרום חמור רגיל</td><td>ג'קסון ImmunoResearch</td><td>017-000-001</td><td>מגיב לחסימת צביעה חיסונית</td></tr><tr><td>Nunc 4-well כלים להפריה חוץ גופית</td><td>תרמו פישר 144444 כלים</td><td></td><td>4 בארות לבידוד זקיקים ושטיפת</td></tr><tr><td>תמיסת פניצילין-סטרפטומיצין 100x</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>רכיב של שטיפת זקיקים בינונית</td></tr><tr><td>צלחת פטרי 60 מ"מ OD x 13.7 מ"מ</td><td>טד פלה</td><td>10184-04</td><td>צלחת פטרי המתאימה ביותר למסוק רקמות McIlwain</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td>מאגר כביסה לשחלות וזקיקים</td></tr><tr><td>קרש חיתוך מפלסטיק</td><td>Fisher Scientific</td><td>09-002-24A</td><td>קרש חיתוך בגודל מספיק לחיתוך בטוח שחלות</td></tr><tr><td>פוליוויניל פירולידון (PVP)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP431-100</td><td>תוספת של PVP (0.1% משקל/נפח) ל-PBS מונעת מהזקיקים להידבק לצלחת או זה לזה&nbsp;</td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td>מדיום הרכבה לתאים או רקמות עם תווית פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>Qiagen RNeasy Micro Kit</td><td>Qiagen</td><td>74004</td><td>ערכת ניקוי עמודות RNA</td></tr><tr><td>R</td><td>The R Foundation</td><td>v4.1.2</td><td>תוכנת ניתוח סטטיסטי</td></tr><tr><td>ארנב-אנטי-אנושי Cx37/GJA4 נוגדן פוליקלונלי</td><td>Abcam</td><td>ab181701</td><td>Cx37 נוגדן ראשוני לצביעה חיסונית</td></tr><tr><td>RevertAid RT ערכת שעתוק הפוך</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1691</td><td>ערכת סינתזה cDNA</td></tr><tr><td>Rstudio</td><td>RStudio, PBC</td><td>v2021.09.2</td><td>תוכנת ניתוח סטטיסטי</td></tr><tr><td>תמיסת נתרן הידרוקסיד (1N/מוסמך)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td>משמש להעלאת pH המדיה ל-7.6-7.8</td></tr><tr><td>נתרן פירובט (NaPyr)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td>רכיב של שטיפת זקיקים בינונית</td></tr><tr><td>צלחת פטרי מרובעת 100 מ"מ x 15 מ"מ&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>60872-310</td><td>צלחות פטרי מרושתות מאפשרות זיהוי יעיל יותר של זקיקים&nbsp;</td></tr><tr><td>SsoAdvanced אוניברסלי SYBR Green Supermix</td><td>BioRad</td><td>1725271</td><td>Mastermix לתגובת PCR</td></tr><tr><td>מסנן עליון בקבוק הברגה Steritop</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2GPT02RE</td><td>משמש לעיקור שטיפת זקיקים בינונית</td></tr><tr><td>כתם ג'ל DNA בטוח ל-SYBR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>S33102</td><td>מכתים למוצרי PCR חזותיים על ג'ל אגרוז</td></tr><tr><td>TCM199 עם האנק' s מלחים</td><td>Gibco</td><td>12-350-039</td><td>רכיב של שטיפת זקיקים בינונית</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-100</td><td>חומר ניקוי למאגר חדירות צביעה חיסונית</td></tr><tr><td>מגיב טריזול</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td>מגיב בידוד RNA</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td> <td>Gibco</td><td>15-250-061</td><td>משמש לבדיקת כדאיות של זקיקים מבודדים</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td></td><td></td><td>חומר ניקוי למאגר כביסה חיסוני</td></tr><tr><td>צלחת חמה אוניברסלית</td><td>WTA</td><td>20931</td><td>צלחת חמה לשמירה על זקיקים ב-38.5 מעלות; C תוך כדי חיפוש תחת המיקרוסקופ</td></tr><tr><td>Wiretrol II מיקרופיפטות מכוילות</td><td>Drummond</td><td>50002-005</td><td>מיקרופיפטות זכוכית למניפולציה של זקיקים</td></tr></tbody></table>

בידוד זקיקים פרה-אנטרליים קטנים משחלת הבקר באמצעות שילוב של פיצול, הומוגניזציה וסינון סדרתי

Isolation of Small Preantral Follicles from the Bovine Ovary Using a Combination of Fragmentation, Homogenization, and Serial Filtration

הבנת התהליך המלא של פוליקולוגנזה של יונקים היא חיונית לשיפור טכנולוגיות הרבייה בסיוע בבעלי חיים, בבני אדם ובמינים בסכנת הכחדה. המחקר הוגבל בעיקר לזקיקים פרה-אנטרליים וגדולים בשל קושי בבידוד של זקיקים פרה-אנטרליים קטנים יותר, במיוחד ביונקים גדולים כמו מיני בקר. עבודה זו מציגה גישה יעילה לשליפת מספר גדול של זקיקים פרה-אנטרליים קטנים משחלה אחת של בקר. קליפת המוח של שחלות בקר בודדות נפרסה לקוביות של 500 מיקרומטר באמצעות מסוק רקמות והומוגנית במשך 6 דקות ב-9,000-11,000 סל"ד באמצעות בדיקה של 10 מ"מ. פסולת גדולה הופרדה מההומוגנט באמצעות בד גבינה, ולאחר מכן סינון סדרתי דרך מסנני תאים של 300 מיקרומטר ו-40 מיקרומטר. התכולה שנשמרה במסננת 40 מיקרומטר נשטפה לתוך צלחת חיפוש, שם זוהו זקיקים ונאספו לתוך טיפה של מדיום. הכדאיות של הזקיקים שנאספו נבדקה באמצעות צביעה כחולה טריפאן. שיטה זו מאפשרת בידוד של מספר רב של זקיקים פרה-אנטרליים קטנים בני קיימא משחלת בקר בודדת תוך כ-90 דקות. חשוב לציין ששיטה זו היא מכנית לחלוטין ומונעת שימוש באנזימים לניתוק הרקמה, מה שעלול לפגוע בזקיקים. הזקיקים המתקבלים באמצעות פרוטוקול זה יכולים לשמש ליישומים במורד הזרם כגון בידוד RNA עבור RT-qPCR, אימונולוקליזציה של חלבונים ספציפיים ותרבית חוץ גופית .

סקירה כללית ושלבים קריטיים באמצעות פרוטוקול זה, ניתן לבודד באופן אמין זקיקים פרה-אנטרליים קטנים של בקר משחלות בודדות במספרים רלוונטיים לניסוי. מתוך סך של 30 שכפולים, התקבלו בממוצע 41 זקיקים לכל שכפול, עם טווח של 11 עד 135 זקיקים (איור 4A). ב-14 שכפולים, הזקיקים אופיינו לשלב ההתפתחות כפי שתואר קודםלכן 26 על ידי מדידת קוטר הזקיק באמצעות שקופית כיול מיקרוסקופ של 1 מיקרומטר מתחת לסטריאומיקרוסקופ. בשיטה זו, 476 זקיקים בסך הכל סווגו כראשוניים (זקיקים בגו...

קידום המחקר של פוליקולוגנזה פרה-אנטרלית דורש שיטות יעילות לבידוד זקיקים משחלות בודדות. מוצג כאן פרוטוקול מכני יעיל לבידוד זקיקים משחלות בקר באמצעות מסוק רקמות והומוגנייזר. שיטה זו מאפשרת איסוף של מספר רב של זקיקים פרה-אנטרליים בני קיימא משחלה אחת.

Understanding the full process of mammalian folliculogenesis is crucial for improving assisted reproductive technologies in livestock, humans, and ...

פרוטוקול זה מאפשר בידוד יעיל וניתן לחזרה של זקיקים קדם-אנטרליים בשלב מוקדם משחלת בקר בודדת והוא יוצר הזדמנויות חדשות לחקר זקיקים שחלתיים במין שאינו שור. על ידי שימוש במספר גדול יותר של זקיקים משחלה אחת, טכניקה זו מאפשרת טיפולי in vivo לפני קציר השחלה, או הסתרה של דגימות מרובות לאורך זמן מאותה חיה באמצעות ביופסיה שחלתית. בידוד ושימור קריו של זקיקים טרום-אנטרליים בשלב מוקדם יכולים להיות אופציה רבת ערך לשימור פוריות אצל נשים צעירות העוברות טיפולים גונדוטוקסיים כגון כימותרפיה, כמו גם שימור נבטים ממינים בסכנת הכחדה.מי שידגימו את ההליך יהיו סטפני מקדונל, אמנדה מורטון וג'וליאנה קנדלריה, דוקטורנטיות מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להעביר את השחלות במעבדה ל- PBS חם וסטרילי המכיל Pen-Strep ושחלות נבחרות עם זקיקים אנטרליים קטנים רבים וללא קורפוס לוטטיום בולט. הסר כל רקמת חיבור עודפת ושומן מן השחלות באמצעות מספריים.מעבירים שחלה אחת לקרש החיתוך על נייר הספסל. בעזרת אזמל חותכים את השחלה לחצי אורך מאתר חיבור של רצועה אחת לאתר החיבור הנגדי. יש לשמור מחצית אחת של השחלה על קרש החיתוך לעיבוד ולהחזיר את החצי השני של השחלה ל-PBS חם המכיל Pen-Strep.כדי להסיר את medulla, פרוס לאורך העקמומיות של השחלה במרחק של כ -2 מילימטר מפני השטח מבלי לחתוך דרך קליפת המוח עם medulla חשוף פונה כלפי מעלה. פורסים את החתך כדי להסיר את רוב המדולה. הפוך את השחלה כך שהאפיתל פונה כלפי מעלה והשתמש באזמל כדי לסיים לחתוך את המדולה הרחק מקליפת המוח ולחתוך את כל רקמת החיבור הלבנה שנותרה סביב קצה השחלה שהייתה מחוברת לרצועות.לאחר הסרת רוב המדולה, השתמשו באזמל כדי לחתוך את קליפת המוח לעובי של כמילימטר אחד תוך כדי מניפולציה של האזמל בתנועות קטנות קדימה ואחורה כדי לגלח את שארית המדולה, ואז חתכו כל חצי קליפת שחלה לשני חלקים. שמור את חתיכות קליפת המוח ב PBS חם המכיל Pen-Strep עד מוכן לקצוץ. מעבירים חתיכה אחת של קליפת המוח לצלחת פטרי על מסוק הרקמה ומרטיבים את הרקמה בשלוש או ארבע טיפות של PBS חם המכיל Pen-Strep.תוך כדי החזקת פיסת הרקמה יציבה עם זוג מלקחיים, לחץ על כפתור האיפוס פעם אחת כדי להפעיל את מסוק הרקמה. לאחר שכל פיסת קליפת המוח נחתכה לרצועות, השתמש בידית מחזיק הלהב כדי להרים את הלהב מצלחת הפטרי ובמלקחיים כדי להסיר כל רקמה מהלהב. לאחר סיבוב מחזיק הצלחת ב -90 מעלות, שוב, לחץ על כפתור האיפוס והעבר את הלהב כולו דרך רצועות הרקמה.השתמש בידית מחזיק הלהב כדי להרים את הלהב מעל צלחת פטרי ואת המלקחיים כדי להסיר כל רקמה מהלהב כפי שהוכח קודם לכן. באמצעות פיפטה העברה ו- PBS חם המכיל Pen-Strep, לשטוף את הרקמה הקצוצה לתוך צינור חרוטי מחמם מראש 50 מיליליטר. החזירו את הצינור החרוטי למים או לאמבטיית החרוזים כדי לשמור על הרקמה הקצוצה חמה תוך חזרה על הליך החיתוך עם שלושת החצאים האחרים של השחלה.לקבלת תוצאות החיתוך הטובות ביותר, השתמש בדרייבר האום כדי להסיר את האגוז מזרוע החיתוך ולהסיר את מכונת הכביסה ואת אבזם הלהב. באמצעות מלקחיים, הסר את הלהב מזרוע החיתוך. הפוך אותו כך שהקצה שאינו בשימוש פונה לצלחת הפטרי והנח אותו בחזרה על זרוע החיתוך.לאחר שווידאת שיחידת ההומוגנייזר מחוברת לחשמל והמהירות מוגדרת למוט השני, הכנס את בדיקת הגנרטור 10 מ"מ ליחידה בהתאם למפרט היצרן. לאחר מכן, הגדר טיימר למשך דקה אחת והכנס את הבדיקה לצינור החרוטי של 50 מיליליטר המכיל את רקמת קליפת המוח הקצוצה משחלה אחת ומספיק PBS המכיל Pen-Strep כדי למלא את הצינור לקו 25 מיליליטר. העומק שאליו מוכנסת הבדיקה חייב להיות 1/3 מגובה הנוזל הנמדד מתחתית התא.ברגע שהטיימר מתחיל, הפעל את ההומוגנייזר, וודא שתחתית הבדיקה לא תיגע בצינור ותחזיק את הצינור עדיין בזמן שההומוגנייזר מופעל. לאחר דקה אחת של הומוגניזציה, הסר את הבדיקה מהצינור, ולאחר מכן הסר כל רקמת חיבור שסותמת את חורי האוורור ברווח שבין סכין הרוטור לצינור הרוטור או חלקי קליפת המוח שנתקעו בגשושית באמצעות מלקחיים והנח אותם בחזרה לתוך הצינור. יוצקים את הרקמה המפוזרת לתוך המשפך המכוסה בבד גבינה, מוכנס לתוך בקבוק Erlenmeyer ולשטוף את תוכן הצינור לתוך המשפך באמצעות PBS חם.לבסוף, לשטוף את הגבינה עם PBS חם. מאלצים את הנוזל בשברים קטנים לעבור דרך חורי הבד על ידי סיבוב בד הגבינה סביב שברי הרקמה כלפי מטה וסחיטה עד שכל עודפי הנוזלים והרקמות מוסרים מבד הגבינה. לאחר פתיחה מחדש של מטלית הגבינה מעל המשפך, יש לשטוף את מטלית הגבינה עם PBS המכיל Pen-Strep באמצעות פיפטה העברה, ושוב, לסחוט את כל שאריות הרקמה דרך הבד.בעזרת המוסטאט, החזיקו את מסננת התאים בקוטר 300 מיקרומטר מעל בקוטר 200 מיליליטר ושפכו את התסנין בבקבוק ארלנמאייר דרך מסננת התא. אם מסננת התאים נסתמת בטישו, טפחו אותה בעדינות על הכוס, ואז הפכו את המסננת וטפחו את פסולת הרקמה הגדולה על נייר הספסל. יש לשטוף את תכולת הבקבוקון באמצעות PBS חם המכיל Pen-Strep עד שלא יישארו שברי רקמה ולשפוך אותו לתוך מסננת התא.לאחר מכן, תוך כדי החזקת מסננת התאים בגודל 40 מיקרומטר עם המוסטאט על שנייה של 200 מיליליטר, יוצקים את כל התסנין הראשוני שנמצא בכוס הראשונה של 200 מיליליטר דרך המסננת, ואז שוטפים את תוכן הכוס באמצעות PBS חם המכיל Pen-Strep עד שלא יישארו שברי רקמה ויוצקים אותו לתוך מסננת התא. לאחר התאמת מחט 18 מד למזרק 20 מיליליטר, למלא את המזרק עם מדיום שטיפת זקיקים. בעזרת המוסטאט, החזיקו את מסננת התאים בקוטר 40 מיקרומטר במהופך מעל צלחת פטרי מרובעת והשתמשו במזרק כדי לשטוף את תכולת מסננת התאים לתוך המנה.מעבירים את צלחת הפטרי המרובעת לסטריאוסקופ עם סט במה חם ל-38.5 מעלות צלזיוס עם סט הגדלה בין 1.25 ל-3.2x. לאחר זיהוי הזקיקים מצלחת הפטרי המרובעת, מעבירים את הזקיק לשטיפת טיפות בינוניות באמצעות המיקרופיפטה. המספר הכולל של זקיקים קדם-אנטרליים מבודדים לכל שכפול באמצעות הומוגניזציה של רקמות של 6 דקות מראה ממוצע של 41 זקיקים לכל שכפול, הנעים בין 11 ל -135 זקיקים.הערכת השלב ההתפתחותי של 476 זקיקים מבודדים הראתה כי רובם נמצאים בשלב הראשוני של ההתפתחות, בגודל 40 עד 79 מיקרומטר המכילים שכבה אחת של תאי גרנולוזה קובואידיים. הומוגניזציה של קליפת השחלות במשך 6 דקות הניבה מספר גדול יותר של זקיקים פרה-אנטרליים בהשוואה ל-5 דקות של הומוגניזציה באותה מהירות. ביטוי תעתיק של קולטן תא גרנולוזה קולטן FSH וסמן תא נבט DAZL בזקיקים הוערך באמצעות שעתוק לאחור כמותי PCR המדגים כי הן הזקיקים הראשוניים והן הזקיקים המשניים המוקדמים ביטאו את קולטן FSH ותעתיקי DAZL.לוקליזציה אימונופלואורסצנטית של CX37 בזקיקים פרה-אנטרליים מבודדים הן בשלב הראשוני והן בשלב המשני המוקדם מראה כי CX37 היה מקומי לפלסמה O, בהיותו נעדר מהגרעין של אתר O ולקרום של תאי הגרנולוסה. מניסיוננו, דיסקציה נכונה של שכבה דקה של רקמת קליפת המוח, חיתוך הרקמה לגודל הנכון והומוגניות נכונה הם צעדים קריטיים כדי להבטיח שחרור של זקיקים בני קיימא מהרקמה. ניתן להשתמש בזקיקים קדם-אנטרליים מבודדים כדי לענות על שאלות כגון ויסות גדילת הזקיקים הקדם-אנטרליים ואופי האינטראקציות בין תאי גרנולוזה לביצית, ובכך להקל על התפתחותם של תנאי תרבית יעילים יותר.

isolation-small-preantral-follicles-from-bovine-ovary-using

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

שיטה חדשה אנקפסולציה השחלות זקיק ברשת 3D הפיברין-אלגינט interpenetrating מתואר. מערכת זו משלבת תמיכה מבנית עם השפלה פרוטאוליטי כדי לתמוך בפיתוח של זקיקים בשלים לייצר ביציות בוגרות. שיטה זו עשויה להיות מיושם אגרגטים תא התרבות לשמור תאים תאים מגעים ללא הגבלת ההתרחבות.

שיטה Encapsulation השחלות זקיק ותרבות מערכת 3 מתכלה Proteolytically מימדי

סרטון זה מתאר את הבידוד של ביציות אנטראליות משחלות עכבר שזה עתה נקטפו. ביציות אנטראליות אלה יכולות לשמש לאפיון נוסף ולמחקרים התפתחותיים.

בידוד ביציות אנטראליות של עכבר: שיטה לבידוד ביציות אנטראליות משחלות עכבר שזה עתה נקטפו

סרטון זה מתאר את הטכניקה לבידוד קומפלקס קומולוס-ביציות או COC משחלות חזיריות. ניתן להשתמש ב- COC המבודד והשלם לביצוע הפריה חוץ גופית - טכניקת הרבייה בסיוע לפיתוח טיפולי פוריות.

בידוד תרכובת ביציות קומולוס חזיריות: טכניקה לבידוד קומפלקס ביציות קומולוס מזקיק שחלות חזירי להפריה חוץ גופית

מוצגים כאן שני פרוטוקולים לתחינה של ציטים שונים בתנאי תרבות תלת-מידוד. בתחילה, קומפלקסים cumulus-oocyte (COCs) הם עטוף חרוזים fibrin-אלגינט. בשנייה, הם מוקפים פלואורציה אתילן פרופילן אבקת חלקיקי (microbioreactors). שתי המערכות מבטיחות תנאים אופטימליים לשמירה על ארגון תלת-מיוד.

הידרוג'לים אלג'ינאט מפורקים ופרוטאוליטית ומיקרוביו-סיבה לאנקלוסציה של פורצין אוציט

אנו מתארים את ההליכים לבידוד של גידול oocytes מזקיקי השחלות בשלבים מוקדמים של פיתוח, כמו גם את ההתקנה של מערכת תרבות מבחנה אשר יכול לתמוך בצמיחה ובידול עד לשלב הבוגר במלואו.

במבחנה תרבות אסטרטגיה עבור Oocytes מ זקיק אנטרל מוקדם בבקר

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה להפרדת תאים זקיקיים וביצית בזקיקים השחלות זברה, אשר יקל על חקירות של התפתחות השחלות ב זברה.

הפרדת תאים זקיקים וביצים בזקיקי השחלות של זברהפיש

כאן אנו מציגים פרוטוקולים לזיהוי וטיהור תאי שחלה מזקיקים אנטראליים. אנו מרחיבים שיטות לעיבוד שחלות שלמות לשימור בהקפאה של רצועות קליפת המוח תוך קצירת זקיקים אנטראליים שלמים המטופלים באופן אנזימטי כדי לשחרר סוגים רבים של תאים שוכנים זקיקים, כולל גרנולוסה, תיקה, אנדותל, המטופויטים ותאי סטרומה.

חילוץ, תיוג וטיהור של תאים ספציפיים לשושלת מזקיקים אנטראליים אנושיים

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקול המתאר כיצד לבודד זקיקי שחלות אנושיות מרקמת קליפת המוח שהוקפאה והופשרה כדי לבצע ניתוחי ביטוי גנים.

ניתוח ביטוי גנים בזקיקים אנושיים

כאן, אנו מתארים פרוטוקול להפרדת תאי חלמון, גרנולוזה ותאי תקה בזקיקי קדם-ביוץ של עופות. טיפול מדויק זה מאפשר חקירות קריטיות של תפקידן של שכבות אלה בתפקוד הרבייה, ומסייע להבנת התפתחות הזקיקים, ויסות הורמונלי וחקר מחלות לשיפור התפוקה החקלאית ותובנות ביו-רפואיות.

הפרדה של גרנולוזה של זקיקי קדם-ביוץ של עופות ושכבות תאי Theca ליישומים במורד הזרם

פרוטוקול זה מתאר מודל תרבית תלת מימדי חדש (3-D) המשתמש בהידרוג'ל היאלורונן המקושר לטירמין כדי לעטוף ולתרבית זקיקים פרה-אנטרליים משחלת העכבר. אנו מפרטים גם שתי גישות לשימור הקפאה של זקיקי השחלות על ידי ויטריפיקציה.

יישום של הידרוג'ל היאלורונן חדשני לתרבית זקיקים תלת מימדית ומתודולוגיה לשימור הקפאה של זקיקי שחלות עכבר

מאמר זה מציג מודל תרבית משותפת של תאי תקה וגרנולוזה בקר. לשיטה זו יש פוטנציאל לשמש בסיס אמין לניתוחים המתמקדים בחקר תקשורת פרקרינית והובלת מצע בין התאים הסומטיים בתוך הזקיק.

מערכת קו-תרבית מותאמת להבנת אינטראקציות בין תאי גרנולוזה-תקה בשחלת הבקר

למדו שיטה מכנית לבידוד זקיקים פרה-אנטרליים משחלת בקר באמצעות פיצול, הומוגניזציה וסינון סדרתי. טכניקה זו מאפשרת מחקר מתקדם בביולוגיה רבייתית ושימור פוריות.

בידוד זקיקים פרה-אנטרליים קטנים משחלת הבקר באמצעות שילוב של פיצול, הומוגניזציה וסינון סדרתי

גלה סרטונים נוספים