Name: הקמת אורגנואידים 3D רירית הרחם מרחם העכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-01-06T13:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: למד שיטה לבידוד אפיתל רחמי טהור מרחם העכבר באמצעות פירוק אנזימטי ומכני ליצירת אורגנואידים תלת־ממדיים. השיטה מאפשרת חקר מנגנוני התחדשות רירית הרחם ומחלות כגון אנדומטריוזיס וסרטן.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר סטפני פנגס ולד"ר מרטין מ. מצוק (M.M.M.) על הקריאה הביקורתית והעריכה של כתב היד שלנו. המחקרים נתמכו על ידי המכון הלאומי לבריאות הילד והתפתחות האדם ע"ש יוניס קנדי שרייבר R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) ו-R01-HD110038 (M.M.M.), ועל ידי מענק התמיכה של מרכז הסרטן NCI- P30 (NCI-CA125123). דיאנה מונסיוויס, Ph.D. מחזיקה בפרס הריון מהדור הבא מקרן בורוז וולקום.

טיפול בעכבר ומחקרים ניסיוניים בוצעו תחת פרוטוקולים שאושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של מכללת ביילור לרפואה והנחיות שנקבעו על ידי מדריך NIH לטיפול ושימוש בחיות מעבדה.
1. בידוד אפיתל הרחם מעכברים בשיטות אנזימטיות ומכניות
הערה: סעיף זה מתאר את השלבים הנדרשים כדי ליצור, לעבור, להקפיא ולהפשיר אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם מעכברים באמצעות פיגום מטריצת ג'ל. מחקרים קודמים קבעו כי תרביות אופטימליות של אורגנואידים רירית הרחם של עכברים נקבעות מעכברים במהלך שלב4 estrus, אשר ניתן לקבוע על ידי בדיקה ציטולוגית של ספוגית נרתיק15. נקבות עכברי WT בוגרות (בנות 6-8 שבועות, C57BL/6J היברידי ו-129S5/SvEvBrd) שימשו לכל הניסויים. העכברים הומתו באופן הומני על פי הנחיות שאושרו על ידי IACUC באמצעות טשטוש איזופלורן ואחריו דיסארטיקולציה של צוואר הרחם. לאחר הרדמת העכברים, יש לבצע את השלבים הבאים. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לחומרים ולפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה.
<ol><li>יש להפשיר את מטריצת הג'ל על הקרח למשך כ-1-2 שעות לפני השימוש.</li>
	<li>כדי לנתח את העכבר, השתמש במספריים כדי לבצע חתך בקו האמצע על הבטן ולקלף בעדינות את העור בחזרה כדי לחשוף את שכבת הצפק שמתחת. השתמש מלקחיים כדי להחזיק את שכבת הצפק ולעשות חתכים לרוחב עם מספריים כדי לחשוף את תוכן הבטן.<ol><li>אתר את קרני הרחם על ידי הזזה עדינה של כריות שומן הבטן הצידה. נתחו אותם על ידי החזקתם תחילה בצומת צוואר הרחם ושימוש במספריים כדי לחתוך לאורך השומן המזנטרי. לאחר כריתה של רחם העכבר, להסיר ביסודיות רקמת שומן מן קרן הרחם עם מספריים קטנים. הערה: שמור על סטריליות במהלך בידוד התאים על ידי עיקור כל כלי הניתוח לפני השימוש, רסס את בטן העכבר ב-70% אתנול ובצע את כל השלבים שלאחר כריתה תחת מכסה מנוע של תרבית רקמה סטרילית.</li>
	</ol></li>
	<li>חותכים כל קרן רחם לשברים קטנים, כל אחד בגודל של כ 4-5 מ"מ.</li>
	<li>מניחים את כל שברי הרחם מרחם אחד לבאר אחת של צלחת בת 24 בארות המכילה 0.5 מ"ל של 1% טריפסין. אפשר את הפתרון האנזימטי להיכנס לומן הרחם, גרימת הפרדה אנזימטית של אפיתל רירית הרחם מן stroma התחתון.</li>
	<li>לדגום את צלחת 24 באר בחממה תרבית רקמה לחה של 37 מעלות צלזיוס במשך כשעה.</li>
	<li>לאחר הדגירה של שעה, מעבירים את שברי הרחם לצלחת תרבית רקמה בקוטר 35 מ"מ המכילה 1 מ"ל של תמיסת אגירת פוספטים (DPBS) של דולבקו.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ דיסקציה, השתמש מלקחיים עדינים פיפטה 1 מ"ל כדי להפריד מכנית את אפיתל הרחם מן צינור הרחם. תוך כדי החזקת קצה אחד של שבר הרחם עם המלקחיים, הפעל בעדינות את קצה הפיפטה לאורך השבר, וסוחט את האפיתל מהקצה השני של צינור הרחם. שימו לב ליריעות האפיתל המופרדות מקטע הרחם תחת מיקרוסקופ הדיסקציה.</li>
	<li>השתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לאסוף ולהעביר בעדינות את יריעות האפיתל לתוך צינור 1.5 מ"ל.</li>
	<li>חזור על התהליך עבור שברי הרחם הנותרים, העברת כל יריעות האפיתל לאותו צינור איסוף.</li>
	<li>גלולה את יריעות האפיתל המנותקות על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 375 × גרם.</li>
	<li>הסר בזהירות את הסופרנטנט כדי למנוע הפרעה לכדור התא.</li>
	<li>יש להשהות את גלולת התא ב-0.5 מ"ל של קולגן במינון 2.5 מ"ג/מ"ל + תמיסת DNase של 2 מ"ג/מ"ל. פיפטה למעלה ולמטה בערך פי 10, או עד להשגת השעיה של תא בודד.</li>
	<li>יש להוסיף 0.5 מ"ל של DMEM/F12 + 10% סרום בקר עוברי (FBS) + אנטיביוטיקה, ולבצע צנטריפוגה בתאים למשך 5 דקות ב-375 × גרם. הערה: למידע נוסף על האנטיביוטיקה רחבת הטווח המשמשת לתרבית תאים, עיין בטבלת החומרים.</li>
	<li>הסר בזהירות את הסופרנטנט והושיע מחדש את התאים ב-1 מ"ל של DMEM/F12 + 10% FBS + אנטיביוטיקה. צנטריפוגה של התאים במשך 5 דקות ב 375 × גרם.</li>
</ol>2. עיבוד של תא stromal
הערה: סעיף זה מתאר את הפרוטוקולים הדרושים לבידוד התא הסטרומלי של רירית הרחם של העכבר. לאור העניין הגובר בניסויים בתרבית אפיתל/סטרומלית, חשוב להיות מסוגלים לעבד את אוכלוסיות התאים הסטרומליים בנוסף לתאי האפיתל שייצרו אורגנואידים.
<ol><li>לאחר שכל האפיתל הופרד באופן אנזימטי ומכני משברי הרחם, המבנים דמויי הצינור הנותרים הם התאים "הסטרומלים/מיומטריים". אסוף רקמה זו בקולגן של 2.5 מ"ג/מ"ל + 2 מ"ג/מ"ל DNase בתמיסת HBSS.</li>
	<li>דגרו את הדגימה הסטרומלית/מיומטרלית על שייקר בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.</li>
	<li>לאחר הדגירה, יש להוסיף 500 μL של DMEM/F12 + 10% FBS + אנטיביוטיקה לכל עכבר, ולסנן את השברים שאינם מנותקים דרך מסנן תאים של 40 מיקרומטר.</li>
	<li>גלולה את התאים על ידי צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 375 × גרם.</li>
	<li>הסר בזהירות את הסופרנטנט ושלח מחדש את גלולת התא ב-1 מ"ל של DMEM/F12 + 10% FBS + אנטיביוטיקה. הוסיפו את התערובת ל-10 מ"ל של DMEM/F12 + 10% FBS + אנטיביוטיקה בצלחת תרבית תאים בקוטר 10 ס"מ. לדגור את הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית תאים לחות.</li>
	<li>כדי ליצור תרביות משותפות של תאי אפיתל רירית הרחם של עכברים ותאי סטרומל, בצע את השיטות המתוארות עבור אורגנואידים אנושיים של רירית הרחם באמצעות מערכות נטולות פיגומים או מטריצת קולגן 6,8. הערה: בעוד שטכניקות אלה טרם פורסמו עבור עכברים, ניתן להתאים אותן על סמך הפרוטוקולים שפורסמו עם רירית הרחם האנושית.</li>
</ol>3. אנקפסולציה של אפיתל הרחם לתוך מטריצת ג'ל כדי ליצור אורגנואידים
הערה: יש לשמור את מטריצת הג'ל על קרח עד שהיא מוכנה לשימוש.
<ol><li>הסר את הסופר-נאטנט ושלח מחדש את כדור התא בנפח של מטריצת ג'ל שהוא פי 20 מזה של כדור התא (כלומר, אם כדור התא הוא 20 μL, להשעות את התאים עם 400 μL של מטריצת ג'ל). יש להשעות את הכדור בזהירות כדי למנוע החדרת בועות.</li>
	<li>אפשרו למטריצת הג'ל/מתלה התא לשקוע בטמפרטורת החדר למשך ~10 דקות.</li>
	<li>ברגע שמטריצת הג'ל/תרחיף התא הופכת לג'ל מוצק למחצה, השתמש במיקרופיפט P200 עם קצה רחב של 200 μL כדי לשאוף בעדינות 25 μL של מטריצת הג'ל / תרחיף התא. יש לפזר שלוש כיפות נפרדות של 25 μL לכל באר של צלחת 12 בארות, ולאפשר למטריצת הג'ל לרפא במשך 15 דקות באינקובטור תרבית רקמה לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לאחר שמטריצת הג'ל נרפאה, הוסף 750 μL של מדיום אורגנואידי לכל באר המכילה כיפות מטריצת ג'ל. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס באינקובטור תרבית רקמה לחות. הערה: נוסחת המדיה האורגנואידית מצוינת בטבלת החומרים. אורגנואידים נוצרים בדרך כלל תוך 4 ימים מהתרבית הראשונית.</li>
</ol>4. ניתוח ביטוי גנים של אורגנואידים רירית הרחם לאחר טיפול באסטרדיול
הערה: סעיף זה מתאר את השיטות המשמשות לפרופיל ביטוי הגנים של אורגנואידים אפיתליאליים רירית הרחם באמצעות qPCR בזמן אמת לאחר טיפול באסטרדיול (E2; ראה טבלה 1). מכיוון שהאנדומטריום נמצא תחת שליטה מחזורית של הורמון השחלות E2, בדיקת ההיענות של האורגנואידים ל- E2 היא מדד חשוב לתפקוד הפיזיולוגי. השגנו RNA באיכות גבוהה ויצרנו מספיק mRNA כדי ליצור פרופיל של ביטוי גנים באמצעות qPCR ו/או ריצוף RNA מהאורגנואידים האפיתליאליים של רירית הרחם שלנו. חלק זה מתאר כיצד לאסוף אורגנואידים ולעבד אותם לניתוח במורד הזרם של ביטוי גנים. מדיום הטיפול שנבחר משקף את זה המשמש לטיפול בתאי רירית הרחם בתרבית. עם זאת, יש לציין כי אמצעי טיפול זה יכול להיות מותאם בהתאם, כפי שנעשה לטיפול של תרביות 3D רירית הרחם האנושית עם הורמונים 8,16,17.
<ol><li>תרבית את האורגנואידים רירית הרחם כמתואר לעיל.</li>
	<li>הסר את המדיום האורגנואידי והחלף אותו עם 750 μL של מדיום רעב ארבעה ימים לאחר הזריעה. לדגור לילה.</li>
	<li>למחרת בבוקר, הסר את מדיום הרעב. הוסף 750 μL של אמצעי טיפול המכיל את הרכב או 10 nM E2. דגירה במשך 48 שעות.</li>
	<li>המשך בבידוד RNA בהתאם לפרוטוקול של יצרן הערכה.</li>
</ol>5. ניתוח היסטולוגי של אורגנואידים רירית הרחם
הערה: הדמיית התכונות המורפולוגיות של אורגנואידים רירית הרחם היא קריטית להערכת ההשפעה התאית של גורמי גדילה, מניפולציות גנטיות או מעכבי מולקולות קטנות. חלק זה מתאר את הטכניקות המשמשות לתיקון, עיבוד והדמיה של אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם באמצעות כתמים היסטולוגיים וכתמים אימונופלואורסצנטיים של נוגדנים.
<ol><li>הכינו צינורות מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל המכילים 1 מ"ל של 4% פרפורמלדהיד ב-PBS אחד. מניחים אותם על קרח.</li>
	<li>שאפו את המדיום מהבארות של צלחת 12 הבאר המכילה את האורגנואידים.</li>
	<li>באמצעות קצה פיפטה של 1 מ"ל עם קצה חיתוך, העבר 500 μL של 4% paraformaldehyde לכל באר בעדינות לנתק את כיפות מטריצת ג'ל מתחתית הצלחת.</li>
	<li>שאפו בעדינות את כל כיפות מטריצת הג'ל לתוך קצה הפיפטה והעבירו לצינור המיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל.</li>
	<li>תקן את האורגנואידים על ידי הנחתם על מסובב ב 4 מעלות צלזיוס לילה.</li>
	<li>למחרת בבוקר, צנטריפוגה את הצינור ב 600 × גרם במשך 5 דקות כדי לזרוק את האורגנואידים. הסר בעדינות את תמיסת 4% paraformaldehyde עם פיפטה והשלכו. לשטוף את האורגנואידים 2x עם 70% אתנול.</li>
	<li>לאחר הכביסה האחרונה, הסר את כל מלבד 50-100 μL של אתנול מן הצינור. מניחים את הצינור בצד.</li>
	<li>מניחים צינור של ג'ל לעיבוד דגימות באמבט מים ובמיקרוגל למשך ~ 30 שניות כדי להמיס את הג'ל. ודא שג'ל עיבוד הדגימה אינו רותח על ידי ניטור עקביות הג'ל. הערה: לאחר שג'ל עיבוד הדגימה נמס, אך לא רותח חם, יש לעבוד במהירות כדי לעטוף את האורגנואידים.</li>
	<li>מעבירים מספיק ג'ל לעיבוד דגימות כדי לכסות את כל פני השטח של התבנית (כ-250 μL).</li>
	<li>בעוד ג'ל עיבוד הדגימה עדיין מותך, להעביר במהירות את 50 μL של 70% אתנול פתרון המכיל את האורגנואידים. ודא כי האורגנואידים שקועים או נדחפים לחלק התחתון של התבנית.</li>
	<li>מניחים את התבנית ההיסטולוגית על דלי קרח ומאפשרים לג'ל עיבוד הדגימה להתקרר ולהתמצק.</li>
	<li>לאחר שג'ל עיבוד הדגימה יבש לחלוטין, העבירו בזהירות את ריבוע ג'ל עיבוד הדגימה לשקית דגימה, תוך מעקב אחר המטוס שבו נמצאים האורגנואידים.</li>
	<li>מניחים את השקית בקלטת היסטולוגיה ומעבדים בשיטות סטנדרטיות המשמשות לקיבוע פורמלין והטמעת פרפין של רקמות18.</li>
	<li>לאחר קיבוע והטמעה בפרפין, חתך למקטעים של 5 מיקרומטר באמצעות מיקרוטום19. המשך עם הליכי צביעה סטנדרטיים של המטוקסילין ואאוזין (H&E) או אימונוסטינינג, כמפורט להלן.</li>
</ol>6. המטוקסילין וכתמי אאוסין
<ol><li>Deparaffinize את הסעיפים כדלקמן: קסילן, 2 x 10 דקות; 100% אתנול, 2 x 3 דקות; 80% אתנול, 3 דקות; 60% אתנול, 3 דקות; dH 2 O,2x 3 דקות; 1 דקות בהמטוקסילין; מי ברז (3 x 5 שניות); דקה אחת באוסין.</li>
	<li>לייבש את החלקים כדלקמן: 60% אתנול, 3 דקות; 80% אתנול, 3 דקות; 95% אתנול, 3 דקות; 100% אתנול, 2 x 3 דקות; קסילן, 2 x 15 דקות</li>
	<li>הרכב באמצעות מדיום הרכבה.</li>
</ol>7. מכתים אימונופלואורסצנטיים
<ol><li>לפרק את הסעיפים כמתואר בשלב 6.1.</li>
	<li>ביצוע שליפת אנטיגן<ol><li>טבלו את השקופיות בתמיסת אחזור אנטיגן במיכל בטוח לשימוש במיקרוגל.</li>
		<li>יש לחמם במיקרוגל בחום גבוה למשך 20 דקות, תוך שימוש במרווחים של 5 דקות כדי להבטיח שהתמיסה לא תרתח.</li>
	</ol></li>
	<li>לאחר השלמת שלב אחזור האנטיגן בן 20 הדקות, אפשרו למגלשות להתקרר על הקרח למשך 40 דקות ועדיין שקועות במאגר שליפת אנטיגן.</li>
	<li>שטפו את השקופיות עם 1x TBST למשך 3 דקות</li>
	<li>חסום את השקופיות על ידי דגירה ב-3% BSA ב-TBST למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה ראשונית של נוגדנים<ol><li>לדלל את הנוגדן ב-3% BSA ב-TBST (1:50-1:1,000, תלוי ב-Ab).</li>
		<li>לדגור לילה ב 4 מעלות צלזיוס בחדר לחות.</li>
		<li>לשטוף 3 x 5 דקות עם TBST.</li>
	</ol></li>
	<li>דגירה משנית של נוגדנים<ol><li>יש לדלל את הנוגדן ב-3% BSA (ב-TBST) (1:250), או ב-5% סרום חמור רגיל.</li>
		<li>דגירה במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר (RT) בחושך, שכן הנוגדן מצומד לפלואורופור.</li>
	</ol></li>
	<li>צביעה גרעינית<ol><li>דילול 4′,6-דיאמידינו-2-פנילינדול (DAPI) 1:1,000 ב-TBST.</li>
		<li>דגירה במשך 5 דקות ב- RT.</li>
		<li>לשטוף 2 x 5 דקות עם TBST.</li>
	</ol></li>
	<li>הרכבה<ol><li>השתמש בטיפה אחת של מדיום הרכבה כדי להרכיב את הכיסוי.</li>
		<li>יש לאטום את הכיסוי באמצעות לק למחרת.</li>
	</ol></li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

במאמר זה נתאר שיטות ליצירת אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם מרירית הרחם של עכברים ואת הפרוטוקולים המשמשים באופן שגרתי לניתוח שלהם במורד הזרם. אורגנואידים רירית הרחם הם כלי רב עוצמה לחקר המנגנונים השולטים במחלות הקשורות לרירית הרחם, כגון אנדומטריוזיס, סרטן רירית הרחם וכשל בהשתלה. מחקרים פורצי דרך שפורסמו בשנת 2017 דיווחו על התנאים לתרבית תרביות ארוכות טווח ומתחדשות של אורגנואידים רירית הרחם מאפיתל עכברים ואנושיים 4,5. למרות שאורגנואידים היו בשימוש נרחב לחקר מ...

רירית הרחם - רקמת הרירית הפנימית של חלל הרחם - היא רקמה ייחודית ודינמית מאוד הממלאת תפקידים קריטיים בבריאות הרבייה של האישה. במהלך חיי הרבייה, רירית הרחם טומנת בחובה פוטנציאל לעבור מאות מחזורים של התפשטות, התמיינות ופירוק, המתואמים על ידי הפעולה המרוכזת של הורמוני השחלות - אסטרוגן ופרוגסטרון. מחקרים על עכברים מהונדסים גנטית חשפו מנגנונים ביולוגיים בסיסיים העומדים בבסיס תגובת רירית הרחם להורמונים ובקרה על השתלת עוברים, דצידואליזציה של תאים סטרומליים והריון1. עם זאת, מחקרים במבחנה היו מוגבלים בשל קשיים בשמירה על רקמות רירית הרחם העיקריות של עכברים שלא עברו טרנספורמציה בתרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות 2,3. ההתקדמות האחרונה בתרבית של רקמות רירית הרחם כמערכות איברים תלת-ממדיות, או אורגנואידים, מהווה הזדמנות חדשה לחקור מסלולים ביולוגיים השולטים בהתחדשות והתמיינות תאי רירית הרחם. מערכות אורגנואידיות של רירית הרחם של עכברים ובני אדם פותחו מאפיתל רירית הרחם טהור עטוף במטריצות שונות4,5, בעוד רירית הרחם האנושית תורבית כתרביות אפיתל/סטרומליות ללא פיגומים6,7, ולאחרונה כמכלולי אפיתל/סטרומלים ללא קולגן8 . פוטנציאל הצמיחה וההתחדשות של תרביות אפיתל אורגנואידיות נתמך על ידי קוקטייל מוגדר של גורמי גדילה ומעכבי מולקולות קטנות שנקבעו אמפירית כדי למקסם את הצמיחה וההתחדשות של האורגנואידים 4,5,9. יתר על כן, היכולת להקפיא ולהפשיר אורגנואידים של רירית הרחם מאפשרת בנקאות ארוכת טווח של אורגנואידים רירית הרחם מעכברים ובני אדם למחקרים עתידיים.
עכברים מהונדסים גנטית חשפו את מסלולי האיתות המורכבים השולטים בתחילת ההריון ובדצידוליזציה, ושימשו כמודלים של אובדן הריון, סרטן רירית הרחם ואנדומטריוזיס. מחקרים גנטיים אלה הושגו במידה רבה עם מחיקה ספציפית לתאים של אללים מסוג loxP ("floxed") באמצעות רקומבינאזות cre הפעילים במיוחד ברקמות הרבייה הנשיות. מודלים אלה של עכברים כוללים את קולטן הפרוגסטרון-cre10 הנמצא בשימוש נרחב, בעל פעילות רקומבינאז חזקה ברקמות אפיתל רירית הרחם והסטרומלית, לקטופרין i-cre, הגורם לרקומבינציית אפיתל רירית הרחם בעכברים בוגרים 11, או Wnt7a-cre, המעורר מחיקה ספציפית לאפיתל ברקמות שמקורן במולריאן12 . גידול רקמות רירית הרחם ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית כאורגנואידים תלת-ממדיים סיפק הזדמנות מצוינת לחקור את הביולוגיה של רירית הרחם ולהקל על זיהוי גורמי גדילה ומסלולי איתות השולטים בחידוש תאי רירית הרחם ובהתמיינות13,14. שיטות לבידוד ותרבית של רקמת רירית הרחם של העכבר מתוארות בספרות ומדווחות על שימוש באסטרטגיות אנזימטיות שונות לבידוד אפיתל הרחם להתרבות הבאה של אורגנואידים אפיתל רירית הרחם4. בעוד שספרות קודמת מספקת מסגרת קריטית לפרוטוקולים של תרביות אפיתל רירית הרחם 4,5,6, מאמר זה מספק שיטה ברורה ומקיפה ליצירה, שמירה, עיבוד וניתוח של אורגנואידים אלה. סטנדרטיזציה של טכניקות אלה חשובה להאצת ההתקדמות בתחום הביולוגיה של הרבייה של נשים. כאן אנו מדווחים על מתודולוגיה מפורטת לטיהור אנזימטי ומכני של רקמת אפיתל רירית הרחם של עכבר עבור התרבית הבאה של אורגנואידים רירית הרחם בפיגום מטריצת ג'ל. אנו מתארים גם את המתודולוגיות לניתוחים היסטולוגיים ומולקולריים במורד הזרם של אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם של עכבר עטוף במטריצת ג'ל.

<table><tbody><tr><td><חזק>ניסוח מדיה אורגנואידית</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק></td><td><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>ריכוז סופי</חזק></td></tr><tr><td>קורנינג גורם גדילה מופחת (GFR) מטריג'ל מטריג'ל מטריצת ממברנת בסיס, *קורנינג ללא LDEV</td><td></td><td>354230</td><td>100%</td></tr><tr><td>טריפסין מלבלב בקר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>T1426-1G</td><td>1%</td></tr> <tr><td>מתקדם DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>12634010</td><td>תוסף 1X</td></tr><tr><td>N2 Life</td><td>Technologies</td><td>17502048</td><td>1X</td></tr><tr><td>B-27 ומסחר; תוסף תזונה (50X), מינוס ויטמין A</td><td>Life Technologies</td><td>12587010</td><td>1X</td></tr><tr><td>פרימוצין</td><td>Invivogen</td><td>ant-pm-1</td><td>100 ומיקרו; גרם/מ"ל</td></tr><tr><td>N-אצטיל-L-ציסטאין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>A9165-5G</td><td>1.25 מ"מ</td></tr><tr><td>L-גלוטמין</td><td>Life Technologies</td><td>25030024</td><td>2 מ"מ</td></tr><tr><td>ניקוטינאמיד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>N0636-100G</td><td>10 ננומטר</td></tr><tr><td>ALK-4, -5, מעכב -7, A83-01</td><td>Tocris</td><td>2939</td><td>500 ננומטר</td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי EGF</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-15</td><td>50 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי Noggin</td><td>Peprotech</td><td>120-10C</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי Rspondin-1</td><td>Peprotech</td><td>120-38</td><td>500 ng/mL</td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי FGF-10</td><td>Peprotech</td><td>100-26</td><td>100 ng/mL</td></tr><tr><td>רקומביננטי אנושי HGF</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td>50 ng/mL</td></tr><tr><td>WNT3a</td><td>R& D systems</td><td>5036-WN</td><td>200 ננוגרם/מ"ל</td></tr><tr><td><חזק>אספקה וריאגנטים אחרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td><חזק>שם</חזק></td><td><חזק>חברה</חזק</td><td>><חזק>מספר קטלוגי</חזק></td><td><חזק>ריכוז סופי</חזק></td></tr><tr><td>קולגנאז מ-Clostridium histolyticum</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C0130-1G</td><td>5 מ"ג/ מ"ל</td></tr><tr><td>דאוקסיריבונוקלאז I מלבלב בקר</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>DN25-100 מ"ג</td><td>2 מ"ג/מ"ל</td></tr><tr><td>DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>ThermoFisher</td><td>14190-250</td><td>1X</td></tr><tr><td>HBSS, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>ThermoFisher</td><td>14170112</td><td>1X</td></tr><tr><td>Falcon&nbsp; מיקרופלטות פוליסטירן (24-Well)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>#08-772-51</td><td></td></tr><tr><td>פלקון&nbsp; מיקרופלטות פוליסטירן (12 בארות)</td><td>Fisher Scientific</td><td>#0877229</td><td></td></tr><tr><td>מסנני תאי פלקון, 40 ומיקרו; m</td><td>פישר סיינטיפיק</td> <td>#08-771-1</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA MiniPrep (50 ומיקרו; ז)</td> <td>Genesee Scientific</td><td>11-331</td><td></td></tr><tr><td>טריזול ריאגנט</td><td>Invitrogen</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES, ללא פנול אדום</td><td>ThermoFisher</td><td>11039021</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, סיגמא</td><td>אולדריץ'</td><td>F6765-500 מ"ל</td><td>2%</td></tr> <tr><td>אסטראטיול (E2)</td> <td>סיגמא אולדריץ'</td><td>E1024-1G</td><td>10 ננומטר</td></tr><tr><td>פורמלדהיד 16% במימי פתרון, EM כיתה</td><td>VWR</td><td>15710</td><td>4%</td></tr> <tr><td>קלטת Epredia 1 קלטות רקמות מחוררות</td><td>Fisher Scientific</td><td>1000961</td><td></td></tr><tr><td>Epredia תבניות בסיס הטמעת נירוסטה</td><td>Fisher Scientific</td><td>64-010-15&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>אתנול, 200 הוכחה (100%)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-032-601&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Histoclear</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-899-90147</td><td></td></tr><tr><td>Permount הרכבה בינונית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>50-277-97</td><td></td></tr><tr><td>שקיות ביופסיה ניילון Epredia Fisher</td><td>Scientific</td><td>6774010</td><td></td></tr><tr><td>ג'ל לעיבוד דגימת HistoGel</td><td>VWR</td><td>83009-992</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת המטוקסילין פרימיום</td><td>VWR</td><td>95057-844</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת Eosin Y (צהבהבה) Premium</td><td>VWR</td><td>95057-848</td><td></td></tr><tr><td>TBS Buffer, 20X, pH 7.4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8054</td><td>1X</td></tr><tr><td>TBST (10X), pH 7.4</td><td>GenDEPORT</td><td>T8056</td><td>1X</td></tr><tr><td>חומצת לימון&nbsp;</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C0759-1KG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט טריבייס דיהידראט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S4641-500G</td><td></td></tr><tr><td>Tween20</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP337-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A2153-100G</td><td>3%</td></tr> <tr><td>DAPI Solution (1 מ"ג/מ"ל)ThermoFisher</td><td></td> <td>62248</td><td>1:1000 דילול</td></tr><tr><td>VECTASHIELD Antifade הרכבה בינוני</td><td>וקטור מעבדות</td><td>H-1000-10</td><td></td></tr><tr><td>לק שקוף</td><td>פישר מדעי</td><td>NC1849418</td><td></td></tr><tr><td>פישרברנד סופרפרוסט פלוס מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר Scientific</td><td>22037246</td><td></td></tr><tr><td>משקפי מיקרו כיסוי</td><td>VWR</td><td>VWR 48393-106</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript VILO Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>11755050</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher</td><td>4364346</td><td></td></tr><tr><td>Krt8 נוגדן (TROMA-I)&nbsp;</td><td>DSHB</td><td>TROMA-I&nbsp;</td><td>דילול 1:50</td></tr><tr><td>Vimentin Antobody</td><td>Cell Signaling</td><td>5741S</td><td>1:200 דילול</td></tr><tr><td>חמור נגד חולדה IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor 594</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21209</td><td>1:250 דילול</td></tr><tr><td>חמור אנטי Rabbin IgG (H+L) נוגדן משני נספג מאוד, Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher</td><td>A-21206</td><td>דילול 1:250</td></tr><tr><td>ZEISS Stemi 508 סטריאו מיקרוסקופ</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZEISS Axio Vert.A1 מיקרוסקופ שגרתי הפוך עם מצלמה דיגיטלית</td><td>ZEISS</td><td></td><td></td></tr><<tr><td>strong>Primer Sequence</strong</td><td>>Forward (5'-3')</td><td>הפוך (5'-3')</td><td>_</td></tr><tr><td>Lipocalin 2 (Lcn2)</td><td>GCAGGTGGGTGTTGTGGG</td><td>CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC</td><td></td></tr><tr><td>לקטופרין (Ltf)</td><td>TGAGGCCCTTGGACTCTGTGT</td><td>ACCCACTTTCTCTCTCTCGTTC</td><td></td></tr><tr><td>פרוגסטרון (Pgr)</td><td>CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC</td><td>TAACTTCAGACATTTCCGG</td><td></td></tr><tr><td>גליצרלדהיד 3 פוספט דהידרוגנאז (Gapdh)</td><td>CAATGTGTCCGTCGTCGTGGATCT</td><td>GCCTGCTTCACCACCCTCTT</td><td></td></tr></tbody></table>

הקמת אורגנואידים 3d רירית הרחם מרחם העכבר

Establishing 3D Endometrial Organoids from the Mouse Uterus

רקמת רירית הרחם מסדרת את החלל הפנימי של הרחם ונמצאת תחת שליטה מחזורית של אסטרוגן ופרוגסטרון. זוהי רקמה המורכבת מאפיתל לומינלי ובלוטתי, תא סטרומלי, רשת כלי דם ואוכלוסיית תאי חיסון מורכבת. מודלים של עכברים היו כלי רב עוצמה לחקר רירית הרחם, וחשפו מנגנונים קריטיים השולטים בהשתלה, בהשליה ובסרטן. הפיתוח האחרון של תרביות אורגנואידיות רירית הרחם התלת-ממדיות מציג מודל חדשני לניתוח מסלולי האיתות העומדים בבסיס הביולוגיה של רירית הרחם. ביסוס אורגנואידים של רירית הרחם ממודלים של עכברים מהונדסים גנטית, ניתוח התמלילים שלהם והדמיה של המורפולוגיה שלהם ברזולוציה של תא בודד הם כלים חיוניים לחקר מחלות רירית הרחם. מאמר זה מתווה שיטות לביסוס תרביות תלת-ממדיות של אפיתל רירית הרחם מעכברים ומתאר טכניקות לכימות ביטוי גנים ולניתוח ההיסטולוגיה של האורגנואידים. המטרה היא לספק משאב שניתן להשתמש בו כדי לבסס, לתרבת ולחקור את ביטוי הגנים והמאפיינים המורפולוגיים של אורגנואידים אפיתליאליים רירית הרחם.

תמונות ניגודיות פאזה של אורגנואידים רירית הרחם של עכבר יצרנו אורגנואידים מאפיתל רירית הרחם של עכבר WT, כפי שמתואר בפרוטוקול המצורף (ראו תרשים באיור 1). בעקבות דיסוציאציה אנזימטית של אפיתל רירית הרחם של העכבר, יריעות האפיתל הופרדו מכנית מהתאים הסטרומליים של הרחם ונותקו עוד יותר עם קולגן כדי ליצור תרחיף חד-תאי. אם היא מבוצעת נכון, שיטה זו של הפרדת תאים אפיתל וסטרומלי אמורה להניב דגימות עם זיהום של לא יותר מ-10%-15% מסוג התא ההפוך (ראו תמונות אימונופלואורסצנציה <strong class...

פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיות לביסוס אורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם של עכברים לביטוי גנים וניתוחים היסטולוגיים.

הקמת אורגנואידים 3D רירית הרחם מרחם העכבר

Endometrial tissue lines the inner cavity of the uterus and is under the cyclical control of estrogen and progesterone. It is a tissue that is composed of ...

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מראה מתודולוגיה שלב אחר שלב לבידוד אפיתל הרחם הטהור ביותר מרחם העכבר לתרבית של אורגנואידים רירית הרחם. שיטה זו משתמשת ביעילות בדיסוציאציה אנזימטית ומכנית כדי לבודד אפיתל הרחם. הטכניקות יועלו כדי לבסס, לטפל ולנתח אורגנואידים אפיתל רירית הרחם שמקורם באפיתל המבודד.יש להתחיל בהפשרת מטריצת הג'ל על הקרח למשך כשעה עד שעתיים לפני השימוש. לאחר מכן נתחו את העכבר המומת על ידי ביצוע חתך בקו האמצע על הבטן באמצעות מספריים, וקילוף עדין של העור לאחור כדי לחשוף את שכבת הצפק שמתחת. אתר את קרני הרחם על ידי הזזה עדינה של כריות שומן הבטן הצידה והחזק את קרני הרחם בצומת צוואר הרחם לפני חיתוך אותם לאורך השומן המזנטרי.לאחר כריתה של רחם העכבר, להסיר ביסודיות רקמת שומן מן קרן הרחם עם מספריים קטנים. לאחר הסיום, חותכים כל קרן רחם לשברים קטנים, שכל אחד מהם מודד כארבעה עד חמישה מילימטרים. מניחים את כל שברי הרחם מרחם אחד לבאר אחת מתוך צלחת 24 באר המכילה 0.5 מיליליטר של 1% טריפסין.לאחר מכן דגרו את צלחת 24 הבאר באינקובטור תרבית רקמה לח של 37 מעלות צלזיוס למשך כשעה להפרדה אנזימטית של אפיתל רירית הרחם מהסטרומה שמתחת. לאחר הדגירה, מעבירים את שברי הרחם לצלחת תרבית רקמה של 35 מילימטר המכילה מיליליטר אחד של תמיסת אגירת פוספט של דולבקו או DPBS. לאחר מכן, הפרד את אפיתל הרחם מצינור הרחם תחת מיקרוסקופ דיסקציה על ידי החזקת קצה אחד של שבר הרחם עם המלקחיים והפעלת קצה הפיפטה בעדינות לאורך השבר, סחיטת האפיתל מהקצה השני של צינור הרחם.לאחר מכן התבונן ביריעות האפיתל המופרדות מקטע הרחם תחת מיקרוסקופ הנתיחה. לאחר מכן, בעדינות להעביר את כל יריעות אפיתל לתוך אותו צינור 1.5 מיליליטר באמצעות פיפטה מיליליטר אחד. ו גלולה את יריעות אפיתל מנותקות על ידי צנטריפוגה ב 375 x גרם במשך חמש דקות.הסר בזהירות את הסופרנטנט מבלי להפריע לכדור התא והשהה את כדור התא ב-0.5 מיליליטר של 2.5 מיליגרם למיליליטר קולגן ועוד שני מיליגרם למיליליטר של תמיסת DNA. פיפטה למעלה ולמטה כ-10 פעמים או עד להשגת השעיה של תא בודד. לאחר מכן, הוסיפו 0.5 מיליליטר של DMEM F/12 בתוספת 10% סרום בקר עוברי או FBS בתוספת אנטיביוטיקה וצנטריפוגה של התאים במשך חמש דקות ב-375 x גרם.הסר את הסופר-נטנט, השהה את התאים במיליליטר אחד DMEM/F12 בתוספת 10% FBS בתוספת אנטיביוטיקה וצנטריפוגה של התאים. מניחים את מטריצת הג'ל על קרח עד שהיא מוכנה. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט מתאי הצנטריפוגה והשעה מחדש את גלולת התא תוך שימוש בנפח של פי 20 מנפח מטריצת הג'ל מבלי להציג את הבועות.אפשרו לתרחיף תא המטריצה של הג'ל לשקוע בטמפרטורת החדר למשך כ-10 דקות. ברגע שתרחיף תא מטריצת הג'ל הופך לג'ל מוצק למחצה, השתמש במיקרופיפט P200 עם קצה רחב של 200 מיקרוליטר ושאף בעדינות 25 מיקרוליטר של תרחיף תא מטריצת הג'ל. יש לחלק שלוש כיפות נפרדות של 25 מיקרוליטר לכל באר של צלחת 12 באר ולאפשר למטריצת הג'ל לרפא במשך 15 דקות ואינקובטור תרבית רקמה לחות של 37 מעלות צלזיוס.לאחר שמטריצת הג'ל נרפאת, הוסיפו 750 מיקרוליטרים של מדיום אורגנואידי לכל באר המכילה כיפת מטריצת ג'ל, ואינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בחממה של תרבית רקמה לחה. תמונות ניגודיות פאזה של אורגנואידים של רירית הרחם של עכברים הראו כי הפרדת התאים האפיתל והסטרומליים הניבה דגימות עם לא יותר מ-10% עד 15% זיהום של סוג התא הנגדי. תאי אפיתל רירית הרחם הורכבו לאורגנואידים תוך שלושה עד ארבעה ימים.האורגנואידים הקבועים של פורמלין פרפין משובצים בחתך הודגמו על ידי כתמי המטוקסילין ואאוזין, שהציגו את השכבה היחידה של אפיתל ומרכזים חלולים, הלומן של האורגנואידים. הדמיית המיקרוסקופ הפלואורסצנטי הראתה כי כל התאים באורגנואידים היו ציטוקרטין 8-חיובי והכילו DAPI, מה שמצביע על כך שקיבוע, הטבעה ועיבוד של האורגנואידים רירית הרחם תואמים לאימונוסטינינג מבוסס נוגדנים. ה-PCR הכמותי בזמן אמת הראה כי הגירוי עם 10 אסטרדיול ננומולרי הגביר את הביטוי של ליפוקלין 2, לקטופרין וקולטן פרוגסטרון באורגנואידים האפיתליים, מה שמצביע על כך שניתן להשתמש בהצלחה באורגנואידים אפיתליאליים של רירית הרחם כדי למדוד את השינויים בביטוי הגנים בתגובה לאסטרדיול.חשוב לוודא כי הפרדה ברורה של אפיתל רירית הרחם מתקבלת במהלך שלב הדיסוציאציה המכנית. יש להיות מסוגלים להתבונן באפיתל היוצא מצינור הרחם. שיטות אחרות כוללות הקמת אורגנואידים אפיתל על ידי אנקפסולציה לתוך מטריצת ג'ל.אם תרצה, ניתן לעכל עוד יותר את התא הסטרומלי כדי ליצור תרביות שיתוף סטרומליות אפיתל תלת-ממדיות. השיטה יכולה לעזור לענות על שאלות על האותות השולטים בחידוש רירית הרחם. זה יכול לעזור לטפל במחלות אצל נשים, כגון אנדומטריוזיס, אובדן הריון וסרטן.

establishing-3d-endometrial-organoids-from-the-mouse-uterus

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

תיאור אינדוקציה הניתוח של אנדומטריוזיס בעכברים וחולדות על ידי השתלת אוטומטית של רקמת הרחם אל מפל העורקים של mesentery המעי.

עכבר דגם של אנדומטריוזיס בניתוח המושרה על ידי השתלת אוטומטי של רקמות הרחם

פרוטוקול להפקת האנושי הראשי אורגנואידים רירית הרחם המורכבים של תאים אפיתל וסטרומה ולשמור מאפיינים של רקמת רירית הרחם היליד מוצג. פרוטוקול זה מתאר שיטות מרכישת רקמת הרחם לעיבוד היסטולוגית של אורגנואידים רירית הרחם.

הדור של אורגנואידים האדם העיקרי של רירית הרחם

מודלים מכרסמים רבים של אנדומטריוזיס מוגבלים על ידי מורכבות טכנית, רבייה, ו / או צורך בעלי חיים immunocompromised או עכברי כתב מיוחד. אנו מציגים מערכת פשוטה של אינדוקציה נגע באמצעות כל עכבר ניסיוני עם מערכת ניקוד אובייקטיבית הניתנת לאימות עצמאי וללא דרישה לכריתת שחלות או ניתוח הישרדות.

מודל מורין סינגני של אנדומטריוזיס באמצעות עכברי רכיבה טבעיים

מחקר זה מציג מודל עכבר חדש שתוכנן במיוחד כדי לדמות אנדומטריומה, תת-סוג משמעותי קלינית של אנדומטריוזיס. על ידי שימוש בעכברי C57BL/6J, המודל שואף להבהיר את המנגנונים הפתופיזיולוגיים העומדים בבסיס אי פוריות הקשורה לאנדומטריומה, ומציע כלי מעודן לגשר על פער הידע הנוכחי ברפואת הרבייה.

הקמת מודל עכברי ניסיוני של אנדומטריומה כדי לחקור את אי הפוריות הקשורה אליה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד ותרבית תאי גזע אפיתל רירית הרחם של חולדות (reESCs), המייצרים אורגנואידים של רירית הרחם של חולדות. שיטה זו מקלה על מחקרי מבחנה של מחלות רירית הרחם, ומאפשרת עריכת גנים ומניפולציות תאיות אחרות.

יצירה ואפיון של אורגנואידים ברחם חולדה מתאי גזע אפיתל רירית הרחם של חולדות

מאמר זה מתאר פרוטוקול מפורט לייצור רירית רחם דקה אמינה וניתנת לשחזור עם שיעור תמותה נמוך מאוד והידבקויות תוך רחמיות מינימליות על ידי הזרקת 95% אתנול לרחם העכבר תוך 1-3 דקות.

הקמת מודל עכבר של רירית רחם דקה

פרוטוקול זה מפרט את הפיתוח של מודלים של עכברים בדרגה גבוהה של קרצינומה שחלות סרוזית (HGSOC) במבחנה וב-vivo. מגזירת אורגנואידים של חצוצרות עכברים, השינוי הגנטי שלהם לסיכום גנטיקה של HGSOC אנושי, והחדרתם לבורסה השחלתית של עכברים סינגניים להתפתחות גידולים in vivo .

פיתוח קווי אורגנואידים שמקורם בעכבר מתאי אפיתל חצוצרות למידול קרצינומה של שחלות סרוזיות בדרגה גבוהה

פרוטוקול זה מתאר שיטה מוגדרת מבוססת הידרוג'ל ליצירת אורגנואידים של שד אנושי המשקפים תכונות מרכזיות של מורפוגנזה של השד במערכת תרבית תלת-ממדית מבוקרת.

שיטה מוגדרת מבוססת הידרוג'ל ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים של שד אנושי המשחזרים מורפוגנזה של השד

הזרקת Intravitreous היא טכניקה בשימוש נרחב במחקר מדעי חזותיים מחלות עיניים או כיישום ישירה של טיפול מקומי. סרט הווידאו הזה הוכיח פרוטוקול להזרקה intravitreous שימוש במזרק 1ml עם כוס פיפטה. טיפים שימושיים לגבי מניעת דימום מסיבי נזק העדשה מקבלים.

הזרקת Intravitreous להקמת Ocular דגם מחלות

מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור בידוד ותחזוקה של תרבויות פיברובלסטים העיקרי של העור, רקמת הריאות של מכרסמים בר.

הקמת ראשיים פיברובלסטים תרבויות למבוגרים מאת מכרסמים

למד שיטה לבידוד אפיתל רחמי טהור מרחם העכבר באמצעות פירוק אנזימטי ומכני ליצירת אורגנואידים תלת־ממדיים. השיטה מאפשרת חקר מנגנוני התחדשות רירית הרחם ומחלות כגון אנדומטריוזיס וסרטן.

הקמת אורגנואידים 3D רירית הרחם מרחם העכבר

גלה סרטונים נוספים