Name: הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-13T14:50:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: למדו להעריך את שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר באמצעות הדמיה חיה וחישוף אימונופלואורסצנטי. שלוש שיטות מקיפות מאפשרות לחקור מנגנוני הפרדת כרומוזומים ואנאופלואידיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המימון לפרויקט זה ניתן על ידי המכונים הלאומיים לבריאות (R35GM136340 ל-KS).

כל העכברים ששימשו בפרוטוקולים אלה שוכנו וגודלו על פי הוועדה המוסדית לשימוש וטיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת ראטגרס (פרוטוקול 201702497) והנחיות המכונים הלאומיים לבריאות. גופים רגולטוריים אלה אישרו את כל הליכי הניסויים הכוללים ניסויים בבעלי חיים. כל העכברים ששימשו במחקר הנוכחי היו נקבות CF-1 בנות 6-8 שבועות.
1. הכנה ניסיונית
<ol><li>לפני תחילת הערכות SAC, אספו ביציות עכבר בעקבות דוח12 שפורסם בעבר. חלקו את הביציות שנאספו לשלוש קבוצות בגודל שווה ושמרו אותן בתרבית Chatot, Ziomek ו-Bavister (CZB) המכילות 2.5 מיקרומטר מילינון (ראו טבלת חומרים) כדי למנוע חידוש מיוטי13. הערה: הרכב CZB: 81.6 mM NaCL; 4.8 mM KCl; 1.2 mM KH2PO4; 1.2 mM MgSO4-7H 2O; 0.27 מ"מ פירובט; 1.7 mM CaCl2; 30.8 mM DL-חומצה לקטית; 7 מ"מ טאורין; 0.1 מ"מ EDTA; 25 mM NaHCO3; גנטמיצין; ו-0.3% BSA.</li>
	<li>הכינו את ה-cRNA למיקרו-הזרקה כפי שתואר קודם לכן12,14. הגבירו את הגן Securin של העכבר מה-cDNA המשובט מביציות שלפוחית נבט של עכברים, ולאחר מכן תת-שיבוט לווקטור pMDL2 המכיל רצף Gfp15,16.<ol><li>כדי להכין Securin-Gfp cRNA, ליניארי את פלסמיד עם עיכול Nde I. בצע שעתוק חוץ גופי באמצעות T3 RNA פולימראז וטיהור cRNA16. הערה: יש לאחסן cRNA באליציטוטים של 2-3 μL בטמפרטורה של -80°C עד לשימוש.</li>
	</ol></li>
</ol>2. טיפול Nocodazole והדמיה חיה
<ol><li>הכן 1 מ"ל של מדיה תרבותית (CZB) המכילה 5 מיקרומטר nocodazole (NOC), 1 מ"ל של מדיה תרבותית עם 5 μM של NOC בתוספת 0.5 μM reversine (NOC + REV), ו 1 מ"ל של מדיה תרבית עם Dimethyl sulfoxide (DMSO) (1:2000) כבקרה (ראה טבלה של חומרים).</li>
	<li>להבשלת ביציות והדמיה חיה, יש להשתמש בצלחת 96 בארות שחוממה מראש באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, 5%CO2 ו-80% לחות. בבאר הראשונה, עומס 150 μL של טיפול DMSO בקרה; בבאר השנייה, עומס 150 μL של טיפול NOC; ובבאר השלישית, עומס 150 μL של טיפול NOC + REV. שומרים את הצלחת באינקובטור באותם תנאים כנ"ל עד לצורך. הערה: בלוח של 96 בארות, הימנע משימוש בשורה הראשונה ובעמודה הראשונה מכיוון שצל הגבול מפריע לאיכות התמונות.</li>
	<li>כדי להתחיל התבגרות מיוטית, להסיר milrinone. תוך כדי צפייה בביציות תחת סטריאומיקרוסקופ באמצעות הגדלה בין 30x-64x, שטפו את המילרינון מהמדיה על ידי העברה רציפה של הביציות דרך שש טיפות של 100 μL של מדיה תרבית נטולת מילרינון המכילה DMSO והניחו אותן בבאר המתאימה של צלחת 96 הבארות באמצעות פיפטה המופעלת ביד או בפה.<ol><li>ספרו ביציות על ידי הרמתן באמצעות פיפטה המופעלת ביד או בפה והעברתן לטיפה הבאה כדי להימנע מאיבודן. הביציות הן יחידות, גדולות (~ 80 מיקרומטר קוטר), ותאים עגולים. הגרעין ייראה כמו כפתור במרכז התא, והקרום והזונה פלוצ'ידה מקיפים את הביצית. הערה: העבירו את הביציות בין טיפות תוך כדי הזזת כמות קטנה ככל האפשר של נוזלים. זה מאפשר הסרה אופטימלית של המילרינון מאמצעי התקשורת. אם הביציות לא מצליחות לחדש את המיוזה, סביר להניח שהמילרינון לא הוסר ביעילות.</li>
	</ol></li>
	<li>חזור על אותו תהליך (שלב 2.3) לטיפול NOC ו- NOC + REV.</li>
	<li>דמיינו את הביציות באמצעות מיקרוסקופ ברייטפילד המצויד בתא אינקובטור עם סביבה מבוקרת בתנאים הבאים: 37°C, 5%CO2 ו-80% לחות. צלם תמונות במישור האמצעי של הביציות במרווחים של 20 דקות במשך 24 שעות.</li>
	<li>כמת את מספר הביציות שפולטות גוף קוטבי (PB) על ידי זיהוי התאים שעוברים ציטוקינזיס אסימטרי. התוצאה תהיה תא קטן (PB) ליד הביצית ובתוך הזונה פלוצ'ידה המשותפת. הצג את התמונות באמצעות תוכנת הדמיה (ImageJ, ראה רשימת חומרים).</li>
	<li>ייבאו רצף תמונות לתוכנת ניתוח התמונה וקדמו את המסגרות עד שתא אחד או יותר יעבור ציטוקינזיס אסימטרי. חישוב אחוז הביציות הפולטות PB מסך הביציות17.</li>
</ol>3. מעקב אחר דפוס התפרקות Securin-gfp במהלך הבשלה מיוטית
<ol><li>צנטריפוגה 3 μL של Securin-Gfp cRNA (שלב 1.2) ב 19,283 x גרם במשך 30 דקות ב 4 ° C18. הערה: השתמש בסופרנאטנט כדי למנוע העמסת זיהומים שעלולים לגרום לחסימת מחטים במהלך מיקרו-הזרקה.</li>
	<li>בצע שלב אחר שלב מיקרו-הזרקת ביציות, המתוארת בהרחבה בהפניה12. מיקרו-הזרקת ביציות שלב I עם 100 ng/μL של Securin-gfp cRNA מוכן בשלב 1.2.</li>
	<li>לאחר מיקרו-הזרקה, לאפשר לביציות להתאושש ולתרגם את הרנ"א באינקובטור CO2 למשך 3 שעות לפחות. בדוק את הביטוי על ידי התבוננות בביציות במערכת הדמיה פלואורסצנטית רב-ערוצית אוטומטית (ראה טבלת חומרים) כדי להציג את אות GFP.</li>
	<li>כמתואר בשלב 2.2, טען 150 μL של מדיה תרבותית עם או בלי 5 μM של nocodazole ו 150 μL של מדיה תרבותית עם 0.5 μM של reversine בשלוש בארות שונות של צלחת 96 בארות.</li>
	<li>שטפו את הביציות המוזרקות באמצעות שש טיפות של תרבית ללא מילרין והעבירו 1/3 מהביציות לכל טיפול.</li>
	<li>שמרו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37°C, עם 5%CO2 ו-80% לחות עד שהביציות יחזרו למיוזה, כ-3 שעות לאחר שטיפת המילרינון. הערה: השתמש בסטריאומיקרוסקופ עם הגדלה בין 30x-64x כדי להעריך את התמוטטות המעטפת הגרעינית כסימן היכר של חידוש meiotic.</li>
	<li>הקלט תמונות של הבשלת ביציות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בתא אינקובטור כמתואר בשלב 2.6. השתמש בהגדרות שדה בהיר כדי למצוא את הביציות בבאר. השתמש במסנן 488 כדי לזהות את אות Securin-gfp ולהתאים את עוצמת הפלואורסצנטיות כדי למנוע חשיפת יתר של התאים.<ol><li>אם מערכת ההדמיה אוטומטית, שמרו את מיקומי הביציות בכל באר. מכיוון שסקורין-gfp מופץ באופן שווה לתוך הציטופלסמה, צלם תמונות במישור האמצעי של הביציות במרווחים של 20 דקות במשך 24 שעות. כדי ללכוד קבוצות של ביציות בתמונה אחת, השתמש בעדשה אובייקטיבית בהגדלה נמוכה יותר, כגון 10x.</li>
	</ol></li>
	<li>השתמש בתוכנה לניתוח תמונות כדי לכמת הרס Securin-gfp. פתח את התמונות של ערוץ GFP. התחל בנקודת זמן 1. בתוכנת הניתוח המועדפת, השתמש בכלי בחירה או צורה כדי לסמן כל ביצית וליצור אזור עניין (ROI) עבור כל תא.<ol><li>השתמש באותו החזר השקעה כדי לבחור אזור רקע לחיסור מאוחר יותר. מדוד את עוצמת הפיקסלים של GFP בכל החזר השקעה.</li>
	</ol></li>
	<li>באמצעות החזר ההשקעה עבור כל ביצית הנוצרת בשלב 3.8, למדוד את עוצמת GFP בכל נקודות הזמן. הערה: בתוכנות מסוימות, כרטיסיית "נתח" מאפשרת בחירה של הפונקציה מדידה.<ol><li>לאחר מכן, התקדם למסגרת הזמן הבאה וחזור על תהליך זה כדי למדוד את עוצמת ה- GFP בכל מסגרת זמן. לבסוף, לכל ערך GFP, החסר את מדידת החזר ההשקעה ברקע שנבחר בשלב 3.8. ניתוח זה ייתן ערך עבור עוצמת Securin-gfp עבור כל ביצית בכל נקודת זמן.</li>
	</ol></li>
	<li>חלץ פרמטרים שונים מדפוס הרס סקורין: (א) הזמן שבו החלה השפלת סקורין-GFP. זה אומר מתי השתקת SAC החלה; (ב) זמן האות המינימלי Securin-gfp. זה אומר מתי השתקת SAC ירדה מתחת לרמת סף כדי לאפשר הפעלה גבוהה של APC/C והשפלה מלאה של Securin-GFP; (ג) שיעור ההרס של סקורין-GFP19. זה אומר באיזו מהירות פעילות SAC יורדת מתחת לרמת סף להפעלת APC/C והשפלת Securin-GFP.</li>
</ol>4. גיוס MAD2 בקינטוכורים על ידי אימונופלואורסנציה במהלך הבשלה מיוטית
הערה: לאיסוף ביציות והבשלהן, עיין בדוח12 שפורסם בעבר.
<ol><li>חלקו את הביציות לשלוש קבוצות. העבירו כל קבוצת ביציות לטיפות של 100 μL של תרבית ללא מילרינון. כסו את הטיפות בשמן מינרלי והניחו אותן באינקובטור (37°C, 5% CO2 ו-80% לחות) למשך 3 שעות, 5 שעות ו-7 שעות כדי להגיע לשלב המוקדם של prometaphase I, שלב Prometaphase I מאוחר ושלב metaphase I, בהתאמה. הערה: מניחים כל נקודת זמן בכלי אחר כדי להימנע מהוצאת אותה מנה מהאינקובטור מספר פעמים, מה שמשפיע על העיתוי הרגיל של ההבשלה המיוטית.</li>
	<li>בנקודות הזמן שהוקצו, תקן את הביציות על ידי העברתן לטיפות של 500 μL של 2% PFA במאגר PHEM 1x למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, באמצעות צלחת זכוכית 9 בארות כפי שתואר קודם לכן20. לאחר מכן, להעביר את התאים לבאר נקייה המכילה טיפה 500 μL של פתרון חסימה (PBS + 0.3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0.02% NaN3). הערה: הרכב PHEM: 60 mM PIPES; 25 מ"מ HEPES; 10 mM EGTA; ו 2 mM MgCl2. הערה: ניתן לעצור בשלב זה ולאחסן את הביציות בתמיסה חוסמת בצלחת 9 בארות ב 4 ° C עד הזמן הנוח כדי להשלים immunofluorescence.</li>
	<li>להמשך גילוי MAD2, העבירו את הביציות לבאר נקייה המכילה טיפה של 500 μL של תמיסת חדירה (PBS + 0.3% BSA + 0.1% TritonX-100 + 0.02% NaN3). דוגרים במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן מעבירים את התאים לבאר חדשה של תמיסת חסימה ודגרים במשך 10 דקות.</li>
	<li>עבור שאר השלבים immunofluorescence, להשתמש מכסה צלחת 96 היטב עם כניסות כפי שתואר קודם20. השתמשו בתא כהה ולח כדי למנוע חשיפה לאור ואידוי. מעבירים את הביציות לטיפת 30 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת עם נוגדן אנטי-MAD2 (1:1000, ארנבת) ונוגדן אנטי-צנטרומרי (ACA) (1:30, אנושי) (ראו טבלת חומרים) ודגורים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. הערה: מכסה צלחת 96 בארות מאפשר מקום לעיבוד של מספר חלבונים וקבוצות בו זמנית.</li>
	<li>כדי לשטוף נוגדנים ראשוניים עודפים, להעביר את התאים לטיפה 30 μL של 1x PHEM מאגר בתוספת 0.5% טריטון לדגור במשך 10 דקות בתא לחות. חזור על שלב זה פעמיים נוספות.</li>
	<li>בצע את השטיפה הרביעית, העברת התאים לטיפה של 30 μL של חיץ PHEM 1x ללא 0.5% 1x טריטון, ודגרה במשך 10 דקות.</li>
	<li>מעבירים את התאים לטיפת 30 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת המכילה נוגדנים משניים כגון אנטי-אדם-633 (1:200) ואנטי-ארנב-568 (1:200) (ראו טבלת חומרים) ודגורים במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. הערה: בחר את השילוב של פלואורופורים בהתבסס על לייזרים או מסננים במיקרוסקופ.</li>
	<li>כדי לשטוף נוגדנים משניים עודפים, חזור על שלבים 4.5-4.6.</li>
	<li>כדי להרכיב את התאים בשקופית המיקרוסקופ, העבר את התאים לטיפה של 10 μL של מדיית הרכבה המכילה DAPI (0.1 מ"ג/מ"ל) (ראה טבלת חומרים). הוסף נקודות קטנות של וזלין לכל פינה של הכיסוי, הנח אותן בזהירות על גבי טיפת המדיה ההרכבה ולחץ לאט כדי לפזר. השתמשי בלק שקוף כדי לאטום את הכיסוי למגלשה. לתיאור מפורט יותר של תהליך ההרכבה, ראה הפניה20.</li>
	<li>צלם קינטוכורים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי (ראה טבלת חומרים) המצויד במטרה של 40x או 63x. באמצעות אות ACA, לקבוע את טווח z המאפשר הדמיה של כל אזור הכרומוזומים. הערה: ניתן להשתמש בזום אופטי של 4.0 וגודל z-step של 0.5 מיקרומטר במערכות הדמיה מסוימות. פרמטרים אלה עשויים להשתנות ממערכת למערכת, ואופטימיזציה יהיה צורך.</li>
	<li>נתח את עוצמת MAD2 בקינטוכורים באמצעות תוכנה לניתוח תמונה. בצע הקרנה מקסימלית של ערימת z ולאחר מכן פצל את הערוצים.</li>
	<li>ראשית, צור מסיכה באמצעות ערוץ ACA על ידי בחירת ערוץ ACA כדי לקבוע סף המזהה את כל אותות הקינטוחור. עבור אל הכרטיסיה עריכה וצור בחירה. לאחר מכן, צור החזר השקעה באמצעות בחירה זו.</li>
	<li>בחר את ערוץ MAD2 והבא את הבחירה שנוצרה בשלב 4.12. בחר שיטת סף המתאימה יותר לאות MAD2. מדדו את העוצמה. הערה: בחר את שיטת הסף בטיפול הבקרה ושמור אותה קבועה בעת ניתוח טיפולים שונים.</li>
	<li>כדי לבצע חישובי עוצמת פיקסלים יחסית, חלקו את העוצמה של כל תא בעוצמה הממוצעת של ביציות WT בניסוי.</li>
</ol>

<ol><li>Gruhn, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+errors+in+human+eggs+shape+natural+fertility+over+reproductive+life+span%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Chromosome errors in human eggs shape natural fertility over reproductive life span.</a> Science. 365 (6460), 1466-1469 (2019).</li>
<li>Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+aneuploidy%3A+mechanisms+and+new+insights+into+an+age-old+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Genetics%22%5BJournal%5D)">Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem.</a> Nature Reviews. Genetics. 13 (7), 493-504 (2012).</li>
<li>Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+spindle+assembly+checkpoint+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics.</a> Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).</li>
<li>Lara-Gonzalez, P., Westhorpe, F. G., Taylor, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+spindle+assembly+checkpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The spindle assembly checkpoint.</a> Current Biology. 22 (22), 966-980 (2012).</li>
<li>London, N., Biggins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling+dynamics+in+the+spindle+checkpoint+response%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling dynamics in the spindle checkpoint response.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 15 (11), 736-748 (2014).</li>
<li>Kuhn, J., Dumont, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+kinetochores+count+attached+microtubules+in+a+sensitive+and+switch-like+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mammalian kinetochores count attached microtubules in a sensitive and switch-like manner.</a> Journal of Cell Biology. 218 (11), 3583-3596 (2019).</li>
<li>Jones, K. T., Lane, S. I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li>
<li>Gui, L., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+assembly+checkpoint+signalling+is+uncoupled+from+chromosomal+position+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes.</a> Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).</li>
<li>Nagaoka, S. I., Hodges, C. A., Albertini, D. F., Hunt, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oocyte-specific+differences+in+cell-cycle+control+create+an+innate+susceptibility+to+meiotic+errors%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Oocyte-specific differences in cell-cycle control create an innate susceptibility to meiotic errors.</a> Current Biology. 21 (8), 651-657 (2011).</li>
<li>Sebestova, J., Danylevska, A., Novakova, L., Kubelka, M., Anger, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lack+of+response+to+unaligned+chromosomes+in+mammalian+female+gametes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Lack of response to unaligned chromosomes in mammalian female gametes.</a> Cell Cycle. 11 (16), 3011-3018 (2012).</li>
<li>Vasquez, R. J., Howell, B., Yvon, A. M., Wadsworth, P., Cassimeris, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanomolar+concentrations+of+nocodazole+alter+microtubule+dynamic+instability+in+vivo+and+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Biology+of+the+Cell%22%5BJournal%5D)">Nanomolar concentrations of nocodazole alter microtubule dynamic instability in vivo and in vitro.</a> Molecular Biology of the Cell. 8 (6), 973-985 (1997).</li>
<li>Stein, P., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+oocyte+microinjection%2C+maturation+and+ploidy+assessment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Mouse oocyte microinjection, maturation and ploidy assessment.</a> Journal of Visualized Experiments. (53), e2851(2011).</li>
<li>Thomas, R. E., Thompson, J. G., Armstrong, D. T., Gilchrist, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+specific+phosphodiesterase+isoenzyme+inhibitors+during+in+vitro+maturation+of+bovine+oocytes+on+meiotic+and+developmental+capacity%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Effect of specific phosphodiesterase isoenzyme inhibitors during in vitro maturation of bovine oocytes on meiotic and developmental capacity.</a> Biology of Reproduction. 71 (4), 1142-1149 (2004).</li>
<li>Marin, D., Nguyen, A. L., Scott, R. T., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+mouse+oocytes+to+assess+human+gene+function+during+meiosis+I%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Using mouse oocytes to assess human gene function during meiosis I.</a> Journal of Visualized Experiments. (134), e57442(2018).</li>
<li>Herbert, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Homologue+disjunction+in+mouse+oocytes+requires+proteolysis+of+securin+and+cyclin+B1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Homologue disjunction in mouse oocytes requires proteolysis of securin and cyclin B1.</a> Nature Cell Biology. 5 (11), 1023-1025 (2003).</li>
<li>Solc, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiple+requirements+of+PLK1+during+Mouse+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Multiple requirements of PLK1 during Mouse oocyte maturation.</a> PLoS One. 10 (2), 0116783(2015).</li>
<li>Blengini, C. S., Nguyen, A. L., Aboelenain, M., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-dependent+integrity+of+the+meiotic+spindle+assembly+checkpoint+in+females+requires+Aurora+kinase+B%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Age-dependent integrity of the meiotic spindle assembly checkpoint in females requires Aurora kinase B.</a> Aging Cell. 20 (11), 13489(2021).</li>
<li>Balboula, A. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Haspin+kinase+regulates+microtubule-organizing+center+clustering+and+stability+through+Aurora+kinase+C+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Science%22%5BJournal%5D)">Haspin kinase regulates microtubule-organizing center clustering and stability through Aurora kinase C in mouse oocytes.</a> Journal of Cell Science. 129 (19), 3648-3660 (2016).</li>
<li>Nabti, I., Grimes, R., Sarna, H., Marangos, P., Carroll, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+age-dependent+APC%2FC-mediated+decrease+in+securin+causes+premature+sister+chromatid+separation+in+meiosis+II%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Maternal age-dependent APC/C-mediated decrease in securin causes premature sister chromatid separation in meiosis II.</a> Nature Communications. 8 (1), 15346(2017).</li>
<li>Blengini, C. S., Schindler, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+technique+to+detect+subcellular+structures+critical+to+oocyte+maturation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence technique to detect subcellular structures critical to oocyte maturation.</a> Methods in Molecular Biology. 1818, 67-76 (2018).</li>
<li>Santaguida, S., Tighe, A., D'Alise, A. M., Taylor, S. S., Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissecting+the+role+of+MPS1+in+chromosome+biorientation+and+the+spindle+checkpoint+through+the+small+molecule+inhibitor+reversine%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Dissecting the role of MPS1 in chromosome biorientation and the spindle checkpoint through the small molecule inhibitor reversine.</a> Journal of Cell Biology. 190 (1), 73-87 (2010).</li>
<li>Musacchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+biology+of+spindle+assembly+checkpoint+signaling+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">The molecular biology of spindle assembly checkpoint signaling dynamics.</a> Current Biology. 25 (20), 1002-1018 (2015).</li>
<li>Wassmann, K., Niault, T., Maro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metaphase+I+arrest+upon+activation+of+the+Mad2-dependent+spindle+checkpoint+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Metaphase I arrest upon activation of the Mad2-dependent spindle checkpoint in mouse oocytes.</a> Current Biology. 13 (18), 1596-1608 (2003).</li>
<li>Hassold, T., Hall, H., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+of+human+aneuploidy%3A+where+we+have+been%2C+where+we+are+going%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">The origin of human aneuploidy: where we have been, where we are going.</a> Human Molecular Genetics. 16, 203-208 (2007).</li>
<li>Gui, L., Homer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spindle+assembly+checkpoint+signalling+is+uncoupled+from+chromosomal+position+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Spindle assembly checkpoint signalling is uncoupled from chromosomal position in mouse oocytes.</a> Development. 139 (11), 1941-1946 (2012).</li>
<li>Homer, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mad2+prevents+aneuploidy+and+premature+proteolysis+of+cyclin+B+and+securin+during+meiosis+I+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+and+Development%22%5BJournal%5D)">Mad2 prevents aneuploidy and premature proteolysis of cyclin B and securin during meiosis I in mouse oocytes.</a> Genes and Development. 19 (2), 202-207 (2005).</li>
<li>Blengini, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aurora+kinase+A+is+essential+for+meiosis+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Aurora kinase A is essential for meiosis in mouse oocytes.</a> PLOS Genetics. 17 (4), 1009327(2021).</li>
<li>Hagting, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+securin+proteolysis+is+controlled+by+the+spindle+checkpoint+and+reveals+when+the+APC%2FC+switches+from+activation+by+Cdc20+to+Cdh1%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Human securin proteolysis is controlled by the spindle checkpoint and reveals when the APC/C switches from activation by Cdc20 to Cdh1.</a> Journal of Cell Biology. 157 (7), 1125-1137 (2002).</li>
<li>Rodriguez-Rodriguez, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+of+RZZ+and+Bub1-KNL1+in+mitotic+checkpoint+signaling+and+kinetochore+expansion%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Distinct roles of RZZ and Bub1-KNL1 in mitotic checkpoint signaling and kinetochore expansion.</a> Current Biology. 28 (21), 3422-3429 (2018).</li>
<li>Chambon, J. P., Hached, K., Wassmann, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+spreads+with+centromere+staining+in+mouse+oocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Chromosome spreads with centromere staining in mouse oocytes.</a> Methods in Molecular Biology. 957, 203-212 (2013).</li>
</ol>

למחברים אין קונפליקטים לחשוף.

מחסום הרכבת הציר הוא מנגנון בקרה קריטי במהלך חלוקת התא שנועד למנוע טעויות בהפרדת כרומוזומים. זה מאפשר לתא מספיק זמן לתקן קבצים מצורפים KT-MT לא תקינים. מיוזה בביציות היא תהליך נוטה לשגיאות, שבו רוב ההפרדה השגויה של הכרומוזומים מתרחשת במהלך מיוזה I, מה שמוביל ליצירת ביציות אנאופלואידיות שהן הגורם העיקרי להפלות מוקדמות ואי פוריות בבני אדם 1,24. מספר השערות נבדקות כדי להתיר מדוע במיוזה הנשית יש שגיאות. סיבה אפשרית אחת היא שה-SAC פחות יעיל מאשר בתאים סומטיים ומאפשר ה...

Aneuploidy, אשר נובע מטעויות בהפרדת כרומוזומים, הוא הגורם המוביל להפלות מוקדמות והוא קשור מאוד לטעויות במיוזה1. מיוזה נבדלת ממיטוזה מכיוון שהיא מורכבת משני סבבים של חלוקת תאים ללא שלב שכפול DNA מתערב. במיוזה I, כרומוזומים הומולוגיים נפרדים בעוד כרומטידים אחים נשארים יחד. בביציות, שלב זה נוטה לשגיאות, מה שמוביל לייצור ביציות אנופלואידיות2.
כדי למנוע שגיאות בהפרדת כרומוזומים, רוב סוגי התאים מפעילים מנגנון מעקב המשהה את מחזור התא, הנקרא מחסום הרכבת ציר (SAC). מנגנון זה חש את חיבורי הקינטוחור (KT)-מיקרוטובול (MT) והמתח נוצר כאשר הכרומוזומים מכוונים באופן דו-קוטבי3. קינטוכורים לא מחוברים מעוררים תגובת SAC שמתחילה בגיוס MPS1, הרגולטור הראשי של SAC, לקינטוכורים 3,4. MPS1 יוזמת גיוס של רכיבי SAC אחרים, ופועלת כפלטפורמה ליצירת קומפלקס נקודות הביקורת המיטוטיות (MCC). ה-MCC, המורכב מ-MAD1, MAD2, BUB3 ו-BUBR1, מתפזר לתוך הציטופלסמה ומעכב את הפעלת APC/C על ידי תפיסת המפעיל שלו CDC20. ברגע שכל הקינטוכורים מחוברים ביציבות ל-MTs והכרומוזומים מיושרים בלוח המטא-פאזה, ה-SAC מושתק, וה-MCC מפרק ומשחרר CDC20, ובכך מאפשר הפעלת APC/C. APC/C פעיל משפיל את סקורין וציקלין B, שני שלבים מרכזיים בהפעלת הופעת אנאפאזה 5,6. בתאים סומטיים, ה-SAC מחמיר מכיוון שהוא מופעל על ידי קינטוחור יחיד שאינו מחובר ומספיק כדי לגרום למעצר מחזור התא6. עם זאת, במהלך מיוזה של ביציות, SAC הוא מתירני יותר, וביציות יכולות להיכנס anaphase I עם אחד או יותר kinetochores unconnected 6,7,8,9,10. ההבנה מדוע SAC מתירני יותר בביציות היא תחום מתמשך של התמקדות בתחום. מנגנונים הגורמים לפגמים בהפעלת SAC או השתקת SAC עלולים להוביל לטעויות בהפרדת הכרומוזומים או למעצר ממושך של מחזור התא ולמוות תאי. לכן, הערכת המנגנונים השומרים על שלמות SAC בביציות חשובה להבנת תהליך יצירת הביציות האופלואידיות הבריאות.
פרוטוקול זה מתאר טכניקות להערכה מקיפה של שלמות SAC במיוזה של ביציות עכבר על ידי בחינת שלבים קריטיים שונים של המחסום. ראשית, מתוארת הערכת תגובת SAC לאחר גרימת הפעלת SAC. הפעלה זו מושגת על ידי יצירת kinetochores unattached באמצעות nocodazole, תרופה depolymerizes MTs11. שנית, שיטה לניטור השתקת SAC מתוארת על ידי מעקב אחר הדינמיקה של פירוק סקורין במהלך הבשלת הביציות. לבסוף, נעשה שימוש בבדיקה מבוססת אימונופלואורסנציה כדי למדוד את הגיוס של MAD2, אחד מרכיבי MCC, לקינטוכורות. יחד, בדיקות אלה מעריכות באופן מקיף את שלמות SAC במהלך הבשלה מיוטית של ביציות.

<table><tbody><tr><td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל-סולפוקסיד (DMSO)</td><td>Sigma</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>חמור-אנטי-ארנב-Alexa-568</td><td>Life Technologies</td><td>A10042</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FL מערכת הדמיה אוטומטית</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>EVOS Onstage Incubator</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>תא חממה תחתית</td></tr><tr><td>זכוכית 96- צלחות באר N 1.5 לא מצופה</td><td>MatTek Corporation</td><td>P96G-1.5-5-F</td><td></td></tr><tr><td>עז-אנטי-אדם-Alexa-633</td><td>Life Technologies</td><td>A21091</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H3537</td><td></td></tr><tr><td>נוגדנים</td><td>אנושיים נגד ACA</td> משולבים <td>15-234</td><td>דילול 1/30</td></tr><tr><td>תמונהJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P5405</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma</td><td>P5655</td><td></td></tr><tr><td>Leica SP8 מצויד ב-63&, 1.40 NA מטרת טבילה בשמן</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&middot; 7H20</td><td>Sigma</td><td>M7774</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma</td><td>M4659</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S2429</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>NaN3</td><td>Sigma</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>Sigma</td><td>M1404</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldhyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PIPES</td><td>Sigma</td><td>P6757</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit anti- MAD2</td><td>Biolegend</td><td>924601</td><td>דילול 1/1000; בעבר Covance #PRB-452C</td></tr><tr><td>Reversine</td><td>Cayman Chemical</td><td>10004412</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X</td><td>Sigma</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>מעבדות וקטור</td> <td>Vectashield</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

Evaluation of the Spindle Assembly Checkpoint Integrity in Mouse Oocytes

Aneuploidy היא החריגה הגנטית המובילה הגורמת להפלה מוקדמת וכישלון הריון בבני אדם. רוב הטעויות בהפרדת הכרומוזומים הגורמות לאנאופלואידיות מתרחשות במהלך מיוזה בביציות, אך עדיין לא ברור לחלוטין מדוע מיוזה ביצית מועדת לשגיאות. במהלך חלוקת התא, תאים מונעים טעויות בהפרדת הכרומוזומים על ידי הפעלת מחסום הרכבת הציר (SAC). מנגנון בקרה זה מסתמך על זיהוי חיבורי קינטוחור (KT)-מיקרוטובול (MT) וחישת מתח שנוצר על ידי סיבי ציר. כאשר KT אינם מחוברים, ה- SAC מופעל ומונע התקדמות מחזור התא. ה-SAC מופעל תחילה על ידי MPS1 קינאז, אשר מפעיל את הגיוס וההיווצרות של קומפלקס נקודות הביקורת המיטוטיות (MCC), המורכב מ-MAD1, MAD2, BUB3 ו-BUBR1. לאחר מכן, MCC מתפזר לתוך הציטופלסמה ו sequesters CDC20, מפעיל קומפלקס / ציקלוזום מקדם anaphase (APC/C). ברגע ש-KT מתחברים למיקרוטובולים והכרומוזומים מיושרים בלוח המטא-פאזה, ה-SAC מושתק, CDC20 משתחרר, וה-APC/C מופעל, מה שגורם להתפרקות של ציקלין B וסקורין, ובכך מאפשר הופעת אנאפאזה. בהשוואה לתאים סומטיים, SAC בביציות אינו יעיל באותה מידה מכיוון שתאים יכולים לעבור אנאפאזות למרות שיש להם KT לא מחוברים. ההבנה מדוע ה- SAC מתירני יותר ואם מתירנות זו היא אחד הגורמים לטעויות בהפרדת כרומוזומים בביציות עדיין דורשת חקירה נוספת. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את שלוש הטכניקות להערכה מקיפה של שלמות SAC בביציות עכבר. טכניקות אלה כוללות שימוש בנוקודזול לדה-פולימריזציה של MTs כדי להעריך את תגובת SAC, מעקב אחר השתקת SAC על ידי מעקב אחר הקינטיקה של הרס סקורין, והערכת הגיוס של MAD2 ל-KT על ידי אימונופלואורסצנציה. יחד, טכניקות אלה בודקות את מנגנוני הבדיקה הדרושים לייצור ביציות בריאות על ידי מתן הערכה מלאה של שלמות SAC.

הערכת היענות SAC על ידי טיפול nocodazole מטרת ניסוי זה היא להעריך את ההפעלה והחוזק של SAC. על ידי שימוש בנוקודזול לדה-פולימריזציה של מיקרוטובולים של צירים, כל הקינטוכורים לא יהיו מחוברים, מה שיגרום למעצר מחזור התא בתיווך SAC. במערכת ההדמיה הנוכחית, ביציות בקרה שטופלו ב-DMSO הוציאו גוף קוטבי כ-14 שעות לאחר שחרורו ממילרינון (איור 1, לוחות עליונים). בהתאם להפעלת SAC, ביציות שטופלו בנוקודזול נעצרו במטא-פאזה I ולא הוציאו גוף קוטבי (איור 1, פאנלים ...

שגיאה בהפרדת כרומוזומים היא תכונה נפוצה בביציות. לכן, חקר מחסום הרכבת הציר נותן רמזים חשובים על המנגנונים הדרושים לייצור ביצים בריאות. הפרוטוקול הנוכחי מתאר שלוש בדיקות משלימות להערכת שלמות מחסום הרכבת ציר בביציות עכבר.

Aneuploidy is the leading genetic abnormality causing early miscarriage and pregnancy failure in humans. Most errors in chromosome segregation that give ...

Aneuploidy הוא הגורם הגנטי המוביל להפלה מוקדמת בבני אדם. רוב הטעויות בהפרדת הכרומוזומים מתרחשות במהלך מיוזה בביציות. לכן, הערכת מחסום הרכבת הציר בביציות היא קריטית להבנה מדוע הביציות מועדות לשגיאות.כאן אנו מתארים שלוש טכניקות להערכה מקיפה של שלמות SAC בביציות עכבר על ידי בחינת שלבים קריטיים שונים בנקודת ביקורת באמצעות שילוב של הדמיה חיה ואימונופלואורסצנציה. מי שתדגים את ההליך תהיה ד"ר ססיליה בלנגיני, עמיתת מחקר מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להכין מיליליטר אחד של מדיה תרבותית המכילה nocodazole ו reversine עם DMSO כפקד כמתואר בכתב היד.להבשלת ביציות והדמיה חיה יש להשתמש בצלחת 96 בארות מחוממת מראש באינקובטור. ולטעון את הראשון, השני והשלישי היטב עם 150 מיקרוליטר של DMSO שליטה, nocodazole ו nocodazole בתוספת טיפול reversine בהתאמה. תוך שמירת הצלחת באינקובטור בתנאים כמתואר בכתב היד.כדי להתחיל בהבשלה מיוטית יש להסיר את המילרינון על ידי העברה רציפה של הביציות דרך 6 טיפות של 100 מיקרוליטר של תרבית ללא מילרינון המכילה DMSO. ומניחים אותם לתוך הבאר המתאימה של צלחת 96 באר. שימוש בפיפט המופעל ביד או בפה תוך צפייה בביציות תחת מיקרוסקופ סטריאו.דמיינו את הביציות באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר המצויד בתא אינקובטור עם סביבה מבוקרת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס, 5% פחמן דו חמצני ו-80% לחות. צלם תמונות במישור האמצעי של הביציות במרווחים של 20 דקות במשך 24 שעות. לאחר כימות מספר הביציות שמפרישות גוף קוטבי על ידי זיהוי התאים שעוברים דרך ציטוקינים א-סימטריים עם תא קטן ליד הביצית ובתוך הזונה פלוצ'ידה המשותפת.הצג את התמונות באמצעות תוכנת הדמיה. Microinject pro-phase one עצר ביציות עם 100 ננוגרם לכל מיקרוליטר של securin-gfp cRNA שהוכן בעבר. לאחר מיקרו-הזרקה, לאפשר לביציות להתאושש ולתרגם את הרנ"א באינקובטור הפחמן הדו-חמצני למשך שלוש שעות לפחות.לאחר מכן לטעון 150 מיקרוליטר של מדיה תרבית עם או בלי חמישה מיקרומולר של nocodazole. ו 150 מיקרוליטר של מדיה תרבותית עם 0.5 מיקרומולר של reversine בשלוש בארות שונות של צלחת 96 בארות. שטפו את הביציות המוזרקות במיקרו דרך שש טיפות של תרבית ללא מילרינון והעבירו שליש מהביציות לכל טיפול.שמרו את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-80% לחות עד שהביציות יחזרו למיוזה, כשלוש שעות לאחר שטיפת המילרינון. הקלט תמונות של הבשלת ביציות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המצויד בתא אינקובטור. השתמש בתוכנת ניתוח תמונות כדי לכמת הרס securin-gfp ולפתוח את התמונות של ערוץ GFP, החל מזמן 0.1.בתוכנת הניתוח המועדפת, השתמש בכלי הבחירה או הצורה כדי לסמן כל ביצית וליצור אזור עניין לכל תא. השתמש באותו אזור עניין כדי לבחור אזור רקע לחיסור מאוחר יותר ולמדוד את עוצמת הפיקסלים של GFP בכל אזור עניין בכל נקודות הזמן. לבסוף לכל ערך GFP, החסר את מדידת אזור העניין ברקע.לאחר פיצול המיוזה לשלוש קבוצות, מעבירים כל קבוצת מיוזה ל-100 טיפות מיקרוליטר של תרבית ללא מילרינון מדיה. כסו את הטיפות בשמן מינרלי והניחו אותן באינקובטור למשך שלוש, חמש ושבע שעות כדי להגיע לשלב הראשון של הפרומטאפאזה, השלב הראשון והמטא-שלב הראשון בהתאמה. בנקודות הזמן שהוקצו, תקנו את הביציות על ידי העברתן לטיפות של 500 מיקרוליטר של 2% פרפורמלדהיד במאגר PME למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר באמצעות צלחת זכוכית של תשע בארות.לאחר מכן להעביר את התאים לבאר נקייה המכילה טיפה 500 מיקרוליטר של פתרון חסימה. להמשך גילוי MAD2, העבירו את הביציות לבאר נקייה המכילה טיפה של 500 מיקרוליטר של תמיסת חדירה. לאחר הדגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר, מעבירים את התאים לבאר חדשה של תמיסה חוסמת ודגרים במשך 10 דקות.מעבירים את הביציות לטיפה של 30 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת עם נוגדן אנטי MAD2 ונוגדן אנטי צנטרומר ודגרים במשך שעתיים בטמפרטורת החדר. כדי לשטוף נוגדנים ראשוניים עודפים לאחר העברת התאים ל 30 מיקרוליטר טיפה של חיץ PME בתוספת 0.5% טריטון, לדגור במשך 10 דקות בתא לחות. מעבירים את התאים לטיפת 30 מיקרוליטר של תמיסה חוסמת המכילה נוגדנים משניים כגון אנטי אנושי 633 ואנטי ארנב 568.ולדגור במשך שעה בטמפרטורת החדר. כדי להרכיב את התאים בשקופית המיקרוסקופ, העבר את התאים לטיפה של 10 מיקרוליטר של מדיית הרכבה המכילה DAPI. הוסיפו נקודות קטנות של וזלין לכל פינה של פתק הכיסוי.הניחו אותם בזהירות על גבי ירידת המדיה המותקנת ולחצו לאט כדי להפיץ. אטמו את החלקת הכיסוי למגלשה באמצעות לק שקוף. תמונה kinetochores באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי מצויד מטרה 40 או 63 X.ובאמצעות אות נוגדנים אנטי צנטרומר לקבוע את טווח Z המאפשר הדמיה של כל אזור הכרומוזומים. הביציות שטופלו ב-DMSO הוציאו גוף קוטבי כ-14 שעות לאחר שחרורו מהמילרינון. לאחר הפעלת SAC, ביציות שטופלו בנוקודזול נעצרו במטא-פאזה הראשונה ולא הוציאו גוף קוטבי.עם זאת, בהיעדר הפעלת SAC, הביציות הוציאו גוף קוטבי למרות שלא היו לו חיבורי מיקרוטובולים קינטוחורים. הוערך שיעור השפלת ה-securin-gfp במהלך ההבשלה המיוטית. כאשר הביקורת DMSO טיפל בביציות securin-gfp עוצמת מתחיל לרדת בערך 10 שעות לאחר שטיפת milrinone.כאשר הביציות הבשילו בנוכחות סוכן מפעיל SAC, רמות nocodazole, securin-gfp היו יציבות במהלך כל תקופת ההבשלה המיוטית . לעומת זאת, בעת מניעת הפעלת SAC עם טיפול הפיך, דפוס הסקורין-GFP הואץ וההתפרקות החלה בערך ארבע שעות לאחר שטיפת המילרינון, בהתאם לעיכוב SAC. הדמיה קונפוקלית שימשה לגילוי צנטרומרים ו- MAD2 של ביציות שהבשילו לפרומטאפאזה מוקדמת אחת, פרומטאפאזה מאוחרת אחת ומטאפאזה אחת.כדי להעריך את עוצמת אות ה-SAC, כומתה עוצמת הפיקסלים MAD2 של הקינטוחור המקומי. רמות משמעותיות של גיוס MAD2 לקינטוכורים מתרחשות בשלב הראשון של השלב הראשון, כאשר רוב הקינטוכורים לא היו מחוברים למיקרוטובולים. רמות MAD2 ירדו בפרומטאפאזות מאוחרות יותר וכמעט נעדרו בשלב הראשון כאשר כל הקינטוכורים היו מחוברים ביציבות למיקרוטובולים.חשוב להדגיש שלכל אחת מהטכניקות הללו יש את המגבלות שלה ואת הפרשנות שלהן. ואנו מציעים לבצע שילוב של שיטות אלה כדי להעריך את שלמות SAC. שלושת המאמרים הללו מאפשרים לחוקרים להעריך את חומרת השק בביציות ולתת תובנה לגבי גורם פוטנציאלי לאנאופלואידיות בביציות אנושיות.

evaluation-spindle-assembly-checkpoint-integrity-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

ביציות נוטים aneuploidy בשל טעויות הפרדה כרומוזום במהלך ההבשלה meiotic. ביצים Aneuploid יכול לגרום לבעיות פוריות הפלות או הפרעות התפתחותיות כמו תסמונת דאון. כאן אנו מתארים שיטות להציג חומרים הבחירה לתוך ביציות ושיטות מחקר התבגרות meiotic ולהעריך ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לדלדול mRNA ספציפי בתיווך siRNA אחרי ניתוח immunofluorescence להעריך הרכבה ציר meiotic וארגון בביציות עכבר. פרוטוקול זה מתאים לדלדול במבחנה של תמלילים והערכה תפקודית של ציר שונה ו / או גורמים הקשורים MTOC בביציות.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

כאן אנו מציגים פרוטוקול לאפיון של ביציות Antral עכבר מבוססות על ארגון nucleolar.

בידוד ואפיון של עכבר Antral ביציות בהתבסס על ארגון הכרומטין nucleolar

Oogenesis ביונקים ידוע להיות מועדת לטעויות, במיוחד עקב כרומוזום missegregation. כתב יד זה מתאר שיטות הכנה כרומטין להפיץ prophase העכבר, מפה של אני, oocytes ביים השני. טכניקות יסוד אלה מאפשרים לימוד חלבוני כרומטין מכורך כרומוזום מורפולוגיה ברחבי oogenesis יונקים.

כרומטין להפיץ את ההכנות לניתוח של העכבר Oocyte התקדמות מן Prophase כדי מפה של השני

גרסאות גנטי המשויכים מחלות אנושיות מתחילים להיות חשפו, זה הופך יותר ויותר חשוב לפתח מערכות אשר במהירות והערכת החשיבות הביולוגית של משתנים אלה שזוהו. פרוטוקול זה מתאר שיטות להערכת תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה הנשי אני משתמש בעכבר oocytes.

באמצעות העכבר Oocytes כדי להעריך תפקוד הגן האנושי במהלך המיוזה אני

אנו מספקים מיתאר של הפרוטוקול הקליני להערכת לא פולשנית של בגרות ביצה אנושית באמצעות מיקרוסקופ אור מקוטב.

הערכה לפירעון ביצת אנוש ויישומו הקליני

מוצג פרוטוקול אופטימלי המאפשר דלדול של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר במהלך מטאפאזה I באמצעות לייזר פמטו-שניות כמעט אינפרה-אדום.

אבלציה בלייזר רב-פוטונים של מרכזי ארגון מיקרוטובולים ציטופלסמיים בביציות עכבר

שמירה על שלמות גנום הביצית נחוצה כדי להבטיח את הנאמנות הגנטית בעובר המתקבל. כאן, אנו מציגים פרוטוקול מדויק לאיתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בתאי נבט נקביים של יונקים.

איתור שברים דו-גדיליים בדנ"א בביציות עכבר

שגיאות מיוטיות בסינפסות ורקומבינציה נפוצות בביציות של יונקים. ניתוח קפדני של חלבונים המעורבים בתהליכים אלה חיוני להבנה כיצד ומדוע ביציות משתבשות לעתים קרובות. הטכניקות המוצגות כאן מאפשרות ניטור מקיף של רקומבינציה וסינפסות כדי להעריך את איכות הביציות בעכברים.

הכנת התפשטות כרומוזומים מיוטיים מביציות עכבר להערכת סינפסה ורקומבינציה

במחקר זה, אנו מתארים שיטה פשוטה לביצוע ניתוח צבע כחול של אוונס (EBD) על זחלי דג הזברה.  טכניקה זו היא כלי רב עוצמה לאפיון שלמות שרירי השלד ותיחום מודלים של דג זברה של ניוון שרירים, והיא שיטה רבת ערך לפיתוח טיפולים חדשים.

ניתוח של יושרה שריר שלד דג הזברה זחלים עם אוונס הכחול צבע

למדו להעריך את שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר באמצעות הדמיה חיה וחישוף אימונופלואורסצנטי. שלוש שיטות מקיפות מאפשרות לחקור מנגנוני הפרדת כרומוזומים ואנאופלואידיות.

הערכת שלמות מחסום הרכבת הציר בביציות עכבר

גלה סרטונים נוספים