מידול התפתחות המוח הקטן האנושי במבחנה במבנה דו-ממדי
16 בספטמבר 2022
הפרוטוקול הנוכחי מסביר את יצירתו של מונולאייר דו-ממדי של תאי המוח הקטן מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לחקר השלבים המוקדמים של התפתחות המוח הקטן.
שיטה זו יכולה לסייע בחקר ההתפתחות המוחית האנושית המוקדמת וכיצד היא עשויה להשתנות בהפרעות נוירופסיכיאטריות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא יצירת תאי המוח הקטן האנושיים המוקדמים מבחינה התפתחותית במבנה שכבה דו-ממדי מבלי לבצע שלבים מסובכים. זה גם חסכוני.
הכנת פיפטות משיכה יכולה להיות מסובכת בהתחלה, אך עם תרגול וזמן, קל יותר למשוך את הפיפטות באופן שיהיה קל יותר לעבוד איתו. התחילו את ההכנה הניסיונית על ידי משיכת פיפטה פסטר באורך 22.9 ס"מ כשני סנטימטרים מתחת לצוואר, מעל מבער הבונזן כדי ליצור שתי פיפטות זכוכית. הצד הדק יותר יהיה קצר בכארבעה סנטימטרים מהצד השני.
כופפו את קצות הצד המשוך על הלהבה כדי ליצור R חלק, ואז הניחו את הפיפטות הנמשכות בשרוולים של אוטוקלאב ועקרו אותן באוטוקלאב. ביום אפס, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום התמיינות המוח הקטן בתוספת 10 מיקרומולר Y-27632 ו- SB-431542 לכל באר של שש בארות חיבור אולטרה-נמוך, או ULA, צלחת, והניחו אותו באינקובטור עד שהמושבות המורמות מוכנות להוספה לבארות. נקו את התאים הממוינים באמצעות פיפטה מזכוכית משוכה.
שאפו את המדיום והוסיפו מילימטר אחד של תמיסת מעבר iPSC עבור כל צלחת של 35 מילימטר. לאחר שלוש דקות של דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, שאפו את המדיום והוסיפו שני מילימטרים של מדיום התמיינות המוח הקטן בתוספת 10 מיקרומולר Y-27632 ו-SB-431542 תחת הגדלה 4x של מיקרוסקופ הפוך של אור מועבר, הרימו את המושבות באמצעות הקצה הכפוף של פיפטה הזכוכית הנמשכת. לאחר הרמת כל מושבה, העבירו בעדינות את כל המושבות לבאר אחת מתוך צלחת ULA בעלת שש הבארות באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר.
חזור על תהליך זה עבור כל צלחת iPSC ודגירה של התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. ביום השני, הוסיפו FGF2 לכל באר כדי להתאים ריכוז סופי של 50 ננוגרם למיליליטר. ביום השביעי, לשנות שליש מהמדיום על ידי שאיפה מיליליטר אחד של בינוני בילה ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של מדיום הבחנה cerebellar טרי.
לדגור על גופות העוברים במשך שבעה ימים. ביום ה-14, סובבו את הצלחת כדי לאסוף את כל גופי העובר במרכז הצלחת. לאחר מכן הטה את הצלחת ושאף את כל המדיום בילה באמצעות פייפטר 1000 microliter מהקצה.
ככל שהכמות הבינונית פוחתת, לאט לאט מניחים את הצלחת שטוחה וממשיכים לשאוף, משאירים מספיק בינוני כדי להימנע מלמשוך את גופי העובר החוצה. לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של מדיום הבחנה cerebellar טרי בתוספת 10 micromolar Y-27632. לאחר מכן מעבירים את גופי העובר באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר לצלחת מצופה פולי-L-אורניתין למינין.
ביום 15, שאפו את המדיום והחליפו אותו במדיום הבחנה cerebellar טרי. ביום האפס, מושבות iPSC נוקו והוסרו למדיום התמיינות המוח הקטן המכיל SB-431542 ו- Y-27632 והוכנסו ללוחות חיבור נמוכים במיוחד ליצירת גופים עובריים. התוספת של FGF2 ביום השני ושינוי של 1/3 מדיום ביום השביעי הביאו לכך שגופים עובריים הראו הגדלה ביום ה-14.
תאים החלו לנדוד החוצה מגופי העובר לאורך המשטח המצופה ביום ה-15. השינוי המוחלט של מדיום ההבשלה של המדיום לתווך המוח הקטן מהיום ה-21 הביא לחד-שכבתי של תאים עם מורפולוגיה דמוית נוירונים ומורכבות עד היום ה-35. ניתוח ביטוי הגנים ביום ה-35 גילה כי התאים מבטאים סמני אב מוקדמים של המוח הקטן כגון אבות גלוטמטרגיים, ATOH1, אבות GABAergic, אלפא PTF1, וסמני תאי האב של Purkinje KIRREL2 ו-SKOR2.
בנוסף, נצפו גם הביטוי של סמן שפתיים רומבי OTX2 ובעיקר נוירון קדמי ספציפי SIX3. התיוג האימונופלואורסצנטי של התאים שנקטפו ביום ה-35 הראה כתמים חיוביים עבור סמני המוח הקטן EN2 ו-PTF1 אלפא, הסמן העצבי בטא טובולין III וסמן ההתרבות KI67. צביעה גרעינית עם 4'6-דיאמידינו-2-פנילינדול, או DAPI, הראתה גרעיני תאים.
כדי לקבל בידול מוצלח, חשוב להתחיל עם מושבות iPSC בריאות ולא מובחנות ולהשתמש בריאגנטים ששוחזרו מחדש ככל האפשר.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט את יצירת מונו-שכבה דו-ממדית של תאים קליפת המוח הקטנה שמקורם בתאים גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs), שמטרתה לחקור את ההתפתחות המוקדמת של קליפת המוח הקטנה. מערכת זו מאפשרת חקירת מנגנונים שעשויים להיות מעורבים בהפרעות נוירופסיכיאטריות.
מרכיבי המחקר העיקריים
תחום המדע
- התפתחות קליפת המוח הקטנה
- ביולוגיה של תאי גזע
- הפרעות נוירופסיכיאטריות
רקע
- תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים יכולים להתמיין לסוגי תאים שונים, כולל נוירונים של קליפת המוח הקטנה.
- הבנת התפתחות קליפת המוח הקטנה חיונית לתובנות על הפרעות התפתחותיות.
- שיטה זו מפשטת את יצירת תאי קליפת המוח הקטנה ללא הליכים מורכבים.
- היעילות הכלכלית של השיטה מאפשרת גישה רחבה יותר לגישת המחקר הזו.
מטרת המחקר
- לחקור את השלבים המוקדמים של התפתחות קליפת המוח הקטנה האנושית.
- לחקור שינויים בהתפתחות הקשורים למצבים נוירופסיכיאטריים.
- לספק מתודולוגיה לייצור תאי קליפת המוח הקטנה לשימוש מחקרי.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השיטה העיקרית כוללת טכניקות תרבית תאים לייצור שכבה דו-ממדית של תאי קליפת המוח הקטנה מ-iPSCs.
- המודל הביולוגי כולל תאים פרוגניטוריים של קליפת המוח הקטנה שנוצרו מ-iPSCs, שמתחילים עם מושבות בריאות לא מובחנות.
- שלבי הניסוי העיקריים כוללים הכנת מדיום, העברת מושבות והחלפת מדיום מתוזמנת בימים מוגדרים.
- שלבים קריטיים נמשכים מהתמיינות שהחלה ביום 0 ועד התבגרות המוערכת ביום 35.
תוצאות עיקריות
- התאים הפגינו מורפולוגיה דמויית נוירונים והביעו סמנים מרכזיים של תאים פרוגניטוריים של קליפת המוח הקטנה עד יום 35.
- צביעה אימונופלואוריסצנטית חיובית אישרה את נוכחותם של סמנים נוירוניים ושל קליפת המוח הקטנה חיוניים.
- התאים הפגינו מאפייני נדידה והתמיינות, המדגישים את הפוטנציאל שלהם לדגמן פעילות של קליפת המוח הקטנה.
מסקנות
- המחקר מאפשר יצירת תאי קליפת המוח הקטנה מ-iPSCs למחקרים התפתחותיים ופתולוגיים מפורטים.
- גישה זו מספקת תובנות על התפתחות קליפת המוח הקטנה וקשריה להפרעות נוירופסיכיאטריות.
- הבנת תהליכים אלו עשויה להוביל לחידושים באסטרטגיות טיפוליות עבור תנאים קשורים.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Modeling human cerebellar development in a 2D monolayer format enables pharmaceutical R&D teams to interrogate early neurodevelopmental mechanisms relevant to neuropsychiatric disease. This system provides a scalable, reproducible platform for studying molecular and cellular events underlying cerebellar differentiation, supporting predictive confidence in target validation and mechanistic de-risking. The approach facilitates translational continuity from discovery biology to preclinical research for disorders with cerebellar involvement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of developmental pathways implicated in neurodevelopmental disorders.
- Supports functional validation of candidate targets in a human-relevant neuronal context.
- Facilitates mechanistic de-risking by modeling disease-relevant cell types and stages.
- Provides a platform for comparative analysis of gene expression and neuronal differentiation markers.
Screening & Assay Development
- Generates standardized 2D monolayer cultures suitable for high-content imaging and quantitative assays.
- Enables reproducible assessment of neuronal morphology and marker expression for assay development.
- Supports screening of compounds affecting cerebellar differentiation, neurite outgrowth, or synaptic connectivity.
- Provides a scalable system for downstream gene expression and physiological studies.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant modeling for neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.
- Enables investigation of molecular mechanisms underlying cerebellar dysfunction in translational studies.
- Supports risk-adjusted advancement of targets and pathways with human cellular evidence.
- Facilitates biomarker discovery and validation in a developmentally relevant context.
Pipeline & Workflow Integration
This 2D cerebellar differentiation protocol bridges early discovery and preclinical research by providing a human cell-based system for hypothesis testing and mechanistic studies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis-driven interrogation of cerebellar development and disease mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or genetic perturbation studies.
- Analytics: Enables measurement of gene expression, neuronal markers, and morphological features for comparative analysis.
- Translational Research: Provides continuity for biomarker alignment and disease modeling in neurodevelopmental disorders.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for diverse R&D applications across neuroscience portfolios.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation and reduces mechanistic ambiguity in neurodevelopmental research.
- Operational Value: Standardizes differentiation protocols for reproducibility and scalability across projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision-making and capital efficiency by providing early human-relevant data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets and pathways for neuropsychiatric indications.
Implementation Considerations
- Requires expertise in iPSC culture, neuronal differentiation, and immunofluorescence analysis.
- Needs access to cell culture infrastructure, imaging systems, and molecular biology tools.
- Demands rigorous standardization of reagents and protocols for cross-team reproducibility.
- May require adaptation for different iPSC lines or disease-specific genetic backgrounds.
- Dependent on the quality of starting iPSC colonies and freshly prepared reagents for optimal outcomes.
