Name: מידול התפתחות המוח הקטן האנושי במבחנה במבנה דו-ממדי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-09-16T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: חקור מודל דו-ממדי של התפתחות המוח הקטן האנושי מתאי גזע iPSCs. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני פיתוח מוחיים והשלכותיהם להפרעות נוירופסיכיאטריות בצורה פשוטה וחסכונית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לג'ני גרינגר ריצ'רדס על עבודתה היסודית באימות נושאי הבקרה שלנו, שמהם יצרנו את ה- iPSCs של הבקרה. עבודה זו נתמכה על ידי NIH T32 MH019113 (ל- D.A.M. ו- K.A.K.), קרן נלי בול (ל- T.H.W. ו- A.J.W.), NIH R01 MH111578 (ל- V.A.M. ו- J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (ל- A.J.W.), וקרן הצדקה רוי ג'יי קארבר (ל- V.A.M., J.A.W. ו- A.J.W.). הדמויות נוצרו עם BioRender.com.

<ol><li>Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Derivation+of+cerebellar+neurons+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Stem+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells.</a> Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).</li>
<li>Erceg, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+functional+cerebellar-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+and+Development%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human embryonic stem cells into functional cerebellar-like cells.</a> Stem Cells and Development. 19 (11), 1745-1756 (2010).</li>
<li>Muguruma, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+culture+for+self-formation+of+the+cerebellum+from+human+pluripotent+stem+cells+through+induction+of+the+isthmic+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">3D culture for self-formation of the cerebellum from human pluripotent stem cells through induction of the isthmic organizer.</a> Methods in Molecular Biology. 1597, 31-41 (2017).</li>
<li>Muguruma, K., Nishiyama, A., Kawakami, H., Hashimoto, K., Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organization+of+polarized+cerebellar+tissue+in+3D+culture+of+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Self-organization of polarized cerebellar tissue in 3D culture of human pluripotent stem cells.</a> Cell Reports. 10 (4), 537-550 (2015).</li>
<li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlined+3D+cerebellar+differentiation+protocol+with+optional+2D+modification%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Streamlined 3D cerebellar differentiation protocol with optional 2D modification.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (130), e56888(2017).</li>
<li>Holmes, D. B., Heine, V. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+3D+protocol+capable+of+generating+early+cortical+neuroepithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+Open%22%5BJournal%5D)">Simplified 3D protocol capable of generating early cortical neuroepithelium.</a> Biology Open. 6 (3), 402-406 (2017).</li>
<li>Silva, T. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maturation+of+human+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+neurons+in+the+absence+of+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Maturation of human pluripotent stem cell-derived cerebellar neurons in the absence of co-culture.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 70(2020).</li>
<li>Nayler, S., Agarwal, D., Curion, F., Bowden, R., Becker, E. B. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+transcriptional+landscape+of+xeno-free+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+cerebellar+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">High-resolution transcriptional landscape of xeno-free human induced pluripotent stem cell-derived cerebellar organoids.</a> Scientific Reports. 11, 12959(2021).</li>
<li>Salero, E., Hatten, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+ES+cells+into+cerebellar+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Differentiation of ES cells into cerebellar neurons.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 104 (8), 2997-3002 (2007).</li>
<li>Nie, Y., Walsh, P., Clarke, D. L., Rowley, J. A., Fellner, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scalable+passaging+of+adherent+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Scalable passaging of adherent human pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 9 (1), 88012(2014).</li>
<li>Chen, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+polypharmacology+platform+promotes+cytoprotection+and+viability+of+human+pluripotent+and+differentiated+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">A versatile polypharmacology platform promotes cytoprotection and viability of human pluripotent and differentiated cells.</a> Nature Methods. 18 (5), 528-541 (2021).</li>
<li>Machold, R., Fishell, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+is+expressed+in+temporally+discrete+pools+of+cerebellar+rhombic-lip+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 is expressed in temporally discrete pools of cerebellar rhombic-lip neural progenitors.</a> Neuron. 48 (1), 17-24 (2005).</li>
<li>Wang, V. Y., Rose, M. F., Zoghbi, H. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Math1+expression+redefines+the+rhombic+lip+derivatives+and+reveals+novel+lineages+within+the+brainstem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Math1 expression redefines the rhombic lip derivatives and reveals novel lineages within the brainstem and cerebellum.</a> Neuron. 48 (1), 31-43 (2005).</li>
<li>Hoshino, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ptf1a%2C+a+bHLH+transcriptional+gene%2C+defines+GABAergic+neuronal+fates+in+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Ptf1a, a bHLH transcriptional gene, defines GABAergic neuronal fates in cerebellum.</a> Neuron. 47 (2), 201-213 (2005).</li>
<li>Mizuhara, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purkinje+cells+originate+from+cerebellar+ventricular+zone+progenitors+positive+for+Neph3+and+E-cadherin%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Purkinje cells originate from cerebellar ventricular zone progenitors positive for Neph3 and E-cadherin.</a> Developmental Biology. 338 (2), 202-214 (2010).</li>
<li>Ferreira, A., Caceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+the+Class+III+%CE%B2-tubulin+isotype+in+developing+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience+Research%22%5BJournal%5D)">Expression of the Class III β-tubulin isotype in developing neurons in culture.</a> Journal of Neuroscience Research. 32 (4), 516-529 (1992).</li>
<li>Sullivan, K. F., Cleveland, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+conserved+isotype-defining+variable+region+sequences+for+four+vertebrate+beta+tubulin+polypeptide+classes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of conserved isotype-defining variable region sequences for four vertebrate beta tubulin polypeptide classes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 83 (12), 4327-4331 (1986).</li>
<li>Joyner, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engrailed%2C+Wnt+and+Pax+genes+regulate+midbrain-hindbrain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Engrailed, Wnt and Pax genes regulate midbrain-hindbrain development.</a> Trends in Genetics. 12 (1), 15-20 (1996).</li>
<li>Joyner, A. L., Liu, A., Millet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Otx2%2C+Gbx2+and+Fgf8+interact+to+position+and+maintain+a+mid-hindbrain+organizer%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Otx2, Gbx2 and Fgf8 interact to position and maintain a mid-hindbrain organizer.</a> Current Opinion in Cell Biology. 12 (6), 736-741 (2000).</li>
<li>Minaki, Y., Nakatani, T., Mizuhara, E., Inoue, T., Ono, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+novel+transcriptional+corepressor%2C+Corl2%2C+as+a+cerebellar+Purkinje+cell-selective+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%22%5BJournal%5D)">Identification of a novel transcriptional corepressor, Corl2, as a cerebellar Purkinje cell-selective marker.</a> Gene Expression Patterns. 8 (6), 418-423 (2008).</li>
<li>Aldinger, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+and+cell+type+transcriptional+landscape+of+human+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Spatial and cell type transcriptional landscape of human cerebellar development.</a> Nature Neuroscience. 24 (8), 1163-1175 (2021).</li>
<li>Fossat, N., Courtois, V., Chatelain, G., Brun, G., Lamonerie, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+usage+of+Otx2+promoters+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Alternative usage of Otx2 promoters during mouse development.</a> Developmental Dynamics. 233 (1), 154-160 (2005).</li>
<li>Akbarian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+PsychENCODE+project%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The PsychENCODE project.</a> Nature Neuroscience. 18 (12), 1707-1712 (2015).</li>
<li>Aijaz, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+analysis+of+SIX3+and+SIX6+in+human+tissues+reveals+differences+in+expression+and+a+novel+correlation+between+the+expression+of+SIX3+and+the+genes+encoding+isocitrate+dehyhrogenase+and+cadherin+18%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression analysis of SIX3 and SIX6 in human tissues reveals differences in expression and a novel correlation between the expression of SIX3 and the genes encoding isocitrate dehyhrogenase and cadherin 18.</a> Genomics. 86 (1), 86-99 (2005).</li>
<li>Conte, I., Morcillo, J., Bovolenta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+Six3+and+Six6+distribution+in+the+developing+and+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of Six3 and Six6 distribution in the developing and adult mouse brain.</a> Developmental Dynamics. 234 (3), 718-725 (2005).</li>
<li>Andreasen, N. C., Pierson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+cerebellum+in+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">The role of the cerebellum in schizophrenia.</a> Biological Psychiatry. 64 (2), 81-88 (2008).</li>
<li>Nopoulos, P. C., Ceilley, J. W., Gailis, E. A., Andreasen, N. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+MRI+study+of+cerebellar+vermis+morphology+in+patients+with+schizophrenia%3A+Evidence+in+support+of+the+cognitive+dysmetria+concept%5BTitle%5D)+AND+%22Biological+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">An MRI study of cerebellar vermis morphology in patients with schizophrenia: Evidence in support of the cognitive dysmetria concept.</a> Biological Psychiatry. 46 (5), 703-711 (1999).</li>
<li>Jacobsen, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+morphology+of+the+cerebellum+and+fourth+ventricle+in+childhood-onset+schizophrenia%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Quantitative morphology of the cerebellum and fourth ventricle in childhood-onset schizophrenia.</a> American Journal of Psychiatry. 154 (12), 1663-1669 (1997).</li>
<li>Saywell, V., Cioni, J. -M., Ango, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+gene+expression+profile+of+axon+guidance+cues+in+Purkinje+cells+during+cerebellar+circuit+formation%5BTitle%5D)+AND+%22The+Cerebellum%22%5BJournal%5D)">Developmental gene expression profile of axon guidance cues in Purkinje cells during cerebellar circuit formation.</a> The Cerebellum. 13 (3), 307-317 (2014).</li>
<li>Kim, D., Ackerman, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+UNC5C+netrin+receptor+regulates+dorsal+guidance+of+mouse+hindbrain+axons%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The UNC5C netrin receptor regulates dorsal guidance of mouse hindbrain axons.</a> Journal of Neuroscience. 31 (6), 2167-2179 (2011).</li>
<li>Maier, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semaphorin+4C+and+4G+are+ligands+of+Plexin-B2+required+in+cerebellar+development%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Semaphorin 4C and 4G are ligands of Plexin-B2 required in cerebellar development.</a> Molecular and Cellular Neuroscience. 46 (2), 419-431 (2011).</li>
<li>Telley, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+function+of+NRP1+in+axon+guidance+and+subcellular+target+recognition+in+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Dual function of NRP1 in axon guidance and subcellular target recognition in cerebellum.</a> Neuron. 91 (6), 1276-1291 (2016).</li>
<li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+to+mature+functional+Purkinje+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human induced pluripotent stem cells to mature functional Purkinje neurons.</a> Scientific Reports. 5, 9232(2015).</li>
<li>Shabanipour, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+neurons+isolated+from+embryonic+mouse+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Primary culture of neurons isolated from embryonic mouse cerebellum.</a> Journal of Visualized Experiments. (152), e60168(2019).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

היכולת למדל את התפתחות המוח הקטן האנושי במבחנה חשובה למידול מחלות, כמו גם לקידום ההבנה של התפתחות מוחית תקינה. פרוטוקולים פחות מסובכים וחסכוניים יוצרים יותר הזדמנויות ליצירת נתונים הניתנים לשכפול וליישום נרחב במעבדות מדעיות מרובות. פרוטוקול הבחנה של המוח הקטן מתואר כאן באמצעות שיטה שונה של יצירת EBs שאינה דורשת אנזימים או סוכני דיסוציאציה, תוך שימוש בגורמי גדילה המדווחים על ידי Muguruma et al. 4 ופרוטוקול גידול תאים חד-שכבתי דו-ממדי שונה בדומה לשיטה של Holmes et al. <sup...

הבנת התפתחות המוח הקטן האנושי וחלונות הזמן הקריטיים של תהליך זה חשובה לא רק לפענוח הגורמים האפשריים להפרעות נוירו-התפתחותיות, אלא גם לזיהוי מטרות חדשות להתערבות טיפולית. מידול התפתחות המוח הקטן האנושי במבחנה היה מאתגר, אך עם הזמן, פרוטוקולים רבים המבדילים בין תאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) או iPSCs עם גורלות שושלת המוח הקטן התגלו 1,2,3,4,5,6,7,8 . יתר על כן, חשוב לפתח פרוטוקולים המניבים תוצאות הניתנות לשחזור, הם פשוטים יחסית (כדי להפחית טעויות), ואינם כבדים בעלויות כספיות.
הפרוטוקולים הראשונים להתמיינות המוח הקטן נוצרו מתרביות דו-ממדיות מגופים עובריים מצופים (EBs), מה שגרם לגורל המוח הקטן עם גורמי גדילה שונים הדומים להתפתחות in vivo, כולל WNT, BMPs ו-FGFs 1,9. פרוטוקולים שפורסמו לאחרונה גרמו להבחנה בעיקר בתרבית אורגנואידית תלת-ממדית עם FGF2 ואינסולין, ולאחר מכן FGF19 ו-SDF1 עבור מבנים דמויי שפתיים רומביים3,4, או השתמשו בשילוב של FGF2, FGF4 ו-FGF85. שתי שיטות האינדוקציה האורגנואידית של המוח הקטן הביאו לאורגנואידים תלת-ממדיים דומים של המוח הקטן, שכן שני הפרוטוקולים דיווחו על ביטוי דומה של סמן המוח הקטן בנקודות זמן זהות. הולמס והיינה הרחיבו את פרוטוקול 5 התלת-ממדישלהם כדי להראות שתאי המוח הקטן הדו-ממדיים יכולים להיווצר מתאי גזע עובריים ו-iPSCs, שמתחילים כאגרגטים תלת-ממדיים. בנוסף, Silva et al.7 הראו כי תאים המייצגים נוירונים בוגרים במוח הקטן בדו-ממד יכולים להיווצר בגישה דומה להולמס והיינה, תוך שימוש בנקודת זמן שונה למעבר מתלת-ממד לדו-ממד ולהארכת זמן הגדילה וההתבגרות.
הפרוטוקול הנוכחי גורם לגורל המוח הקטן ב-iPSCs נטולי הזנה על ידי יצירת גופים עובריים צפים חופשיים (EBs) באמצעות אינסולין ו-FGF2 ולאחר מכן ציפוי ה-EBs על כלים מצופים אש"ף/למינין ביום ה-14 לגדילה והתמיינות דו-ממדית. עד יום 35, תאים עם זהות cerebellar מתקבלים. היכולת לשחזר את השלבים המוקדמים של התפתחות המוח הקטן, במיוחד בסביבה דו-ממדית, מאפשרת לחוקרים לענות על שאלות ספציפיות הדורשות ניסויים עם מבנה חד-שכבתי. פרוטוקול זה מקובל גם על שינויים נוספים כגון משטחים מיקרו-מפוסלים, מבחני צמיחה אקסונאליים ומיון תאים כדי להעשיר את אוכלוסיות התאים הרצויות.

<table><tbody><tr><td>10 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-26D</td><td></td></tr><tr><td>1-תיאו-גליצרול</td><td>סיגמא</td><td>M6145</td><td></td></tr><tr><td>2 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-26B</td><td></td></tr><tr><td>250 מ"ל יחידת סינון, 0.2 ומיקרו; m aPES, 50 מ"מ קוטר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>FB12566502</td><td></td></tr><tr><td>35 מ"מ אחיזה קלה רקמות צלחת</td><td>בז</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>4D יחידת ליבת נוקלאופקטור</td><td>לונזה</td><td>276885</td><td>נוקלאופקטור</td></tr><tr><td>5 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-25D</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ אחיזה קלה צלחת תרבית</td><td>רקמות פלקון</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>6 בארות לוחות חיבור נמוכים במיוחד</td><td>קורנינג</td><td>3471</td><td></td></tr><tr><td>9 אינץ' צנרת פסטר חד פעמית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13-678-20D</td><td></td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>Sigma</td><td>T1147</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A9418</td><td></td></tr><tr><td>מים בדרגת תרבית תאים</td><td>Cytiva</td><td>SH30529.02</td><td></td></tr><tr><td>תרכיז שומנים מוגדר כימית</td><td>Gibco</td><td>11905031</td><td></td></tr><tr><td>Chroman 1</td><td>Cayman</td><td>34681</td><td></td></tr><tr><td>Class II, סוג A2, ארון בטיחות ביולוגי</td><td>NuAire, Inc.</td><td>מכסה מנוע NU-540-600</td><td>, אור UV</td></tr><tr><td>צלחת Costar 24 בארות,</td> צלחת 6 בארות <td>Corning</td><td>3526</td><td></td>Costar מטופלת</tr> TC<tr>,<td></td><td>תמיסת Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td> מטופלת <td>TC Thermo Scientific</td><td>62248</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO (סולפוקסיד דימתלי)</td><td>Sigma</td><td>D2438</td><td></td></tr><tr><td>DPBS+/+</td> <td>Gibco</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Emricasan</td><td>Cayman</td><td>22204</td><td></td></tr><tr><td>Epi5 ערכת תכנות מחדש iPSC אפיזומלית</td><td>Life Technologies</td><td>A15960</td><td></td></tr><tr><td>Essential 8-Flex</td><td>Gibco</td><td>A2858501</td><td>מדיום PSC עם מערכת הדמיה FGF2 EVOS XL יציבה בחום</td></tr> Life <tr><td>Technologies</td><td></td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי - Premium Select</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>FGF2</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td></td></tr><tr><td>תוסף GlutaMAX</td><td>תוסף Gibco</td><td>35050061</td><td>L-אלנין-L-גלוטמין</td></tr><tr><td>תערובת התזונה של Ham's F12</td><td>Gibco</td><td>11765054</td><td></td></tr><tr><td>חממת CO2 HERAcell VIOS 160i</td><td>Thermo Scientific</td><td>50144906</td><td></td></tr><tr><td>אנושי אנטי-EN2, עכבר</td><td>סנטה קרוז ביוטכנולוגיה</td><td>sc-293311</td><td></td></tr><tr><td>אנושי אנטי-Ki67/MKI67, ארנב</td><td>R& D Systems</td><td>MAB7617</td><td></td></tr><tr><td>אנושי anti-PTF1a, ארנב</td><td>Novus Biologicals</td><td>NBP2-98726</td><td></td></tr><tr><td>אנושי anti-TUBB3, עכבר</td><td>Biolegend</td><td>801213</td><td></td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440053</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>Gibco</td><td>12585</td><td></td></tr><tr><td>למינין חלבון עכבר</td><td>Gibco</td><td>23017015</td><td></td></tr><tr><td>מטריג'ל מטריצת</td><td>קורנינג</td><td>354234</td><td>מטריצת ממברנה מרתף</td></tr><tr><td>MEM-NEAA</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td></td></tr><tr><td>מיני צנטריפוגה</td><td>Labnet International</td><td>C1310</td> ערכת ניקוי <td>מיני צנטריפוגה</td></tr><tr><td>Monarch RNA (50 ומיקרו; ז)</td> <td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>T2040</td><td>עמודות סיבוב סיליקה</td></tr><tr><td>Monarch Total RNA Miniprep Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>T2010</td><td>עמודות ספין סיליקה</td></tr><tr><td>תוסף N-2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>מדיום נוירובזאלי</td><td>Gibco</td><td>21103049</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>PFA 16%</td> <td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>15710</td><td></td></tr><tr><td>תוסף פוליאמין</td><td>סיגמא</td><td>P8483</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-אורניתין (PLO)</td> <td>סיגמא</td><td>3655</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>SB431542</td><td>סיגמא</td><td>54317</td><td></td></tr><tr><td>ראה דרך שקיות הניתנות לסגירה עצמית</td><td>Steriking</td><td>SS-T2 (90x250)</td> <td>שקיות חיטוי</td></tr><tr><td>נתרן ציטראט דיהידרט&nbsp;</td>מסנני מזרק <td>Fisher Scientific</td><td>S279-500</td><td></td></tr><tr><td>, סטריליים, PES 0.22 ומיקרו; m, 30 מ"מ Dia</td><td>Research Products International</td><td>256131</td><td></td></tr><tr><td>Trans-ISRIB</td><td>Cayman</td><td>16258</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>פנול וגואנידין איזותיוציאנט</td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzyme (1x)</td><td>Gibco</td><td>12604039</td><td>מגיב דיסוציאציה של תאים&nbsp;</td></tr><tr><td>אוסמומטר לחץ אדים</td><td>Wescor, Inc.</td><td>דגם 5520</td><td>אוסמומטר</td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>Biogems</td><td>1293823</td><td></td></tr></tbody></table>

מידול התפתחות המוח הקטן האנושי במבחנה במבנה דו-ממדי

Modeling Human Cerebellar Development In Vitro in 2D Structure

ההתפתחות המדויקת והמתוזמנת של המוח הקטן חיונית לא רק לתיאום ואיזון מוטורי מדויקים אלא גם לקוגניציה. בנוסף, הפרעה בהתפתחות המוח הקטן מעורבת בהפרעות נוירו-התפתחותיות רבות, כולל אוטיזם, הפרעת קשב וריכוז (ADHD) וסכיזופרניה. חקירות של התפתחות המוח הקטן בבני אדם התאפשרו בעבר רק באמצעות מחקרים שלאחר המוות או הדמיה מוחית, אך שיטות אלה אינן מספיקות להבנת השינויים המולקולריים והתאיים המתרחשים ב- vivo במהלך ההתפתחות המוקדמת, כאשר נוצרות הפרעות נוירו-התפתחותיות רבות. הופעתן של טכניקות ליצירת תאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) הנגרמים על ידי בני אדם מתאים סומטיים והיכולת להתמיין מחדש עוד יותר תאי גזע פלוריפוטנטיים לנוירונים סללו את הדרך למודלים חוץ-גופיים של התפתחות מוחית מוקדמת. המחקר הנוכחי מספק צעדים פשוטים לקראת יצירת תאים cerebellar עבור יישומים הדורשים מבנה חד-שכבתי דו-ממדי (2D). תאי Cerebellar המייצגים שלבי התפתחות מוקדמים נגזרים מתאי גזע פלוריפוטנטיים (iPSCs) אנושיים באמצעות השלבים הבאים: ראשית, גופים עובריים מיוצרים בתרבית תלת-ממדית (3D), לאחר מכן הם מטופלים ב-FGF2 ובאינסולין כדי לקדם את מפרט הגורל של המוח הקטן, ולבסוף, הם מובחנים באופן סופי כמונו-שכבה על מצעים מצופים פולי-l-אורניתין (אש"ף)/למינין. לאחר 35 ימים של התמיינות, תרביות תאים צרבלריים שמקורם ב-iPSC מבטאות סמנים של המוח הקטן, כולל ATOH1, PTF1α, PAX6 ו-KIRREL2, מה שמרמז על כך שפרוטוקול זה יוצר מבשרי תאי צרבלר גלוטמטרגיים ו-GABAergic cerebellar, כמו גם אבות של תאי Purkinje. יתר על כן, התאים הממוינים מראים מורפולוגיה עצבית מובהקת והם חיוביים לסמנים אימונופלואורסצנטיים של זהות עצבית כגון TUBB3. תאים אלה מבטאים מולקולות הנחיה אקסונאליות, כולל סמפורין-4C, פלקסין-B2 ונוירופילין-1, ויכולים לשמש מודל לחקר המנגנונים המולקולריים של צמיחת נויריט וקישוריות סינפטית. שיטה זו יוצרת נוירונים במוח הקטן האנושי שימושיים עבור יישומים במורד הזרם, כולל ביטוי גנים, מחקרים פיזיולוגיים ומורפולוגיים הדורשים פורמטים חד-שכבתיים דו-ממדיים.

סקירה כללית של ההבחנה בין המוח הקטן מתלת-ממד לדו-ממד תאים Cerebellar נוצרים החל מ- iPSCs. איור 1A מציג את זרימת העבודה הכוללת ואת התוספת של רכיבים עיקריים לבידול. ביום 0, EBs מיוצרים על-ידי הרמה עדינה של מושבות iPSC (איור 1B) באמצעות פיפטה מזכוכית משוכה ב-CDM המכילה SB431542 ו-Y-27632 ומונחת בלוחות חיבור נמוכים במיוחד. FGF2 נוסף ביום השני. ביום 7, שליש מהמדיום משתנה, ונצפתה היווצרות EB (איור 1C). ביום ה-14, EBs מ...

הפרוטוקול הנוכחי מסביר את יצירתו של מונולאייר דו-ממדי של תאי המוח הקטן מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לחקר השלבים המוקדמים של התפתחות המוח הקטן.

The precise and timely development of the cerebellum is crucial not only for accurate motor coordination and balance but also for cognition. In addition, ...

שיטה זו יכולה לסייע בחקר ההתפתחות המוחית האנושית המוקדמת וכיצד היא עשויה להשתנות בהפרעות נוירופסיכיאטריות. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא יצירת תאי המוח הקטן האנושיים המוקדמים מבחינה התפתחותית במבנה שכבה דו-ממדי מבלי לבצע שלבים מסובכים. זה גם חסכוני.הכנת פיפטות משיכה יכולה להיות מסובכת בהתחלה, אך עם תרגול וזמן, קל יותר למשוך את הפיפטות באופן שיהיה קל יותר לעבוד איתו. התחילו את ההכנה הניסיונית על ידי משיכת פיפטה פסטר באורך 22.9 ס"מ כשני סנטימטרים מתחת לצוואר, מעל מבער הבונזן כדי ליצור שתי פיפטות זכוכית. הצד הדק יותר יהיה קצר בכארבעה סנטימטרים מהצד השני.כופפו את קצות הצד המשוך על הלהבה כדי ליצור R חלק, ואז הניחו את הפיפטות הנמשכות בשרוולים של אוטוקלאב ועקרו אותן באוטוקלאב. ביום אפס, הוסיפו מיליליטר אחד של מדיום התמיינות המוח הקטן בתוספת 10 מיקרומולר Y-27632 ו- SB-431542 לכל באר של שש בארות חיבור אולטרה-נמוך, או ULA, צלחת, והניחו אותו באינקובטור עד שהמושבות המורמות מוכנות להוספה לבארות. נקו את התאים הממוינים באמצעות פיפטה מזכוכית משוכה.שאפו את המדיום והוסיפו מילימטר אחד של תמיסת מעבר iPSC עבור כל צלחת של 35 מילימטר. לאחר שלוש דקות של דגירה ב-37 מעלות צלזיוס, שאפו את המדיום והוסיפו שני מילימטרים של מדיום התמיינות המוח הקטן בתוספת 10 מיקרומולר Y-27632 ו-SB-431542 תחת הגדלה 4x של מיקרוסקופ הפוך של אור מועבר, הרימו את המושבות באמצעות הקצה הכפוף של פיפטה הזכוכית הנמשכת. לאחר הרמת כל מושבה, העבירו בעדינות את כל המושבות לבאר אחת מתוך צלחת ULA בעלת שש הבארות באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר.חזור על תהליך זה עבור כל צלחת iPSC ודגירה של התאים ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. ביום השני, הוסיפו FGF2 לכל באר כדי להתאים ריכוז סופי של 50 ננוגרם למיליליטר. ביום השביעי, לשנות שליש מהמדיום על ידי שאיפה מיליליטר אחד של בינוני בילה ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד של מדיום הבחנה cerebellar טרי.לדגור על גופות העוברים במשך שבעה ימים. ביום ה-14, סובבו את הצלחת כדי לאסוף את כל גופי העובר במרכז הצלחת. לאחר מכן הטה את הצלחת ושאף את כל המדיום בילה באמצעות פייפטר 1000 microliter מהקצה.ככל שהכמות הבינונית פוחתת, לאט לאט מניחים את הצלחת שטוחה וממשיכים לשאוף, משאירים מספיק בינוני כדי להימנע מלמשוך את גופי העובר החוצה. לאחר מכן, להוסיף שלושה מיליליטר של מדיום הבחנה cerebellar טרי בתוספת 10 micromolar Y-27632. לאחר מכן מעבירים את גופי העובר באמצעות פיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר לצלחת מצופה פולי-L-אורניתין למינין.ביום 15, שאפו את המדיום והחליפו אותו במדיום הבחנה cerebellar טרי. ביום האפס, מושבות iPSC נוקו והוסרו למדיום התמיינות המוח הקטן המכיל SB-431542 ו- Y-27632 והוכנסו ללוחות חיבור נמוכים במיוחד ליצירת גופים עובריים. התוספת של FGF2 ביום השני ושינוי של 1/3 מדיום ביום השביעי הביאו לכך שגופים עובריים הראו הגדלה ביום ה-14.תאים החלו לנדוד החוצה מגופי העובר לאורך המשטח המצופה ביום ה-15. השינוי המוחלט של מדיום ההבשלה של המדיום לתווך המוח הקטן מהיום ה-21 הביא לחד-שכבתי של תאים עם מורפולוגיה דמוית נוירונים ומורכבות עד היום ה-35. ניתוח ביטוי הגנים ביום ה-35 גילה כי התאים מבטאים סמני אב מוקדמים של המוח הקטן כגון אבות גלוטמטרגיים, ATOH1, אבות GABAergic, אלפא PTF1, וסמני תאי האב של Purkinje KIRREL2 ו-SKOR2.בנוסף, נצפו גם הביטוי של סמן שפתיים רומבי OTX2 ובעיקר נוירון קדמי ספציפי SIX3. התיוג האימונופלואורסצנטי של התאים שנקטפו ביום ה-35 הראה כתמים חיוביים עבור סמני המוח הקטן EN2 ו-PTF1 אלפא, הסמן העצבי בטא טובולין III וסמן ההתרבות KI67. צביעה גרעינית עם 4'6-דיאמידינו-2-פנילינדול, או DAPI, הראתה גרעיני תאים.כדי לקבל בידול מוצלח, חשוב להתחיל עם מושבות iPSC בריאות ולא מובחנות ולהשתמש בריאגנטים ששוחזרו מחדש ככל האפשר.

modeling-human-cerebellar-development-in-vitro-in-2d-structure

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים פרוטוקול להבחנה של תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם לאבות המוח הקטן. זה כרוך בהעברת מושבות תאי גזע ללוחית התקשרות נמוכה במיוחד ליצירת גופים עובריים, קידום התמיינות עם גורמי גדילה, ולאחר מכן העברת גופי העובר לצלחת מצופה מטריצה להידבקות. השלבים הבאים כוללים גרימת נדידת תאים והוספת מדיום הבשלה כדי להנחות את התפתחותם של מבשרי תאי עצב גלוטמטרגיים ו- GABAergic cerebellar ואבות תאי Purkinje.

טכניקה ליצירת מונושכבה דו-ממדית של תאי המוח הקטן מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

סרטון זה מדגים את יצירתו של מודל פגיעה עצבית בנוירונים ראשוניים של גרגרי המוח הקטן בעכברים. הוא מתאר את השלבים המעורבים בגרימת פגיעה עצבית באמצעות NMDA, אגוניסט קולטן נוירוטרנסמיטר מעורר, וגליצין, אגוניסט משותף. NMDA וגליצין נקשרים לקולטנים עצביים ספציפיים, גורמים לגירוי יתר שלהם וכתוצאה מכך זרם סידן תוך תאי מסיבי, מה שמוביל לנזק לתאי עצב ולמוות.

מידול פגיעה עצבית בתאי עצב גרגיריים צרבלריים ראשוניים בעכבר

השכבה החיצונית של המוח הקטנה הגרגר היא האתר של ההגברה המעבר הגדולה ביותר במוח המתפתח. כאן, אנו מציגים פרוטוקול למקד שינוי גנטי לשכבה זו בשיאו של שגשוג באמצעות vivo electroporation והתרבות של פרוסות המוח הקטן לשעבר מעובר חומוס עוברי יום 14.

אקס תרבות Vivo של פרוסות המוח הקטן אפרוח וממוקד מרחבית Electroporation של מבשרי תא גרגיר

פרוטוקול זה מתאר שיטה פשוטה עבור בידוד ואת culturing נוירונים גרגר מוחי העכבר הראשי (CGNs) מן הגורים בת 6-7 יום, התמרה חושית יעילה של CGNs להפסד ורווח של תפקוד לימודי, דגמי NMDA-induced excitotoxicity עצביים, מוות של תאים נמוך-אשלגן-induced נזק לדנ א, לחץ חימצוני באמצעות המודל באותה תרבות.

מידול מוות עצביים והתנוונות בנוירונים גרגר אסטרוציטומה העיקרי העכבר

אנו מתארים מדיום פרוטוקול מוגדרים hPSCs, באמצעות בידול 3D פשוטה, צמצום גורמי גדילה, מסוגל לייצר תא אגרגטים במבנים neuroepithelial מוקדם וחיובי אסטרוציטומה הקשורים סמנים, כמו גם אפשרי נוסף שינוי 2D עבור המבדילים תאים כמו טפט ליצירת נוירונים פונקציונלי.

פרוטוקול בידול אסטרוציטומה 3D יעיל בשינוי 2D אופציונלי

כאן אנו מציגים שיטה להכין organotypic פרוסה תרבויות מן המוח הקטן העכבר מיאלין, צביעת על-ידי אימונוהיסטוכימיה מתאים לחקור מנגנונים של myelination ו- remyelination במערכת העצבים המרכזית.

Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה

פרוטוקול זה מתאר מערכת תרבות דינמית כדי לייצר אגרגטים גודל מבוקר של תאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ולעורר עוד יותר בידול באורגנואידים המוח הקטן תחת תנאים מוגדרים כימית ונטול מאכיל באמצעות bioreactor חד-שימוש.

דור מדרגי של אורגנואידים המוח הקטן בוגר מתאי גזע פלורופוטנטיים אנושיים ואפיון על ידי אימונוסטיין

כאן אנו מתארים שיטה לדמיין סינפטוגנזה של נוירונים גרגיריים במוח הקטן של העכבר במהלך הזמן של התפתחות המוח לאחר הלידה, כאשר תאים אלה משכללים את המבנים הסינפטיים שלהם ויוצרים סינפסות כדי לשלב את עצמם במעגל המוח הכולל.

שימוש באלקטרופורציה לאחר הלידה של In Vivo לחקר מורפולוגיה של נוירון גרגיר המוח הקטן והתפתחות סינפסה

אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים ליצירה ואפיון של תאים גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים המושרים על ידי בני אדם (hIPSC) מודלים מבוססי התפתחות ניאוקורטית, כמו גם מתודולוגיות משלימות המאפשרות ניתוח איכותי וכמותי של ביוגניזיס סיליום ראשוני (PC) ותפקוד.

מודלים מבוססי תאי גזע פלוריפוטנטיים דו-ממדיים ותלת-ממדיים אנושיים לניתוח מעורבות סיליום ראשוני במהלך התפתחות ניאוקורטיקלית

סרט הווידאו הזה מדגים שיטה לנתח ותרבות נוירונים commissural מחוט השדרה הגבי E13 חולדה. נוירונים commissural ניתק מועילים כדי ללמוד את המנגנונים תאית ומולקולרית של צמיחה האקסון והדרכה.

Dissection והתרבות של נוירונים Commissural מחוט השדרה עובריים

חקור מודל דו-ממדי של התפתחות המוח הקטן האנושי מתאי גזע iPSCs. שיטה זו מאפשרת חקר מנגנוני פיתוח מוחיים והשלכותיהם להפרעות נוירופסיכיאטריות בצורה פשוטה וחסכונית.

מידול התפתחות המוח הקטן האנושי במבחנה במבנה דו-ממדי

גלה סרטונים נוספים