כימות רנ"א מעגלי באמצעות טיפות דיגיטליות PCR

dd-PCR היא שיטה רגישה ומדויקת ביותר לכימות מוחלט של דנ"א מטרה או RNA. הוא שימש לאבחון מחלות כאשר שיטות קונבנציונליות אחרות אינן מצליחות לתת תוצאות מדויקות. dd-PCR היא הטכניקה הרגישה ביותר לאיתור מולקולות של חומצות גרעין בשפע נמוך מאוד.

שלא כמו PCR כמותי, dd-PCR אינו דורש כל בקרת גנים ביתית לכימות. בשל רגישותו ודיוקו, dd-PCR יכול לשמש ככלי לאבחון מולקולרי ולמחקר הכולל מולקולות RNA בשפע נמוך כמו מיקרו-רנ"א ו-RNA מעגלי. לפני השימוש ב-dd-PCR, יש לבצע RT-PCR או RT-qPCR כדי לאשר שהפריימרים מגבירים את גני המטרה שלהם ללא כל הגברה לא ספציפית של PCR.

כדי להתחיל, הכינו תבנית PCR רצף של 200 נוקלאוטידים באורך על ידי צירוף 100 הנוקלאוטידים האחרונים של אורך רצף הרנ"א המעגלי הכולל ל-100 הנוקלאוטידים הראשונים של רצף הרנ"א המעגלי. השתמש ברצף התבניות עבור פריימר, שעוצב על-ידי כלי האינטרנט Primer 3. קח מנה אחת בגודל 10 ס"מ המכילה כ-5 מיליון תאי מיובלסט C2C12 מתרבים ומיוטיוב C2C12 מובחן אחד לארבעה ימים לבידוד RNA.

לשטוף את התאים עם 10 מיליליטר של 1X PBS שלוש פעמים ולהשליך את PBS באמצעות פיפטה. מוסיפים מיליליטר אחד של מגיב בידוד RNA ומניחים את התאים על ידי פיפטינג נמרץ. לאחר מכן, הוסף 200 מיקרוליטרים של כלורופורם ומערבולת למשך 15 שניות.

צנטריפוגה את הצינור בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות ב 12, 000 G.קח 400 microliters של השכבה המימית העליונה, לטעון אותו על עמוד סיליקה, צנטריפוגה במשך דקה אחת ב 12, 000 G בטמפרטורת החדר. קח את הזרימה דרך צינור חדש ולהוסיף 600 microliters של 100% אתנול. מוסיפים 20 מיקרוליטרים של חרוזי סיליקה מגנטיים ומניחים את הצינור על תרמומיקסר, שנקבע ב 25 מעלות צלזיוס ו 1, 200 סל"ד במשך חמש דקות.

לאחר מכן, הנח את הצינור על מעמד מגנטי למשך 30 שניות או עד שהתמיסה תתבהר. השהה את חרוזי הסיליקה המגנטיים ב-500 מיקרוליטרים של חיץ רחצה המכיל 90% אתנול. לאחר הנחת הצינור על המעמד המגנטי למשך 30 שניות, תנו לחרוזים להתיישב לכיוון המגנט והשליכו את החיץ באמצעות פיפטה.

אוויר לייבש את הצינור ב 50 מעלות צלזיוס במשך שלוש דקות על thermomixer, שמירה על המכסה פתוח. מוסיפים 20 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז ומשעים את החרוזים. אסוף את הרנ"א המומס בצינור חדש להערכת כמות ואיכות באמצעות ספקטרופוטומטר.

מדוד את ריכוז הרנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר וקח מיקרוגרם אחד של RNA לסינתזת cDNA. מערבבים מיקרוגרם אחד של רנ"א כולל עם מיקרוליטר אחד של תערובת dNTP, ארבעה מיקרוליטרים של מאגר טרנסקריפטאז הפוך 5X, שני מיקרוליטרים של פריימר אקראי של 10X טרנסקריפטאז הפוך, 0.25 מיקרוליטרים של אנזים טרנסקריפטאז הפוך, ו-0.5 מיקרוליטרים של מעכב RNase. הרכיבו את הנפח ל-20 מיקרוליטרים באמצעות מים נטולי נוקלאז.

מניחים את הצינור על 25 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות, ואחריו 50 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. לאחר מכן מניחים את הצינור ב 85 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות כדי להשבית את האנזים. הגדר את תגובת ה- PCR של 22 מיקרוליטר בצינורות או רצועות PCR של 0.2 מיליליטר, יחד עם צינור בקרה שלילי וצינורות בקרה שאינם תבנית.

הוסף 11 מיקרוליטרים של תערובת מאסטר dd-PCR, 5.5 מיקרוליטרים של תערובת פריימר מעגלית ספציפית ל-RNA קדימה ואחורה של ריכוז מיקרומולרי אחד, ו-5.5 מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז כדי להגדיר את צינורות התגובה של NTC. באופן דומה, כדי להגדיר את מבחנות התגובה, הוסף 11 מיקרוליטרים של תערובת מאסטר dd-PCR, 5.5 מיקרוליטרים של תערובת פריימר RNA מעגלית ספציפית קדימה ואחורה של ריכוז מיקרומולרי אחד, ו-5.5 מיקרוליטרים של cDNA. עבור דור הטיפות, העבר 20 מיקרוליטרים של תערובת ה- PCR מצינורות PCR של 0.2 מיליליטר לבארות הדגימה של מחסנית מחולל הטיפות.

הוסף 70 מיקרוליטר של שמן לייצור טיפות לבארות הנפט של מחסנית מחולל הטיפות בזהירות, באמצעות פיפטה. כסו את מחסנית מחולל הטיפות באטם גומי והניחו אותה במכונת מחולל הטיפות כדי לקבל את תערובת טיפות השמן לדוגמה, שנוצרה בבארות הטיפות של המחסנית. להגברת PCR, העבירו 40 מיקרוליטרים של תערובת טיפות השמן לדוגמה מבארות הטיפות של מחסנית מחולל הטיפות לצלחת PCR של 96 בארות באמצעות פיפטה.

אטמו את לוחית ה-PCR בעלת 96 הבארות עם איטום רדיד אלומיניום. הנח אותו בבלוק מכונת איטום הצלחות, שחומם מראש ב-180 מעלות צלזיוס, ולחץ על איטום לאיטום צלחת ה-PCR. לאחר מכן, הניחו את הצלחת במחזור התרמי dd-PCR והגדירו את טמפרטורת המכסה ל -105 מעלות צלזיוס וקצב רמפה לשתי מעלות צלזיוס לשנייה.

לאחר סיום ה-PCR, הניחו את הצלחת על מכונת מונה הטיפות dd-PCR כאשר מחזיק הצלחת נמצא במיקום הנכון לספירת הטיפות. פתח את תוכנת ניתוח הטיפות והגדר את הריצה על ידי מתן קלט של המידע לדוגמה. לחץ על כפתור הניתוח כדי לנתח את הנתונים לאחר השלמת קריאת הטיפות.

לאחר מכן, לחץ על משרעת 1D כפתור כדי לראות את הטיפות החיוביות והשליליות. כדי להפריד בין הטיפות החיוביות לבין הטיפות השליליות, שים קו סף משותף לכל הדגימות עם אותה מטרה. לחץ על לחצן הייצוא כדי לייצא את נתוני ספירת הרנ"א המעגלית כקובץ csv.

הנתונים המיוצאים מראים את מספר הרנ"א המעגלי הקיים בכל דגימה. חשב באופן ידני את מספר ה-RNA המעגלי בכל דגימה לכל ננוגרם של RNA על-ידי התחשבות בכמות הכוללת של cDNA המשמשת בכל תגובה. ניתוח הנתונים באמצעות תוכנת QuantaSoft מוצג כאן.

כל הדגימות למעט MT1 הראו יותר מ -12, 000 ספירות טיפות. מכיוון שספירת הטיפות הכוללת הייתה נמוכה ב- MT1, מדגם זה לא נלקח בחשבון לניתוח הנתונים הסופי. באופן מעניין, היה הבדל ברור בתבנית הביטוי של Circ B ו- C2 במצב המיוטוב המובחן בארבעה ימים בהשוואה לתאי המיאובלסט.

הניתוח של שפע Circ B ו- C2 במונחים של מספר עותק, הצביע על כך שלשלושת ההעתקים של מיובלסטים C2C12 היו 76.8, 67 ו-46 עותקים לכל ננוגרם של RNA, בעוד שלשתי דגימות המיוטיוב היו 558 ו-610 עותקים לכל ננוגרם של RNA. הנתונים בגרף העמודות מייצגים את סטיית התקן הממוצעת פלוס מינוס של שניים עד שלושה שכפולים ביולוגיים. ddPCR היא אחת השיטות המתקדמות ביותר למדידת הביטוי הדיפרנציאלי המדויק של RNA מעגלי מטרה.

שיטה זו תהיה כלי חיוני להאצת מחקר RNA מעגלי ותעשיות אבחון בשנה הקרובה.