קביעת משך שלב S באמצעות שילוב 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין בסקרומיצס cerevisiae

פרוטוקול זה מאפשר קביעה מדויקת של משך שלב ה-S בתאי שמרים ניצנים מסונכרנים. זוהי שיטה מהירה, קלה וניתנת לשחזור. בנוסף, הוא רגיש מספיק כדי לזהות פגמים קלים בסינתזה שלא זוהו על ידי פרוטוקולים קלאסיים.

שיטה זו תהיה שימושית עבור חוקרים רבים העובדים על ויסות מחזור התא בשמרים ניצנים. מי שידגימו את הפרוטוקול הזה יהיו ניקולס טאלארק, חוקר בכיר, וחואן דה דיוס ברבה טנה, דוקטורנט במעבדה. חיסון תאי Saccharomyces cerevisiae ב-10 מיליליטר של SC בינוני בריכוז תאים נמוך לתרבית לילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה מסלולית ב-130 סיבובים לדקה.

למחרת, לדלל את התאים ב 20 מיליליטר של מדיום SC טרי בריכוז סופי של שניים עד שלושה פעמים 10 עד שישה תאים למיליליטר. ב-40 מיקרוליטרים של מיליגרם אחד למיליליטר אלפא פקטור מדולל במים. לאחר מכן תרבית את התאים ב 30 מעלות צלזיוס, עם תסיסה מסלולית ב 130 סיבובים לדקה במשך שעה אחת.

חזור על שלב זה פעם אחת. דמיינו את התאים תחת מיקרוסקופ אור כדי לעקוב אחר מעצר G1. המשך אם יותר מ-90% מהתאים מציגים shmoo, והאחרים הם תאים מעוגלים שאינם מעוגלים.

צנטריפוגה את הדגימות במשך שלוש דקות ב 1, 500 G.ואז להשליך את supernatant עם פיפטה ואקום להשעות את התאים ב 20 מיליליטר של מדיום SC. חזור על שלב זה פעם אחת. אסוף מיליליטר אחד של תאים פעמיים כל חמש דקות והמשך לתיוג EDU.

הוסף 400 מיקרוליטר של גורם אלפא 30 דקות לאחר השחרור. העבר מיליליטר אחד של תרבית התאים לצינור מיקרופוגה של שני מיליליטר המכיל מיקרוליטר אחד של 10 מילימילר EDU, מעורבב היטב על ידי היפוך. כדי להבחין בין התאים החיוביים של EDU לבין התאים השליליים של EDU על עובדות דו-הוריות של Pi EDU, העבר מיליליטר אחד נוסף של תרבית תאים לצינור מיקרופוגה של שני מיליליטר המכיל מיקרוליטר אחד של DMSO.

לדגור במשך שלוש עד חמש דקות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס תחת תסיסה באמבט מים רועד. עצור את התגובה על ידי הוספת 100 מיקרוליטרים של 100% אתנול. גלולה את התאים במשך שתי דקות ב 10, 000 גרם במיקרופוגה.

הסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה ואקום. החזירו את כדור התא ב-500 מיקרוליטרים של 70% אתנול, וערבבו היטב על ידי מערבולת. השאירו את הדגימות בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת לפחות ב-20 הטיות לדקה על נדנדה במהירות משתנה כדי לחדור לתאים.

גלולה את התאים במשך שתי דקות ב 10, 000 G ב microcentrifuge ולהשליך את supernatant עם פיפטה ואקום. לשטוף את התאים פעמיים עם 500 microliters של 10% אתנול ו- PBS. גלולה את התאים במשך שתי דקות ב 10, 000 G ב microfuge ולהשליך את supernatant עם פיפטה ואקום.

יש להשהות את הגלולה ב-200 מיקרוליטרים של PBS המכילים RNase A ו-Proteinase K.Inggate בין שעה לשעתיים בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס עם רעידות מזדמנות, או למשך הלילה ב-37 מעלות צלזיוס. גלולה את התאים במשך שתי דקות ב 10, 000 G בצנטריפוגה מיקרו ולהשליך את supernatant עם פיפטה ואקום. לשטוף את התאים עם 500 microliters של PBS.

לאחר מכן גלולו את התאים והשליכו את הסופרנטנט כפי שהוכח קודם לכן. יש להשעות את גלולת התא ב-200 מיקרוליטרים של PBS עם 1% BSA. לדגור במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן גלולו את התאים, השליכו את הסופר-נטנט כפי שהוכח קודם לכן, והחזירו את הכדור ב-300 מיקרוליטרים של PBS המכילים 1% BSA. להפיץ את התאים לתוך שני, 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge. הראשון צריך להכיל 200 מיקרוליטר של תרבית תאים לתגובת קליק, והצינור השני צריך להכיל 100 מיקרוליטרים של תרבית תאים עבור הכתם הירוק של הסיטוקס.

לאחר מכן, גלולו את התאים והשליכו את הסופרנטנט כפי שהוכח קודם לכן. עבור צביעה ירוקה של סיסטוקס, יש לתלות את גלולת התא ב-100 מיקרוליטרים של PBS. לאחר מכן, בהתאם לריכוז התא, העבירו 10 עד 30 מיקרוליטרים לצינור ציטומטר זרימה המכיל 300 מיקרוליטרים של תערובת ירוקה של סיסטוקס.

סוניקו את הדגימות פעמיים למשך שתי שניות באמפליטודה של 40% עד 50% השאירו בחושך עד לעיבוד הדגימות על גבי ציטומטר זרימה. לתגובת הלחיצה, יש להשעות את גלולת התא עם 40 מיקרוליטרים של חיץ צבע אזיד טרי. לדגור בטמפרטורת החדר בחושך במשך 60 דקות.

גלולו את התאים והשליכו את הסופרנטנט כפי שהוכח קודם לכן. ואז לשטוף את התאים שלוש פעמים עם 300 microliters של 10% אתנול PBS. הבא להשעות את התאים ב 100 microliters של 50 מיקרוגרם לכל מיליליטר פרופידיום יודיד ב PBS ולהשאיר במשך 10 דקות בחושך.

בהתאם לריכוז התא, העבר 10 עד 30 מיקרוליטרים של תרחיף התא לצינור ציטומטר זרימה המכיל 300 מיקרוליטרים של 50 מילימולר Tris HCl, pH 7.5. סוניקט פעמיים במשך שתי שניות באמפליטודה של 40 עד 50. השאירו את הדגימות בחושך עד לעיבודן על גבי ציטומטר.

קרא את הדגימות הירוקות של הסיטוקס באמצעות לייזר כחול עירור בגודל 488 ננומטר, ומסנן מעבר של 530 על 30 פסים. קרא את דגימות Bavaria Pi EDU על מגרש נקודה באמצעות לייזר כחול עירור בגודל 488 ננומטר ומסנן מעבר פס 615 על 20 עבור ציר Pi X, ולייזר עירור אדום בגודל 640 ננומטר, מסנן מעבר פס 660 על 20 עבור ציר Y. שלוש אוכלוסיות של תאים נצפו בניתוח הציטומטר EDU Pi הדו-וריאנטי.

בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס, כ-27% מאוכלוסיית התאים היו בשלב G1, 29% בשלב S וכ-44% בשלב G2 פלוס M. בתאים מסונכרנים, משך שלב ה-S עשוי להיות כ-25 דקות, בהתבסס על הזמן שבו תוכן הדנ"א השתנה מ-C אחד לשני C בפרופיל הציטומטר של הזרימה הירוקה של ה-sytox. תיוג דופק EDU קבע במדויק את משך שלב S.

15 דקות לאחר השחרור, זוהה שבריר של תאים חיוביים EDU, המציין את תחילת שלב S. ההתקדמות בשלב S נראתה על ידי ענן התאים שנע כלפי מעלה וימינה בגרף Bavaria Pi EDU. לבסוף, ב-35 דקות מהשחרור, חלק קטן מהתאים היה שלילי ל-EDU, אך עם כמות כפולה של דנ"א המצביעה על כך ששלב ה-S הסתיים והתאים היו בפאזה G2 פלוס M.

למרות הסנכרון הגבוה שנצפה, חלק מהתאים סיימו את שלב S 60 דקות לאחר השחרור ושלב ה-S הושלם עבור כל האוכלוסייה כ-65 דקות לאחר השחרור. חיוני לבצע סנכרון מושלם ולמנוע כניסת תאים לשלב ה-S השני. ניתן לדמות תאים באמצעות מיקרוסקופ שבו ניתן לנטר ולכמת את ראיית הנולד של שכפול הדנ"א הגרעיני.

טכניקה זו תסייע לזהות מוטנטים מתעלמים שיש להם פגמים קלים בשלב S, כמו גם פגמים במשך מחזור התא.