Name: בידוד של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-02T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 4 s
Description: למדו פרוטוקול ממוטב לבידוד הפטוציטים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים. השיטה שומרת על תאים עתירי שומן ללא צורך בסרכוז מבוסס מפל צפיפות, ומאפשרת מחקר מדויק של תהליכי התחדשות הכבד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית השווייצרית (מענק פרויקט 310030_189262).

<ol><li>Higgins, G., Anderson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+pathology+of+liver.+I.+Restoration+of+liver+of+white+rat+following+partial+surgical+removal%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Pathology+%26+Laboratory+Medicine%22%5BJournal%5D)">Experimental pathology of liver. I. Restoration of liver of white rat following partial surgical removal.</a> Archives of Pathology & Laboratory Medicine. 12, 186-202 (1931).</li>
<li>Taub, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+regeneration%3A+from+myth+to+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Liver regeneration: from myth to mechanism.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 5 (10), 836-847 (2004).</li>
<li>Nevzorova, Y. A., Tolba, R., Trautwein, C., Liedtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Partial+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Animal%22%5BJournal%5D)">Partial hepatectomy in mice.</a> Lab Animal. 49, 1 Suppl 81-88 (2015).</li>
<li>Lehmann, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+failure+after+extended+hepatectomy+in+mice+is+mediated+by+a+p21-dependent+barrier+to+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Liver failure after extended hepatectomy in mice is mediated by a p21-dependent barrier to liver regeneration.</a> Gastroenterology. 143 (6), 1609-1619 (2012).</li>
<li>Makino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+good+model+of+hepatic+failure+after+excessive+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Surgical+Research%22%5BJournal%5D)">A good model of hepatic failure after excessive hepatectomy in mice.</a> Journal of Surgical Research. 127 (2), 171-176 (2005).</li>
<li>Lizardo Thiebaud, M. J., Cervantes-Alvarez, E., Navarro-Alvarez, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLizardo+Thiebaud%2C+MJ+%22Liver+Pathology%22">Liver Pathology</a>. Gayam, V., Engin, O. , IntechOpen. (2019).</li>
<li>Charni-Natan, M., Goldstein, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+primary+mouse+hepatocyte+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Protocol for primary mouse hepatocyte isolation.</a> STAR Protocols. 1 (2), 100086(2020).</li>
<li>Smedsrød, B., Pertoft, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+pure+hepatocytes+and+reticuloendothelial+cells+in+high+yield+from+a+single+rat+liver+by+means+of+Percoll+centrifugation+and+selective+adherence%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Leukocyte+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of pure hepatocytes and reticuloendothelial cells in high yield from a single rat liver by means of Percoll centrifugation and selective adherence.</a> Journal of Leukocyte Biology. 38 (2), 213-230 (1985).</li>
<li>Mederacke, I., Dapito, D. H., Affò, S., Uchinami, H., Schwabe, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+and+high-purity+isolation+of+hepatic+stellate+cells+from+normal+and+fibrotic+mouse+livers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">High-yield and high-purity isolation of hepatic stellate cells from normal and fibrotic mouse livers.</a> Nature Protocols. 10 (2), 305-315 (2015).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+a+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: a biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+rat+liver+cells.+I.+Effect+of+Ca+2%2B+on+enzymatic+dispersion+of+isolated%2C+perfused+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Preparation of rat liver cells. I. Effect of Ca 2+ on enzymatic dispersion of isolated, perfused liver.</a> Experimental Cell Research. 74 (2), 450-454 (1972).</li>
<li>Seglen, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+isolated+rat+liver+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Preparation of isolated rat liver cells.</a> Methods in Cell Biology. 13, 29-83 (1976).</li>
<li>Trotter, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fine+structure+study+of+lipid+in+mouse+liver+regenerating+after+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">A fine structure study of lipid in mouse liver regenerating after partial hepatectomy.</a> Journal of Cell Biology. 21 (2), 233-244 (1964).</li>
<li>Kachaylo, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN+down-regulation+promotes+%CE%B2-oxidation+to+fuel+hypertrophic+liver+growth+after+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">PTEN down-regulation promotes β-oxidation to fuel hypertrophic liver growth after hepatectomy in mice.</a> Hepatology. 66 (3), 908-921 (2017).</li>
<li>Jung, Y., Zhao, M., Svensson, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation%2C+culture%2C+and+functional+analysis+of+hepatocytes+from+mice+with+fatty+liver+disease%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation, culture, and functional analysis of hepatocytes from mice with fatty liver disease.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100222(2020).</li>
<li>Dold, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Portal+hyperperfusion+after+extended+hepatectomy+does+not+induce+a+hepatic+arterial+buffer+response+%28HABR%29+but+impairs+mitochondrial+redox+state+and+hepatocellular+oxygenation%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Portal hyperperfusion after extended hepatectomy does not induce a hepatic arterial buffer response (HABR) but impairs mitochondrial redox state and hepatocellular oxygenation.</a> PLoS One. 10 (11), 0141877(2015).</li>
<li>Boyce, S., Harrison, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+detailed+methodology+of+partial+hepatectomy+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">A detailed methodology of partial hepatectomy in the mouse.</a> Laboratory Animals. 37 (11), 529-532 (2008).</li>
<li>Mitchell, C., Willenbring, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reproducible+and+well-tolerated+method+for+2%2F3+partial+hepatectomy+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">A reproducible and well-tolerated method for 2/3 partial hepatectomy in mice.</a> Nature Protocols. 3 (7), 1167-1170 (2008).</li>
<li>Chen, T., Oh, S., Gregory, S., Shen, X., Diehl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+omics+analysis+reveals+functional+diversification+of+hepatocytes+during+liver+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Single-cell omics analysis reveals functional diversification of hepatocytes during liver regeneration.</a> JCI Insight. 5 (22), (2020).</li>
<li>Chembazhi, U. V., Bangru, S., Hernaez, M., Kalsotra, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+plasticity+balances+the+metabolic+and+proliferation+dynamics+of+a+regenerating+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Cellular plasticity balances the metabolic and proliferation dynamics of a regenerating liver.</a> Genome Research. 31 (4), 576-591 (2021).</li>
<li>Fiegel, H. C., Kaufmann, P. M., Kneser, U., Kluth, D., Rogiers, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Priming+of+hepatocytes+for+cell+culture+by+partial+hepatectomy+prior+to+cell+isolation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Priming of hepatocytes for cell culture by partial hepatectomy prior to cell isolation.</a> Journal of Tissue Engineering. 6 (6), 619-626 (2000).</li>
<li>Roche, <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoche%2C++%22Liberase+TM+Research+Grade%22">Liberase TM Research Grade</a>. , (2020).</li>
<li>Giugliano, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatitis+C+virus+infection+induces+autocrine+interferon+signaling+by+human+liver+endothelial+cells+and+release+of+exosomes%2C+which+inhibits+viral+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Hepatitis C virus infection induces autocrine interferon signaling by human liver endothelial cells and release of exosomes, which inhibits viral replication.</a> Gastroenterology. 148 (2), 392-402 (2015).</li>
<li>Shetty, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Common+lymphatic+endothelial+and+vascular+endothelial+receptor-1+mediates+the+transmigration+of+regulatory+T+cells+across+human+hepatic+sinusoidal+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Immunology%22%5BJournal%5D)">Common lymphatic endothelial and vascular endothelial receptor-1 mediates the transmigration of regulatory T cells across human hepatic sinusoidal endothelium.</a> The Journal of Immunology. 186 (7), 4147-4155 (2011).</li>
<li>Edwards, S., Lalor, P. F., Nash, G. B., Rainger, G. E., Adams, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphocyte+traffic+through+sinusoidal+endothelial+cells+is+regulated+by+hepatocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Lymphocyte traffic through sinusoidal endothelial cells is regulated by hepatocytes.</a> Hepatology. 41 (3), 451-459 (2005).</li>
<li>Helling, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver+failure+following+partial+hepatectomy%5BTitle%5D)+AND+%22HPB%22%5BJournal%5D)">Liver failure following partial hepatectomy.</a> HPB. 8 (3), 165-174 (2006).</li>
<li>Saran, U., Humar, B., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hepatocellular+carcinoma+and+lifestyles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Hepatocellular carcinoma and lifestyles.</a> Journal of Hepatology. 64 (1), 203-214 (2016).</li>
<li>Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar-sweetened+beverage%2C+diet+soda%2C+and+nonalcoholic+fatty+liver+disease+over+6+years%3A+the+Framingham+Heart+Study%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Gastroenteroly+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Sugar-sweetened beverage, diet soda, and nonalcoholic fatty liver disease over 6 years: the Framingham Heart Study.</a> Clinical Gastroenteroly and Hepatology. , (2021).</li>
<li>Pocha, C., Kolly, P., Dufour, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nonalcoholic+fatty+liver+disease-related+hepatocellular+carcinoma%3A+a+problem+of+growing+magnitude%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+Liver+Disease%22%5BJournal%5D)">Nonalcoholic fatty liver disease-related hepatocellular carcinoma: a problem of growing magnitude.</a> Seminars in Liver Disease. 35 (3), 304-317 (2015).</li>
<li>Roeb, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+body+weight+and+metabolic+%28dysfunction%29-associated+fatty+liver+disease+%28MAFLD%29%5BTitle%5D)+AND+%22Visceral+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess body weight and metabolic (dysfunction)-associated fatty liver disease (MAFLD).</a> Visceral Medicine. 37 (4), 273-280 (2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

הפרוטוקול שפורסם מספק שיטה אמינה ופשוטה לבודד תפוקה גבוהה של הפטוציטים מורין רגילים וסטאטוטיים עבור ניתוח חד-תאי במורד הזרם או ניתוח בתפזורת של תאים לאחר מיון FACS. היתרון המובהק על פני טיהור שיפוע צפיפות הוא שלתכולת השומנים התאית אין למעשה השפעה על התפוקה האפקטיבית של הפטוציטים. לפיכך, החלק של hepatocytes steatotic יישמר וייכלל בניתוחים במורד הזרם. זה לא רק חיוני לחקר מחלות כבד סטאטוגניות, אלא גם בעל חשיבות עליונה לכל ניתוח של תהליכים לאחר כריתת כבד גדולה, שבה הפטוציטים מציגים סטאטוזיס דינמי זמני ומרחבי בתוך 2-3 הימים ה...

הכבד יכול לחדש את עצמו גם לאחר אובדן רקמות משמעותי. יכולת התחדשות ייחודית זו מודגמת במפורש על ידי המודל הניסיוני של כריתת כבד חלקית (70%), שתואר לראשונה בחולדות על ידי היגינס ואנדרסון בשנת 19311. במודל זה, 70% מהכבד מוסר בניתוח מבעלי חיים על ידי חיתוך אונות כבד גדולות יותר. האונות הנותרות גדלות באמצעות היפרטרופיה מפצה כדי לשחזר את מסת הכבד המקורית תוך כשבוע לאחר הניתוח, אם כי ללא שחזור של ארכיטקטורת הכבד המקורית 2,3. פותחו כריתות כבד נוספות עם כמויות משתנות של הסרת רקמות, כגון כריתת כבד מורחבת של 86% שבה שארית הכבד קטנה מכדי להתאושש, מה שמוביל בסופו של דבר לאי ספיקת כבד לאחר כריתת הכבד (PHLF) ומוות לאחר מכן אצל 30%-50% מבעלי החיים 4,5,6. מודלים אלה מאפשרים לחקור התחדשות כבד נורמלית ונכשלת, כתלות בכמות הרקמה שנכרתה (איור 1).
למרות מודלים עכבריים של hepatectomies שימשו בהצלחה במשך שנים רבות, רק לאחרונה שיטות אנליטיות מתקדמות יותר אפשרו תובנה עמוקה יותר ברמת התא הבודד. עבור רוב שיטות אלה, עם זאת, נוכחות של hepatocytes בודדים הוא תנאי מוקדם בסיסי. רוב הפרוטוקולים לבידוד של הפטוציטים ראשוניים מבוססים על טכניקת זילוח קולגנאז דו-שלבית וטיהור שיפוע צפיפות לאחר מכן כדי להפריד הפטוציטים קיימא מפסולת ולא פרנכימליים, כמו גם תאים מתים 7,8,9. שיטה זו תוארה לראשונה על ידי ברי ופרנד בשנת 196910 ואומצה על ידי סגלן ועמיתיו בשנת 197211,12. עם זאת, מכיוון שצנטריפוגות הדרגתיות מסתמכות על צפיפות התאים וגודלם, הפטוציטים עמוסי השומנים אובדים לעתים קרובות במהלך טיהור סטנדרטי. בעוד אובדן כזה עשוי להיות זניח עבור שאלות מחקר רבות, זהו היבט מכריע עבור התחדשות הכבד מוקדם. במהלך היומיים הראשונים, הפטוציטים בתוך כבד העכבר המתחדש צוברים שומנים, ובכך גדלים בגודל וטובלים בצפיפות. סטאטוזיס חולף זה הקשור להתחדשות (TRAS) משמש לספק דלק רגנרטיבי והוא זמני, אך חופף חלקית לשלב השגשוג העיקרי ומתפלג באופן לא אחיד בתוך אונות הכבד - היחידות התפקודיות של הכבד13,14. עם זאת, לאחר כריתת כבד ממושכת של 86%, TRAS מתרחש גם הוא אך נמשך, מכיוון שההתחדשות נעצרת והשומנים אינם מחומצנים14. לכן, טיהור הדרגתי של הפטוציטים לאחר כריתת כבד של 70% או 86% יניב שברים לא מייצגים, מכיוון שרוב הפטוציטים עמוסי השומנים אובדים בגלל צפיפותם הנמוכה15.
בפרוטוקול בידוד שונה זה, הפטוציטים מעכברי C57BL/6 מבודדים 24-48 שעות לאחר כריתת הכבד על ידי גישה קלאסית של זילוח collagenase בשני שלבים. בדרך כלל, קנולציה וזילוח של השארית לבידוד תאים נעשים דרך וריד הפורטל. עם זאת, ההתנגדות הפורטו-וסקולרית בשרידים קטנים שנותרו לאחר כריתה גדולה היא גבוהה16, ולכן הזלוף עדין. מכיוון שהווריד קאווה אינו מושפע מכריתת הכבד, ניתן לבצע זילוח בקלות בכיוון הנסיגה באמצעות קנולציה של הווריד הנבוב. משאבה פריסטלטית סטנדרטית מניעה את התמיסות המחוממות דרך הווריד הנבוב התחתון הצנתורי אל שארית הכבד, באמצעות זילוח מדרדר עם זרימה דרך הווריד הפורטלי (איור משלים S1). הפטוציטים מנותקים על ידי collagenases ומשוחררים מהקפסולה של Glisson. לאחר שטיפה ועיבוד זהיר של הפטוציטים קיימא על ידי בידוד הדרגתי באמצעות גישת צנטריפוגה במהירות נמוכה, ניתן להשתמש בהפטוציטים לכל ניתוח במורד הזרם.

<table><tbody><tr><td><חזק>ריאגנטים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 ירוק זומבי</td><td>BioLegend</td><td>423111</td><td>צבע כדאיות תגובתי אמין</td></tr><tr><td>Attane Isoflurane ad us. vet. 99.9%</td> <td>Provet AG</td><td>QN01AB06</td><td>זהירות: זקוק לאוורור</td></tr><tr><td>תמיסת EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E8008-100ML-אתנול</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V001229</td><td>לדלל במים ל-70%</td></tr> <tr><td>סרום בקר עוברי (FCS)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת (HBSS) של Gibco A5256701-Hanks, Ca2+, Mg2+, פנול אדום</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9269-6x600ML</td><td>לעיכול/שימור</td></tr><tr><td>תמיסת מלח מאוזנת של הנקס (HBSS), עם Ca2+, w/o Mg2+, ללא פנול אדום</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648-6x500ML</td><td>עבור תמיסת HEPES של חוצץ זלוף</td></tr><tr><td>, 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83264-100ML-F-Histoacryl</td><td></td></tr> <tr><td>דבק רקמות (בוטיל-2-ציאנואקרילט)</td><td>B. Braun</td><td>1050052</td><td>לייצוב אתר הקנולציה</td></tr><tr><td>Hoechst 33258 תמיסת צבע מכתים</td><td>Abcam</td><td>ab228550</td><td>-</td></tr><tr><td>Liberase Research Grade</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>קולגנאזות ליופיליזציה I/II</td></tr><tr><td>NaCl 0.9% 500 מ"ל Ecotainer</td><td>B. Braun</td><td>123-Paralube</td><td></td></tr> <tr><td>Vet Ointment</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38-Phosphate</td><td></td></tr> <tr><td>Buffered Saline (PBS)</td><td>Gibco</td><td></td> <td>A1286301-Sudan</td></tr> <tr><td>IV &ndash; צביעת ליפידים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td> <td>V001423-Temgesic</td></tr> <tr><td>(בופרנורפין הידרוכלוריד), תמיסה להזרקה 0.3 מ"ג/מ"ל</td><td>Indivior Europe Ltd.</td><td>345928</td><td>סמים. אחסן בצורה מאובטחת.</td></tr><tr><td>טריפן כחול, 0.4%,</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>T8154</td> מסונן <td>סטרילי לספירת תאים</td></tr><tr><td>וויליאמס בינוני E</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4128-500ML-</td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומרים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>25 מ"ל פיפטה סרולוגית, Greiner Cellstar</td><td>Merck</td><td>P7865-50</td><td></td></tr> <tr><td>מ"ל צינורות פלקון</td><td>TPP</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>BD Neoflon, צנתר Pro IV 26 G</td><td>BD Falcon</td><td>מגרד 391349</td><td></td></tr> <tr><td>תאים, רוחב להב מסתובב 25 מ"מ</td><td>TPP</td><td>99004-מסננת</td><td></td></tr> <tr><td>תאים פלקון 100 ומיקרו; m ניילון</td><td>BD Falcon</td><td>352360-וילון</td><td></td></tr> <tr><td>כירורגי סטרילי Fenestrated</td> <td>-</td><td></td> <td>חומר בד לשימוש חוזר</td></tr><tr><td>זרבובית מילוי לגודל 16 # צינורות (מזהה 3.1 מ"מ)</td> <td>Drifton</td><td>FILLNOZZLE #16</td><td>כדי להיכנס לצינורות</td></tr> צינורות <tr><td>ציטומטריית זרימה, 5 מ"ל</td><td>BD Falcon</td> <td>352008-זכר</td><td></td></tr> <tr><td>Luer לדוקרן, מזהה צינורות 3.2 מ"מ</td> צינור חיבור <td>Drifton</td><td>LM41</td><td> למזרק</td></tr><tr><td>צלחות פטרי, 96 x 21 מ"מ</td><td>TPP</td><td>93100-Prolene</td><td></td></tr> <tr><td>5-0</td><td>Ethicon</td><td>8614H</td><td>כדי להחזיר את עצם החזה</td></tr><tr><td>פרולן 6-0</td><td>Ethicon</td><td>8695H</td><td>לתפר עור</td></tr><tr><td>פרולן 8-0</td><td>Ethicon</td><td>EH7470E</td><td>קשירה כיס מרה</td></tr><tr><td>צינור 16#, WT 1.6 מ"מ, ID 3.2 מ"מ, OD 6.4 מ"מ</td><td>Drifton</td><td>SC0374T</td><td>צינור זלוף</td></tr><tr><td><חזק>ציוד</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD LSRמנתח תאים ציטומטר זרימה</td><td>BD</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>מכונת גילוח מכרסמים של איזיס</td><td>Aesculap</td><td>GT421-תחנת</td><td></td></tr> <tr><td>איזופלורן</td><td>Provet</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>צנטריפוגה במהירות נמוכה &ndash; Scanspeed 416</td><td>Labogene</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>תא ספירה משופר של נויבאואר</td><td>מרינפלד</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>רכז חמצן &ndash; אוורפלו</td><td>פיליפס&nbsp;</td><td>1020007</td><td>0 &ndash; 5 ליטר לדקה</td></tr><tr><td>Pipetboy &ndash; פיפטור טורבו-פיקס</td><td>TPP</td><td>94700-משאבת</td><td></td></tr> <tr><td>זלוף שנשן &ndash; YZ1515x</td><td>Shenchen</td><td>YZ1515x-מיקרוסקופ</td><td></td></tr> <tr><td>כירורגי &ndash; SZX9</td><td>אולימפוס</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>מחצלת חימום ThermoLux</td><td>Thermo Lux</td> <td>-</td><td></td></tr> <tr><td>Vortex Genie 2, 2700 UpM</td><td>NeoLab</td><td>7-0092</td> <td>-</td></tr> <tr><td>אמבט מים &ndash; דיוק GP 02</td><td>תרמו מדעי</td><td></td> <td>- כוונון ל 42 & deg; ג</td></tr></tbody></table>

בידוד של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים

Isolation of Regenerating Hepatocytes after Partial Hepatectomy in Mice

כריתת כבד חלקית נמצאת בשימוש נרחב כדי לחקור התחדשות כבד בעכברים, אך הבידוד של יבולים גבוהים של הפטוציטים קיימא עבור יישומים של תאים בודדים במורד הזרם הוא מאתגר. הצטברות ניכרת של שומנים בתוך hepatocytes התחדשות נצפתה במהלך 2 הימים הראשונים של התחדשות כבד נורמלי בעכברים. סטאטוזיס זה המכונה סטאטוזיס הקשור להתחדשות חולפת (TRAS) הוא זמני אך חופף חלקית לשלב ההתרבות העיקרי. טיהור שיפוע צפיפות הוא עמוד השדרה של רוב הפרוטוקולים הקיימים לבידוד של הפטוציטים ראשוניים. מכיוון שטיהור הדרגתי מסתמך על צפיפות התאים וגודלם, הוא מפריד בין אוכלוסיות הפטוציטים שאינם סטאטוטיים לסטאטוטים. לכן, hepatocytes שומן לעתים קרובות הולכים לאיבוד, מניב שברים hepatocyte לא מייצג. 
הפרוטוקול המוצג מתאר שיטה קלה ואמינה לבידוד in vivo של הפטוציטים מתחדשים ללא קשר לתכולת השומנים שלהם. הפטוציטים מעכברי C57BL/6 זכרים מבודדים 24-48 שעות לאחר כריתת הכבד בגישה קלאסית של זילוח collagenase דו-שלבי. משאבה פריסטלטית סטנדרטית מניעה את התמיסות המחוממות דרך הווריד הנבוב התחתון הצנתורי אל תוך השארית, תוך שימוש בטכניקת זילוח מדרדר עם זרימה החוצה דרך הווריד הפורטלי. הפטוציטים מנותקים על ידי collagenase לשחרורם מהקפסולה של גליסון. לאחר שטיפה וצנטריפוגה זהירה, ניתן להשתמש בהפטוציטים לכל ניתוח במורד הזרם. לסיכום, מאמר זה מתאר טכניקה פשוטה וניתנת לשחזור לבידוד אוכלוסייה מייצגת של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים. השיטה עשויה גם לסייע בחקר מחלת הכבד השומני.

TRAS מגיע לשיאו ב -16 שעות לאחר כריתת הכבד ונעלם בהדרגה 32-48 שעות לאחר כריתת כבד סטנדרטית, אך נמשך מעבר ל -48 שעות לאחר כריתת כבד ממושכת. מבחינה מקרוסקופית, TRAS נראה בקלות כגוון עור חיוור של שאריות הכבד (איור 1F), וניתן לצפות בו בעכברים שעברו כריתת כבד בין 16 שעות ל-48 שעות לאחר ניתוח.
התשואה הסופית המשוערת היא 10-15 × 10 6 הפטוציטים לאחר 70%-כריתת כבד ו-4-9 × 106 לאחר כריתת כבד ממושכת של 86% בעכברים, עם כדאיות סופית ממוצעת של 78% ו-65%, בה...

הפטוציטים עמוסי שומנים טבועים בהתחדשות הכבד, אך בדרך כלל הולכים לאיבוד עם צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול בידוד תאים אופטימלי השומר על הפטוציטים סטאטוטיים, ומניב אוכלוסיות מייצגות של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים.

Partial hepatectomy has been widely used to investigate liver regeneration in mice, but the isolation of high yields of viable hepatocytes for downstream ...

המטרה הכוללת של פרוטוקול זה היא להציג שיטה אופטימלית לבידוד הפטוציטים בעכברים לאחר כריתת כבד חלקית ללא צורך בצנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. בדרך כלל אנו רואים אחוז גדול של הפטוציטים עמוסי שומנים במהלך התחדשות מוקדמת. אלה hepatocytes steatotic בדרך כלל לאבד עם צפיפות הדרגתית צנטריפוגה עקב צפיפות נמוכה נשמרים עם פרוטוקול זה.כדי להכין את ציוד הזילוח, חבר צינורית IUI במד 26 לקצה היציאה של הצינור באמצעות מחבר מנעול Luer. לאחר מכן שטפו את הצינור והכניסו את קצה הכניסה של הצינור לצינור חיץ הזילוח שחומם מראש באמבט המים. הקדימו אותו עם חיץ זילוח חם במהירות משאבה של שלושה מיליליטר לדקה.לפני שתמשיך בניתוח, ודא כי העכבר מורדם כראוי. לאחר מכן נקו את הבטן עם תמיסת קרצוף כירורגית ואתנול 70%. לאחר מכן חתכו את התפרים כדי לפתוח מחדש את חתך קו האמצע שנעשה בעבר לכריתת כבד חלקית ומשכו בעדינות את קצוות הפצע זה מזה.אם כריתת הכבד היא מעל 24 עד 48 שעות, להסיר את התפר לחתוך את העור עם מספריים או אזמל. השתמש retractor או קליפסים פשוטים כדי לשמור על הבטן פתוחה. חלל הבטן צריך להיות חשוף ככל האפשר כדי לייעל את הגישה ואת הדמיה.תקן תפר פוליפרופילן 5-0 לחזה. משוך אותו באופן גולגולתי וקבע אותו במצב זה. הזיזו את המעיים ימינה באמצעות צמר גפן סטרילי כדי לחשוף את וריד הפורטל ואת הווריד הנבוב.השתמש במטלית רטובה כדי לשמור ע

isolation-regenerating-hepatocytes-after-partial-hepatectomy

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

הליך זלוף collagenase שני שלבים שונה לבידוד של hepatocytes אדם מתואר. שיטה זו יכולה להיות מיושמת גם לכבדים של יונקים אחרים. Hepatocytes מבודד זמינים בתשואה גבוהה וכדאיות, מה שהופך אותם המודל מתאים למחקר מדעי בתחומים כגון התחדשות כבד, פרמקוקינטיקה וטוקסיקולוגיה.

בידוד של hepatocytes האנושי על ידי שני שלבים Collagenase זלוף נוהל

כלים המשמשים להמחשת התחדשות כלי הדם דורשים שיטות לניגוד עצי כלי הדם. סרט זה הדגים טכניקת הזרקה עדינה המשמשת להשגת ניגודיות אופטימלית של עצי כלי הדם וממחיש את היתרונות הפוטנציאליים הנובעים מניתוח מפורט של הדגימה המתקבלת באמצעות μCT וחתכים סדרתיים היסטולוגיים.

ויזואליזציה של התחדשות כלי דם Parenchymal לאחר 70% חלקיות כריתה בעכברים נורמליים

שכיחות גבוהה של הישנות גידול לאחר כריתה של גרורות בכבד נותרה בעיה לא פתורה. מודל העכבר המאויר עשוי להיות שימושי כדי לחקור את הסיבות להישנות כזו. הוא משלב לראשונה מודל כריתת כבד עם הזרקת תאי גידול תוך כבדיים.

השפעת הכריתה כבדה על צמיחת גידול intrahepatic

כאן, אנו מציגים מודל כבד עכבר אנושי חדש שנוצר בעכברי נוקאאוט של תאים מתווכים של קולטן רעלן Alb (TRECK)/SCID לאחר השתלת תאי גזע כבד אנושיים לא בשלים וניתנים להרחבה.

דור של כבד עכבר אנושי באמצעות תאי גזע אנושי כבדיה

כאן, אנו מציגים גישה האנזימטית לבודד hepatocytes העיקרי של עכברים בוגרים, ואנחנו מתארים כימות של תגובה דלקתית באמצעות ELISA ו- בזמן אמת PCR.

אינדוקציה של תגובה דלקתית בתרבויות Hepatocyte הראשי מעכברים

תארנו פרוטוקול לביצוע חלקי hepatectomy (PHx), השתלת תא באמצעות הטחול ב במנוד ראש. SCID (הנהון. CB17-Prkdcscid/J) עכברים. ב פרוטוקול זה, חתך לחשוף ולאחר נכרות האונה השמאלית של הכבד, ואחריו עוד חתך השתלת intrasplenic של תאים.

השתלת intrasplenic של Hepatocytes לאחר Hepatectomy חלקית ב במנוד ראש. SCID עכברים

כאן, אנו מציגים שיטה חדשה עבור כריתה חלקית של האונה השמאלית הכבד בעכברים neonatal (יום 0). פרוטוקול חדש זה מתאים ללמוד פציעת כבד חריפה ותגובה פציעה בהגדרת neonatal.

Hepatectomy Lobular חלקית: מודל ניתוח עבור התחדשות הכבד מורפולוגיות

פרוטוקול זה מפרט את השימוש בצנתר תוך ורידי מיוחד, צינורות חד פעמיים סטריליים סטנדרטיים, בקרת טמפרטורה בתוספת ניטור בזמן אמת, ומערכת אזעקה להליך זלוף קולגןאז דו-שלבי כדי לשפר את העקביות בכדאיות, בתפוקה ובפונקציונליות של הפטוציטים של חולדה ראשונית מבודדת.

בידוד של הפטוציטים ראשוניים של חולדות עם בקרת זלוף רב-פרמטרית

קישור מחיצת כבד וקשירת ורידים פורטלית לכריתת כבד בשלבים (ALPPS) הוכח כגורם להתחדשות כבד יוצאת דופן לאחר מספר שבועות לאחר ניתוח בשלב הראשון. מודלים של בעלי חיים שעברו ALPPS פותחו כדי לחקור יכולת התחדשות פוטנציאלית של הכבד ולהשיג תוצאות קליניות חיוביות.

מודל עכברי של מחיצת הכבד המשויכת וקשירת ורידים פורטלית להליך כריתת כבד בשלבים בעזרת מיקרוסקופ

מודל העכבר של כריתת כבד חלקית 2/3 (66%) מתואר היטב בספרות, אך לעתים רחוקות נעשה שימוש בכריתת כבד ממושכת יותר המחקה תסמונת קטנה לגודל לאחר השתלת כבד. אנו מתארים הליך מורחב של 78% כריתת כבד במודל עכבר שמביא לכ-50% קטלניות לאחר הניתוח בעכברים בריאים.

כריתת כבד מורחבת של 78% במודל כירורגי עכבר

למדו פרוטוקול ממוטב לבידוד הפטוציטים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים. השיטה שומרת על תאים עתירי שומן ללא צורך בסרכוז מבוסס מפל צפיפות, ומאפשרת מחקר מדויק של תהליכי התחדשות הכבד.

בידוד של הפטוציטים מתחדשים לאחר כריתת כבד חלקית בעכברים

גלה סרטונים נוספים