Name: תרבית תאים IDG-SW3 במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-11-13T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 48 s
Description: למדו פרוטוקול לתרבית תאי IDG-SW3 במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית לחקר אוסטאוגנזה ועיצוב דנדריטים. השיטה משפרת שקיפות הג'ל לצילום מתקדם ומאפשרת ניתוח ביטוי גנים בזמן אמת.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לד"ר לינדה פ. בונוולד על הענקת קו התאים IDG-SW3 במתנה. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82070902, 82100935 ו-81700778) ופרויקט השייט "חדשנות מדעית וטכנולוגית" בשנגחאי (21YF1442000).

פרוטוקול זה מתאים לגידול תאים בארבע בארות של לוחות 24 בארות. אם מכינים מספר דגימות או צלחות, יש להגדיל את כמויות הריאגנטים בהתאם.
1. הכנת תערובת קולגן I
הערה: קולגן I וג'ל מטריצת קרום מרתף במהירות בטמפרטורת החדר. לכן, קולגן צריך להיות מטופל על קרח (2 ° C עד 8 ° C). כל הטיפים והצינורות המשמשים חייבים להיות מקוררים אלא אם כן צוין אחרת. כל ההליכים צריכים להתבצע במכסה מנוע.
<ol><li>מניחים את כל הריאגנטים וצינורות הצנטריפוגות על קרח.</li>
	<li>פיפטה איטית 0.48 מ"ל של קולגן I (5 מ"ג/מ"ל) ו-0.1 מ"ל של 10x מדיום חיוני מינימלי (MEM) (עם פנול אדום) לתוך צינור צנטריפוגה סטרילי של 15 מ"ל השמור על קרח. מערבבים היטב על ידי פיטינג בעדינות למעלה ולמטה.</li>
	<li>על פי לוח הצבעים של מחוון פנול אדום, השתמש בנפח מתאים של 7.5% (w/v) NaHCO3 (כ -0.2 מ"ל) כדי להתאים את מחוון אדום פנול לכתום, המציין כי ערך ה- pH הוא בטווח של 7.0-7.4. הערה: בהתאם ל- pH של המדיום, נפח של NaHCO3 משמש כדי להביא את ה- pH ל- 7.0-7.4 בקירוב. בנוסף, NaOH משמש לנטרול pH.</li>
	<li>הביאו את הנפח הסופי של התערובת עד 1 מ"ל על ידי הוספת נפח מתאים של ddH2O. ערבבו היטב על ידי פיפטציה עדינה למעלה ולמטה כדי להתכונן לשימוש. הערה: הנפח הסופי של ddH2O יהיה תלוי בכמות NaHCO 3 או NaOH בשימוש בשלב1.3 .</li>
</ol>2. הכנת תערובת מטריצת התא
<ol><li>לאט פיפטה 0.9 מ"ל של מטריצת קרום מרתף לתוך צינור צנטריפוגה חדש 15 מ"ל על הקרח.</li>
	<li>תרבית את תאי IDG-SW3 בבקבוק T25 עם 4 מ"ל של תווך מלא (אלפא-MEM המכיל 10% סרום בקר עוברי [FBS]) בתוספת 50 U/mL INF-γ ב 33 ° C.</li>
	<li>ברגע שתאי IDG-SW3 מגיעים למפגש של 90%, הסירו את התווך ושטפו את התאים במי מלח חוצצי פוספט (PBS, pH 7.4 לאורך כל הפרוטוקול) עם פיפטה. לעכל את התאים עם 0.5 מ"ל של 0.25% חומצה טריפסין-ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב 37 ° C במשך 30 שניות.</li>
	<li>נטרל את הטריפסין על-ידי הוספת 3.5 מ"ל של מדיום מלא (אלפא-MEM המכיל 10% נסיוב בקר עוברי [FBS]). העבר את מתלה התא 4 מ"ל לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל.</li>
	<li>סובב את מתלה התא ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשעו מחדש את כדורית התא ב-1 מ"ל של התווך המלא על קרח.</li>
	<li>ספור את התאים באמצעות המוציטומטר והתאם את צפיפות התאים הסופית עם המדיום המלא ל 4 × 105 תאים / מ"ל. הוסף 0.1 מ"ל של השעיית התא מוכן ל 0.9 מ"ל של המטריצה החוץ תאית משלב 2.1. מערבבים היטב על ידי פיפטינג עדין למעלה ולמטה. הערה: אם יש צורך בבקרה נטולת תאים, הוסף 0.1 מ"ל של התווך המלא עד 0.9 מ"ל של מטריצה חוץ-תאית כבקרה שלילית.</li>
</ol>3. ציפוי תערובת התא-ג'ל
<ol><li>בעדינות, מערבבים היטב את שתי התערובות משלב 2.6 ושלב 1.4 עד 2 מ"ל על ידי פיטום למעלה ולמטה על הקרח. פיפטה 0.5 מ"ל של התערובת הסופית לתוך כל באר (ארבע בארות של צלחת 24 בארות). יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך שעה אחת ליצירת תערובת ג'ל תאים.</li>
	<li>הוסף 0.5 מ"ל של תווך אוסטאוגני (מדיום שלם המכיל 50 מיקרוגרם/מ"ל חומצה אסקורבית ו-4 מ"מ β-גליצרופוספט, הידוע גם בשם מדיום אינדוקציה אוסטאוגני)4 לתערובת התא-ג'ל בכל באר כדי להתחיל את ההתמיינות האוסטאוגנית ב-37°C. חשבו על זה כיום 0.</li>
	<li>כל יומיים, להחליף חצי בינוני עם תווך אוסטאוגני טרי נשמר ב 37 ° C. המשך את הטיפוח במשך 35 יום.</li>
</ol>4. זיהוי כדאיות התא והדנדריטים התאיים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי
<ol><li>צביעת תאים הערה: Calcein אצטוקסימתיל אסטר (calcein AM) הוא צבע מתאים שניתן להשתמש בו כדי לקבוע את כדאיות התא. Ethidium homodimer-I (EthD-1) אינו חוצה את הממברנה של תאים שלמים/בני קיימא9. לפיכך, calcein AM/EthD-1 יכול לשמש לזיהוי כדאיות התא ודנדריטים תאיים.<ol><li>ביום הראשון וביום השביעי של התרבית, הוציאו מהמקפיא את תמיסת מלאי הקלצין AM (4 מילימטר ב-DMSO) ואת תמיסת המלאי EthD-1 (2 מילימטר ב-DMSO/H2O 1:4 [v/v]) ואפשרו להם להתחמם לטמפרטורת החדר. הערה: למטריצה המינרלית יש אות אוטופלואורסצנטי חזק, כך ששלב הפראוסטיאוציטים ללא ביטוי Dmp1 תוך 7 ימים מגידול4 מתאים יותר לתצפית על צביעת תאים.</li>
		<li>הוסף 4 μL של תמיסת מלאי 2 mM EthD-1 ו- 5 μL של תמיסת מלאי 4 mM calcein AM ל- 2 מ"ל של מלח חוצץ פוספט (D-PBS) של Dulbecco, וערבב היטב. זה נותן בערך 2 מיקרומטר calcein AM ו 4 μM EthD-1 כפתרונות עבודה.</li>
		<li>פיפטה 0.5 מ"ל של פתרון העבודה לתוך הבארות בצלחת 24 בארות. יש לדגור במשך 30-45 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכתים את מטריצת הג'ל של התא.</li>
		<li>לאחר הדגירה, יש להוסיף כ-0.5 מ"ל של D-PBS טרי לצלחת תרבית חדשה בקוטר 35 מ"מ עם תחתית זכוכית. מכסים את הכלי כדי למנוע זיהום או התייבשות של הדגימות.</li>
		<li>בעזרת מלקחיים עם מרפקים, העבירו בזהירות את מטריצת הג'ל התאית המוכתמת משלב 4.1.3 לצלחת התרבית בקוטר 35 מ"מ משלב 4.1.4. הימנע מפגיעה או גזירה של מטריצת הג'ל התאית.</li>
		<li>הצג את התאים המסומנים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי לייזר.</li>
	</ol></li>
	<li>סט סריקה במיקרוסקופ<ol><li>מניחים את צלחת 35 מ"מ על הבמה. בחר את האזורים של מטריצת ג'ל התא לסריקה דרך העינית באמצעות מטרה של 10x. מטרות הגדלה גבוהות יותר אינן מומלצות בשל גודל הדנדריטים המורחבים.</li>
		<li>בחר את המסננים האופטיים. ניתן לראות את הקלצין כירוק עם מסנן פסים פלואורסצאין סטנדרטי, וניתן לראות את EthD-1 כאדום עם מסננים עבור יודיד פרופידיום או צבע אדום טקסס. בחר את "מצב קו" לסריקה ולהגדיר את "חור סיכה" ל 2 מיקרומטר.</li>
		<li>בחר עומק נתונים של 8 סיביות ורזולוציית תמונה של 1,024 פיקסלים x 1,024 פיקסלים.</li>
		<li>תמונה באמצעות סריקת קו רציף עם הגדרות לייזר וגלאי אופטימליות (שמור על אנרגיית לייזר מינימלית כדי למנוע הלבנה פוטנציאלית). הערה: הגדרת הגלאי האופטימלית תלויה באותות הפלואורסצנטיים הסופיים.</li>
	</ol></li>
	<li>איסוף "ערימת z" של תמונות<ol><li>על פי אות הערוץ הירוק, הגדר את המיקומים העליונים והתחתונים של מטריצת ג'ל התא לסריקה על ידי מיקוד דרך הדגימה תוך כדי סריקה רציפה, .</li>
		<li>לאחר ציון החלק העליון והתחתון של הדגימה, בחר במסגרת הסריקה הרצויה. התחל לסרוק. המדגם ייסרק מלמעלה למטה עם ההגדרות שנבחרו משלב 4.2, יצירת גלריה של תמונות.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהוי כדאיות התא.<ol><li>בחרו פרוסה אחת משלב 4.3. התעלות הירוקות והאדומות מציינות תאים חיים ומתים, בהתאמה.</li>
	</ol></li>
	<li>זיהוי דנדריט תאים.<ol><li>בחר את הערוץ הירוק היחיד כדי ליצור שחזורים תלת-ממדיים באמצעות תוכנת רכישת התמונות. נתוני העומק מוצגים כסדרה של תמונות פסאודו-צבעוניות בצבעי הקשת. הדנדריטים הממוקמים בתחתית הג'ל מוצגים באדום, ואילו אלה בחלק העליון מוצגים בכחול.</li>
	</ol></li>
</ol>5. זיהוי המראה באמצעות סטריאומיקרוסקופ
<ol><li>ביום 1, יום 7, יום 21 ויום 35 של התרבית, הסירו את מדיום הגידול, ושטפו את הג'לים בצלחת פעמיים עם D-PBS. הוסף 0.5 מ"ל של 4% (v/v) paraformaldehyde ב- D-PBS לבאר כדי לקבע את מטריצת התא ג'ל בצלחת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מוציאים את הפרפורמלדהיד בבאר ושוטפים את מטריצת ג'ל התא פעמיים נוספות עם D-PBS בצלחת. השאר 0.5 מ"ל של D-PBS בכל באר להדמיה.</li>
	<li>הניחו את הצלחת על הבמה ובחרו את המיקום האופטימלי דרך העינית באמצעות מטרה של 0.5x. דמיינו את תצוגת השדה המלא של מטריצת ג'ל התא בלוח בנפרד באמצעות "חשיפה אוטומטית" מתחת לשדה הבהיר.</li>
</ol>6. זיהוי שקיעת מינרלים באמצעות בדיקת XRF
<ol><li>ביום ה-35 של התרבית, בדקו אם החנקן הנוזלי מספיק. הפעל את מערכת XRF. פתח את חדר הדגימה והעבר את הג'לים עם מלקחיים עם מרפק מהצלחת לאמצע שלב הדגימה של המכשיר. סגור את חדר הדגימה והמתן 30 דקות כדי לאפשר למכשיר להתקרר לפני השימוש.</li>
	<li>הגדר את "זמן החשיפה" ל- 35 אלפיות השנייה, את "טווח הספקטרום" ל- 0-40 keV, ואת "הזרם החשמלי" ל- 770 μA להגדרת רכישה.</li>
	<li>בחר שלושה עד חמישה אתרי סריקה לניתוח על-ידי הזזת שלב הדגימה.</li>
	<li>בחר את הרכיבים (Ca ו - P) לזיהוי. התחל את הזיהוי וייצא את התוצאות. הערה: Ca ו-P הם היסודות הנפוצים ביותר בהידרוקסיאפטיט.</li>
</ol>7. זיהוי ביטוי גנים פונקציונלי
<ol><li>ביום 1, יום 7, יום 21, יום 28 ויום 35 של התרבית, הסירו את מדיום הגידול ושטפו את מטריצת הג'ל התאית פעמיים עם D-PBS קר כקרח בצלחת.</li>
	<li>מעבירים את הג'לים עם מלקחיים עם מרפק מהצלחת לצינור של 2.0 מ"ל (בהתאם לזמן התרבית, מטריצת הג'ל התאית תתכווץ בהדרגה לכ-0.1 מ"ל ביום ה-35). ודא שג'ל אחד מונח בצינור אחד. הוסף 1 מ"ל של פנול-כלורופורם ושני חרוזי מכות סטריליים מפלדת אל-חלד (4 מ"מ, כמטריצה שוכבת) לכל צינור. הניחו את הצינורות באופן סימטרי בחריץ הדגימה המצונן מראש של ההומוגנייזר המכאני.</li>
	<li>הגדר את הפעימות לתדר של 55 הרץ ומשרעת של 1 ס"מ בכל דקה של פעימה מכנית עם הפסקה של 10 שניות, עם שישה מחזורים בסך הכל. התחילו את מכות החרוזים.</li>
	<li>חלץ את הרנ"א הכולל ממטריצת ג'ל התא בשיטת פנול-כלורופורם-איזואמילאכהול. תעתיק לאחור של 2 מיקרוגרם מסך הרנ"א ל-cDNA עם פריימרים אקראיים של הקסמר.</li>
	<li>תכננו פריימרים המיועדים ל-β-actin, Pdpn, Dmp1, Sost ו-Fgf23 ל-PCR בזמן אמת (טבלה 2). β-Actin הוא גן משק הבית המשמש לנורמליזציה. הגנים Pdpn10 ו-Dmp1 11 מתבטאים בעיקר בקדם-אוסטיאוציטים ובאוסטיאוציטים מינרליים, בעוד ש-Sost12 ו-Fgf2313 מתבטאים בעיקר באוסטיאוציטים בוגרים.</li>
	<li>הניחו את הצינור על thermocycler כאשר המכסה המחומם מכוון ל-105°C ובצעו הגברה של PCR באמצעות הגדרות מחזור ה-PCR הבאות: 95°C עבור 5 שניות ו-60°C למשך 30 שניות למשך 35 מחזורים עם שלב דנטורציה ראשוני ב-95°C למשך 5 דקות ושלב הארכה אחרון ב-60°C למשך 30 שניות. נתח את שינויי הקיפול בשיטת ΔΔCt.</li>
</ol>

<ol><li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+amazing+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">The amazing osteocyte.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (2), 229-238 (2011).</li>
<li>Dallas, S. L., Prideaux, M., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+osteocyte%3A+An+endocrine+cell+...+and+more%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrine+Reviews%22%5BJournal%5D)">The osteocyte: An endocrine cell ... and more.</a> Endocrine Reviews. 34 (5), 658-690 (2013).</li>
<li>Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+osteocyte+in+bone+and+nonbone+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology+and+Metabolism+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">The role of the osteocyte in bone and nonbone disease.</a> Endocrinology and Metabolism Clinics of North America. 46 (1), 1-18 (2017).</li>
<li>Woo, S. M., Rosser, J., Dusevich, V., Kalajzic, I., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line+IDG-SW3+replicates+osteoblast-to-late-osteocyte+differentiation+in+vitro+and+accelerates+bone+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bone+and+Mineral+Research%22%5BJournal%5D)">Cell line IDG-SW3 replicates osteoblast-to-late-osteocyte differentiation in vitro and accelerates bone formation in vivo.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 26 (11), 2634-2646 (2011).</li>
<li>Wang, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+osteocyte+dendrite+formation+by+Sp7+and+its+target+gene+osteocrin%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Control of osteocyte dendrite formation by Sp7 and its target gene osteocrin.</a> Nature Communications. 12 (1), 6271(2021).</li>
<li>Chicatun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteoid-mimicking+dense+collagen%2Fchitosan+hybrid+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Osteoid-mimicking dense collagen/chitosan hybrid gels.</a> Biomacromolecules. 12 (8), 2946-2956 (2011).</li>
<li>Kawasaki, K., Buchanan, A. V., Weiss, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomineralization+in+humans%3A+making+the+hard+choices+in+life%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">Biomineralization in humans: making the hard choices in life.</a> Annual Review of Genetics. 43, 119-142 (2009).</li>
<li>Bosman, F. T., Stamenkovic, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+structure+and+composition+of+the+extracellular+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pathology%22%5BJournal%5D)">Functional structure and composition of the extracellular matrix.</a> Journal of Pathology. 200 (4), 423-428 (2003).</li>
<li>Papadopoulos, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+fluorescence+assay+for+the+determination+of+lymphocyte-mediated+cytotoxicity+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Immunological+Methods%22%5BJournal%5D)">An improved fluorescence assay for the determination of lymphocyte-mediated cytotoxicity using flow cytometry.</a> Journal of Immunological Methods. 177 (1-2), 101-111 (1994).</li>
<li>Staines, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypomorphic+conditional+deletion+of+E11%2FPodoplanin+reveals+a+role+in+osteocyte+dendrite+elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Physiology%22%5BJournal%5D)">Hypomorphic conditional deletion of E11/Podoplanin reveals a role in osteocyte dendrite elongation.</a> Journal of Cellular Physiology. 232 (11), 3006-3019 (2017).</li>
<li>Feng, J. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+DMP1+causes+rickets+and+osteomalacia+and+identifies+a+role+for+osteocytes+in+mineral+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Loss of DMP1 causes rickets and osteomalacia and identifies a role for osteocytes in mineral metabolism.</a> Nature Genetics. 38 (11), 1310-1315 (2006).</li>
<li>Winkler, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osteocyte+control+of+bone+formation+via+sclerostin%2C+a+novel+BMP+antagonist%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Osteocyte control of bone formation via sclerostin, a novel BMP antagonist.</a> EMBO Journal. 22 (23), 6267-6276 (2003).</li>
<li>Riminucci, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FGF-23+in+fibrous+dysplasia+of+bone+and+its+relationship+to+renal+phosphate+wasting%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">FGF-23 in fibrous dysplasia of bone and its relationship to renal phosphate wasting.</a> Journal of Clinical Investigation. 112 (5), 683-692 (2003).</li>
<li>Dallas, S. L., Bonewald, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+transition+from+osteoblast+to+osteocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Annals+of+the+New+York+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the transition from osteoblast to osteocyte.</a> Annals of the New York Academy of Sciences. 1192, 437-443 (2010).</li>
<li>Robin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+3D+osteoblast+migration+and+bone+apatite+during+in+vitro+early+osteocytogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Bone%22%5BJournal%5D)">Involvement of 3D osteoblast migration and bone apatite during in vitro early osteocytogenesis.</a> Bone. 88, 146-156 (2016).</li>
<li>Chen, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+mineralization+capacity+of+IDG-SW3+cells+in+3D+collagen+hydrogel+for+bone+healing+in+estrogen-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Bioengineering+and+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">High mineralization capacity of IDG-SW3 cells in 3D collagen hydrogel for bone healing in estrogen-deficient mice.</a> Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 864(2020).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

נקודה קריטית בפרוטוקול זה היא שיש לבצע את שלבים 1 ו-2 על קרח כדי למנוע קרישה ספונטנית. בשיטה זו, הריכוז הסופי של קולגן I היה 1.2 מ"ג/מ"ל. לפיכך, יש לחשב נפח אופטימלי של ddH2O כך שיתאים לקולגן השונים של יצרנים שונים.
In vivo, אוסטאוציטוגנזה כוללת תנועה קוטבית של אוסטאובלסטים מפני השטח אל פנים העצם הטרבקולרית14. פרוטוקול זה משחרר תאים מצמיחה במטריצה ללא קוטביות כיוונית. כמובן, זריעת תאי IDG-SW3 על משטח מטריצת הג'ל ללא תאים היא אופציונלית. עם זאת, ריכוז...

אוסטיאוציטים הם תאים ממוינים סופניים שמקורם באוסטאובלסטים 1,2. ברגע שהאוסטאובלסט נקבר על ידי האוסטאואיד, הוא עובר אוסטיאוציטוגנזה ומבטא את הגן Pdpn ליצירת פרה-אוסטיאוציטים, את הגן Dmp1כדי להפוך את האוסטיאואיד למינרליזציה, ואת הגנים Sost ו-Fgf23 לתפקד כאוסטיאוציטים בוגרים ברקמת עצם3. כאן, מערכת תרבית תלת ממדית מוצגת כדי לזהות הרחבת דנדריט וביטוי גנים סמן בתהליך אוסטיאוציטוגנזה.
תאי IDG-SW3 הם קו תאים ראשוני אימורטלי שמקורו בעכברים טרנסגניים ויכולים להרחיב או לשכפל אוסטאובלסטים להתמיינות אוסטיאוציטים מאוחרת כאשר הם מתורבתים במדיות שונות4. בהשוואה ל- MLO-A5, MLO-Y4 וקווי תאים אחרים, פרופיל הביטוי של חלבונים פונקציונליים, היכולת לבצע שקיעת מלחי סידן והתגובות להורמונים שונים בתאי IDG-SW3 נוטים יותר להיות זהים לאלה של אוסטיאוציטים ראשוניים ברקמת העצם4.
בהשוואה למערכות דו-ממדיות, מערכות תרבית תלת-ממדיות מסוגלות יותר לחקות את סביבת הגידול התאית in vivo, כולל שיפוע חומרי המזון, קשיחות מכנית נמוכה והטווח המכני שמסביב (טבלה 1). רוב השיטות הקודמות לגידול תאים אוסטאובלסטיים במערכת תלת-ממדית השתמשו בקולגן I כמרכיב ייחודי בפורמולציות 4,5,6, מכיוון שסיבי קולגן I משמשים כאתר של שקיעת סידן וזרחן. עם זאת, מרכיב חיוני באוסטאואיד, המטריצה החוץ תאית, מכיל קבוצה גדולה של גורמים תאיים המקדמים גדילה, הידבקות ונדידה תאית 7,8 והוא שקוף ונוח לתצפית הדמיה. לפיכך, פרוטוקול זה משתמש במטריג'ל (להלן מטריצת קרום מרתף) כמרכיב משני למחקר אוסטאוציטוגנזה.

<table><tbody><tr><td>0.25% חומצה טריפסין-אתילנדיאמין-טראצטית</td><td>Hyclone</td><td>SH30042.01</td><td></td></tr><tr><td>צינורות 15 מ"ל</td><td>קורנינג, ניו יורק, ארה"ב</td><td>430791</td><td></td></tr><tr><td>7.5% (w/v) נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא-אולדריץ', מיזורי, ארה"ב</td><td>S8761</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אסקורבית</td><td>סיגמא-אולדריץ', מיזורי, ארה"ב</td><td>A4544</td><td></td></tr><tr><td>קולגן I</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>A10483-01&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10099141</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר</td><td>BiHeng&nbsp; ביוטכנולוגיה, שנחאי, סין</td> מיקרוסקופיה פלואורסצנטית קונפוקלית <td>לייזר SKSI</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl&nbsp; Zeiss, Oberkochen, גרמניה</td><td>LSM 800</td><td></td></tr><tr><td>ערכת הדמיה של תאים חיים/מתים</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37601</td><td></td></tr><tr><td>מטריצת מטריג'ל</td><td>קורנינג, ניו יורק, ארה"ב</td><td>356234</td><td></td></tr><tr><td>MEM (10X), ללא גלוטמין</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21430079</td><td></td></tr><tr><td>paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich, MO, ארה"ב</td><td>158127</td><td></td></tr><tr><td>מלח חוצץ פוספט</td><td>היקלון</td><td>SH30256. </td> מיקרוסקופ סטריאו FS <td></td></tr><tr><td></td><td>Carl&nbsp; Zeiss, Oberkochen, גרמניה</td><td>Zeiss Axio ZOOM. V16</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>פלואורסצנטי רנטגן</td><td>EDAX, USA</td><td>EAGLE III &</td><td></td></tr>BETA<tr><td>;-GLYCEROPHOSPHATE</td><td>Sigma-Aldrich, MO, ארה"ב</td><td>G9422</td><td></td></tr></tbody></table>

תרבית תאים idg-sw3 במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית

IDG-SW3 Cell Culture in a Three-Dimensional Extracellular Matrix

אוסטיאוציטים נחשבים לתאים לא מתרבים המתמיינים באופן סופני מאוסטאובלסטים. אוסטאובלסטים המשובצים במטריצה החוץ תאית של העצם (אוסטיאואיד) מבטאים את הגן Pdpn ליצירת דנדריטים תאיים והופכים לפראוסטיאוציטים. מאוחר יותר, פראוסטיאוציטים מבטאים את הגן Dmp1 כדי לקדם מינרליזציה של מטריצה ובכך להפוך לאוסטיאוציטים בוגרים. תהליך זה נקרא אוסטיאוציטוגנזה. IDG-SW3 הוא קו תאים ידוע למחקרי מבחנה של אוסטיאוציטוגנזה. שיטות קודמות רבות השתמשו בקולגן I כמרכיב העיקרי או היחיד של מטריצת התרבית. עם זאת, בנוסף לקולגן I, האוסטאואיד מכיל גם חומר טחון, שהוא מרכיב חשוב בקידום גדילה, היצמדות ונדידה של תאים. בנוסף, חומר המטריצה שקוף, מה שמגביר את השקיפות של הג'ל שנוצר על ידי קולגן, ובכך מסייע לחקר היווצרות הדנדריטים באמצעות טכניקות הדמיה. לפיכך, מאמר זה מפרט פרוטוקול ליצירת ג'ל תלת-ממדי באמצעות מטריצה חוץ-תאית יחד עם קולגן I להישרדות IDG-SW3. בעבודה זו, היווצרות דנדריטים וביטוי גנים נותחו במהלך אוסטאוציטוגנזה. לאחר 7 ימים של תרבית אוסטאוגנית, נצפתה בבירור רשת דנדריטים נרחבת תחת מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי. PCR בזמן אמת הראה כי רמות mRNA של Pdpn ו - Dmp1 עלו ללא הרף במשך 3 שבועות. בשבוע 4, המיקרוסקופ הסטריאוסקופ גילה ג'ל אטום מלא בחלקיקים מינרליים, התואם את בדיקת קרני רנטגן פלואורסצנטיות (XRF). תוצאות אלה מצביעות על כך שמטריצת תרבית זו מקלה בהצלחה על המעבר מאוסטאובלסטים לאוסטיאוציטים בוגרים.

לאחר צביעת תאים חיים/מתים, התאים הודגמו באמצעות מיקרוסקופ לייזר קונפוקלי. כל התאים היו קלצין AM-חיובי (צבע ירוק), וכמעט ולא היו תאים חיוביים ל-EthD-1 (צבע אדום) בשדה, מה שמצביע על כך שמערכת הג'ל המיוצרת בשיטה זו מתאימה מאוד לאוסטאוציטוגנזה (איור 1A, משמאל). כדי לקבוע טוב יותר את ההתפלגות המרחבית של התאים, נבחרה תמונה פסאודו-צבעונית שתציג את הדנדריטים של התא בעומקים שונים של הג'ל; אדום מראה את הדנדריטים בתחתית הג'ל, וכחול מראה את הדנדריטים בחלק העליון. התוצאות הצביעו על כך שתאי IDG-SW3 גדלו ה...

כאן אנו מציגים פרוטוקול לטיפוח תאי IDG-SW3 במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית (תלת-ממדית).

תרבית תאים IDG-SW3 במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית

Osteocytes are considered to be nonproliferative cells that are terminally differentiated from osteoblasts. Osteoblasts embedded in the bone extracellular ...

פירטנו פרוטוקול להקמת מערכת תלת-ממדית באמצעות מערכת חוץ-תאית יחד עם קולגן לניתוח היווצרות וביטוי גנים באמצעות אוסטאוגנזה. מדדים חוץ-תאיים יכולים להגביר את השקיפות של הג'ל בצורת קולגן אחד והוא מתאים לחקר היווצרות הדנדריטים לטכניקות הדמיה. כדי להתחיל לאט פיפטה 0.9 מיליליטר של מטריצת קרום מרתף לתוך צינור צנטריפוגה חדש 15 מיליליטר על קרח ולשמור אותו בצד.לאחר מכן, הסר חוט דנטלי T25 של תאים בתרבית IDG SW3 בארבעה מיליליטרים של מדיום שלם בתוספת אינטרפרון גמא מהאינקובטור. לאחר הסרת מדיום התרבית, לשטוף את התאים עם PBS pH 7.4 עם פיפטה. לאחר מכן טריפסניזציה של התאים עם 0.5 מיליליטר של 0.25% טריפסין EDTA ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 שניות.השבתת טריפסין על ידי הוספת 3.5 מיליליטר של מדיום מלא. מעבירים ארבעה מיליליטר של פנסיון צלזיוס לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר. סובבו את מתלה התא ב-300 גרם למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.לאחר השלכת supernatant, להשעות מחדש את לוח התא במיליליטר אחד של המדיום המלא על קרח. ספרו את התאים באמצעות ציטומטר המו והתאימו את צפיפות התאים הסופית עם המדיום המלא עד ארבע פעמים 10 לתאים החמישיים למיליליטר. הוסף 0.1 מיליליטר של תרחיף התא המוכן ל -0.9 מיליליטר של המטריצה החוץ תאית הנשמרת על קרח.מערבבים היטב על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה. ערבבו בעדינות מיליליטר אחד של תערובת מטריצת התא ומיליליטר אחד של הקולגן שהוכן קודם לכן על ידי פיטינג מעלה ומטה על הקרח. פיפטה 0.5 מיליליטר של התערובת הסופית לתוך כל באר של צלחת 24 באר לדגור ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעה אחת כדי ליצור תערובת ג'ל התא.לאחר הדגירה, להוסיף 0.5 מיליליטר של מדיום אוסטאוגני לתערובת ג'ל התא בכל באר. כדי להתחיל את התמיינות אוסטאוגנית ב 37 מעלות צלזיוס, לשקול את זה כמו יום אפס. כל יומיים, החליפו חצי מהמדיום בתווך אוסטאוגני טרי והמשיכו בגידול במשך 35 יום.הוציאו מהמקפיא את תמיסות הסידן AM והאתידיום וואן סטוק ואפשרו להן להתחמם לטמפרטורת החדר. הוסף ארבעה מיקרוליטרים של שני מילימולרים אתידיום תמיסת מלאי אחת וחמישה מיקרוליטרים של תמיסת מלאי סידן AM של ארבעה מילימולרים לשני מיליליטר של DPBS וערבב היטב כדי לקבל שני סידן AM מיקרומולרי וארבעה אתידיום מיקרומולרי אחד כפתרון עבודה. כדי לבצע צביעת תאים ביום הראשון וביום השביעי של התרבית, פיפטה 0.5 מיליליטר של פתרון העבודה לתוך הבארות של צלחת 24 באר לדגור במשך 30 עד 45 דקות בטמפרטורת החדר כדי להכתים את מטריצת ג'ל התא.הוסיפו כ-0.5 מיליליטר של DPBS טרי לצלחת חדשה של תרבית תחתית זכוכית בקוטר 35 מ"מ וכסו את התבשיל כדי למנוע זיהום או התייבשות של הדגימות. בעזרת מלקחיים עם קצה המרפק, העבירו בזהירות את מטריצת ג'ל התא המוכתמת לתוך צלחת התרבית DPBS מבלי לפגוע או לגזור את מטריצת ג'ל התא. הצג את התאים המסומנים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקלי לייזר.מניחים את צלחת התרבית המכילה את מטריצת ג'ל התא המוכתם על במת המיקרוסקופ. בחר את האזורים של מטריצת ג'ל התא לסריקה דרך העינית באמצעות מטרה של 10x. כדי להגדיר את סריקת המיקרוסקופ, בחר את המסננים האופטיים.ראו את הסידן כירוק עם מסנן פס פלואורסצנטי סטנדרטי ואת אתידיום אחד כאדום עם פילטרים לפרופידיום יודיד או צבע אדום טקסס. בחר את מצב הקו לסריקה, ולאחר מכן לחץ על מצב הרכישה כדי להגדיר את היחידות האווריריות ל- au אחד. בחר עומק נתונים של 8 סיביות ורזולוציית תמונה של 1024 על 1024 פיקסלים.לאחר מכן בחר את שלב הקו והגדר את מהירות הסריקה לחמש. כדי לאסוף את ערימת התמונות Z, הגדר את המיקומים העליונים והתחתונים של מטריצת ג'ל התא לסריקה על ידי מיקוד דרך הדגימה תוך סריקה רציפה בהתאם לאות הערוץ הירוק. לאחר ציון החלק העליון והתחתון של הדגימה, בחר במסגרת הסריקה הרצויה והתחל בסריקה.הדגימה נסרקת מלמעלה למטה, כאשר ההגדרות שנבחרו יוצרות גלריית תמונות. לזיהוי התאים הקיימים, בחרו פרוסת תמונה אחת. התעלות הירוקות והאדומות מציינות תאים חיים ומתים בהתאמה.כדי לזהות את דנדריט התא, בחר את הערוץ הירוק היחיד כדי ליצור שחזורים תלת-ממדיים באמצעות תוכנת רכישת התמונות, סדרה של תמונות צבע מדומה בצבעי הקשת מציינות את נתוני העומק. הדנדריטים בתחתית מוצגים באדום, ואילו אלה שלמעלה מוצגים בכחול. בימים שונים של תרבית, להסיר את המדיום תרבית ולשטוף את הג'לים בצלחת פעמיים עם DPBS.הוסף 0.5 מיליליטר או 4% paraformaldehyde ב DPBS לבאר כדי לתקן את מטריצת ג'ל התא בצלחת במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את הפרפורמלדהיד בבאר ושטוף את מטריצת ג'ל התא פעמיים נוספות עם DPBS בצלחת כפי שהודגם קודם לכן, והשאר 0.5 מיליליטר של DPBS בכל באר להדמיה. הניחו את הצלחת על במת מיקרוסקופ הסטריאו ובחרו את המיקום האופטימלי דרך העינית באמצעות מטרה של 0.5x.תמונה, תצוגת השדה המלאה של מטריצת ג'ל התא בצלחת בנפרד באמצעות חשיפה אוטומטית מתחת לשדה הבהיר. ביום ה-35 של התרבית, בדקו את רמות החנקן הנוזלי והפעילו את מערכת XRF. פתחו את חדר הדגימה והעבירו את הג'לים עם מלקחיים עם מרפק מהצלחת לאמצע שלב הדגימה של המכשיר.סגור את חדר הדגימה והמתן 30 דקות כדי לאפשר למכשיר להתקרר לפני השימוש. הגדר את זמן החשיפה ל- 35 אלפיות השנייה. הספקטרום נע בין אפס ל-40 קילו-אלקטרון וולט והזרם החשמלי ל-770 מיקרו-אמפר לרכישה.הזזת שלב הדגימה, בחר שלושה עד חמישה אתרי סריקה לניתוח. בחר את האלמנטים סידן וזרחן. התחל את הזיהוי וייצא את התוצאות.בימים שונים של טיפוח. יש לשטוף את מטריצת ג'ל התא שהוסרה פעמיים ב-DPBS קר כקרח כפי שהודגם קודם לכן. חלץ את סך הרנ"א ממטריצת ג'ל התא באמצעות שיטת אלכוהול איזואמיל פנול כלורופורם.לאחר מכן תעתיק הפוך שני מיקרוגרם של RNA כולל ל- CDNA עם פריימרים הקסמרים אקראיים. מניחים את הצינור על thermocycler ולבצע הגברה PCR. לאחר PCR לנתח את השינויים קיפול עם שתי שיטות CT דלתא.צביעת התאים המתים החיים שהודגמה במיקרוסקופ לייזר קונפוקלי הראתה שכל התאים היו חיוביים לסידן AM וכמעט ללא תאי אתידיום חיוביים אחד, מה שמצביע על כך שמערכת הג'ל מתאימה מאוד לאוסטיאוציטוגנזה. הדנדריטים התאיים התרחבו בהדרגה לרשת בתווך האוסטאוגני עד היום השביעי. תמונת צבע מדומה של תרבות היום השביעי מציגה את האנדרואידים התאיים בעומקים שונים בתחתית ובחלק העליון של הג'ל.תמונות שדה מלא של הג'ל עם תאים וג'ל ללא תאים בצלחת 24 באר בזמנים שצוינו מצולמים. שקיפותה של מטריצת הג'ל המשיכה לרדת עד שהפכה אטומה ביום ה-35, בניגוד למטריצת הג'ל נטולת התאים. ספקטרום XRF של הג'ל האטום ביום ה-35 הצביע על כך שהג'ל היה מלא לחלוטין במרבצי סידן וזרחן.הביטוי של מספר גני סמנים שנותחו על ידי PCR בזמן אמת הראה כי רמות ה- mRNA של פודופלנין וחלבון מטריצת דנטין אחד עלו ללא הרף מהיום הראשון עד היום ה -21 ורמת ה- mRNA ירדה לאחר היום ה -21. רמות ה-mRNA של גורם גדילה פיברובלסטי 23 וסקלרוסטין עלו ללא הרף במהלך כל השלבים. קולגן אחד וקרום המרתף ממטרי ג'ל במהירות ובטמפרטורת החדר.לכן, כל הטיפים והצינורות המשמשים חייבים להיות מקוררים מראש, אלא אם כן צוין אחרת. ניתן לצפות בכל אירוע מעניין במהלך אוסטאוגנזה על ידי טכניקות הדמיה. קל יותר למקם את פעולת המולקולה במהלך היווצרות הדנדריטים והתארכותם.

idg-sw3-cell-culture-in-a-three-dimensional-extracellular-matrix

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

אנו מתארים שיטה פשוטה, מהירה של הפקת 3D רקמה דמוית spheroids יישום הפוטנציאל שלהם לכמת הבדלים תאים תאים אינטראקציות.

תא פשוט תלוי תרבות Drop פרוטוקול הדור של Spheroids 3D

כתב יד זה מתאר טכניקה רכה המבוסס ליתוגרפיה להנדס מערכים אחידים של תלת ממדי (3D) רקמות אפיתל של גיאומטריה מוגדרת מוקפות תאי מטריקס. שיטה זו ניתנת למגוון רחב של סוגי תאים והקשרים ניסיוניים מאפשרת הקרנת תפוקה גבוהה של משכפל זהה.

הנדסה תלת מימדי רקמות אפיתל Embedded בתוך מטריקס

תאי סרטן מוטבעים בג'ל קולגן ולאחר מכן נדחקים בג'ל פיברין תאי כדי ליצור מערכת תרבית תלת מימדית שבה ניתן לנטר את הפולשניות והיווצרות גידולי לווין.

תלת ממדי Assay תרבות לחקור הפולשנות תאים סרטניים היווצרות גידולים בלוויין

זוהי שיטה ליצור פיגום תרבית תאים 3-ממדי תאי מטריקס ריאתי. ריאות שלמים מעובדות לתוך הידרוג שיכול לתמוך בצמיחה של תאים בשלושה ממדים.

הידרוג מתכוונן מ מטריקס ריאתי עבור תרבית תאים 3D

מטריקס רקמות ספציפיות (ECM) הוא מתווך המפתח תפקוד התא. מאמר זה מתאר שיטות סינתזת קצף טהור הנגזרות ECM ו- microcarriers כי הם יציבים בתרבות ללא צורך crosslinking כימי עבור יישומי 3D מתקדם במודלי תרבית תאים במבחנה או כפי bioscaffolds פרו-רגנרטיבית.

ייצור של תאי מטריקס הנגזרות קצפים Microcarriers כמו תרבית תאי רקמות ספציפיות פלטפורמות משלוח

המטרה של פרוטוקול זה היא להעריך את ההשפעה של גורמים פרו - ו אנטי - migratory על נדידת תאים בתוך מטריצה תלת מימדי פיברין.

אפיון נדידת תאים בתוך תלת מימדי במבחנה פצע סביבות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי לקבל מערכות 3D-תרבות בהרכבת פיגומים פפטיד כדי לקדם את הבידול של dedifferentiated chondrocytes במפרק האנושי לתוך רקמות הסחוס דמוי עצמי.

Culturing בתרבית של תאים בפפטיד תלת מימדי פיגומים

אנו מתארים שיטה לבניית התקנים לתרבות תלת-ממדית ולניסויים בתאים ובאורגנואידים רב-תאיים. התקן זה מאפשר ניתוח של תגובות הסלולר אותות מסיסים בסביבות תלת-ממד עם מעברי צבע כימותסטנט מוגדרים. אורגנואידים הם טובים יותר מאשר תאים בודדים בזיהוי של כניסות רעש חלש.

ניתוח תלת-מימד של תגובות מרובות-סלולר לקבוצת מעברי כימוסטנט

פלישה היא תופעה ביולוגית מרכזית בהתפתחות והתקדמות סרטן. תהליך זה מושפע מתאים שאינם ניאופלסטיים ומרכיבי המיקרו-סביבה של הגידול. מטרת מחקר זה היא לתאר שיטה חלופית לניתוח פלישת תאי גידול במבחנה באמצעות תרביות תלת ממדיות (3D).

אסטרטגיה חלופית לניתוח פלישת תאי מבחנה לתרביות תלת ממדיות

במאמר זה אנו מדגימים כיצד תאי אפיתל שגודלו בתרבית עם פיברובלסטים במערכת הדו-שכבתית המבוססת על קרום ננו-סיבי יכולים להיצמד ביציבות לקרום ולגדול עליו.

הקמת מודול קוקולטורה תלת מימדי של תאי אפיתל באמצעות ממברנות ננו-סיביות

למדו פרוטוקול לתרבית תאי IDG-SW3 במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית לחקר אוסטאוגנזה ועיצוב דנדריטים. השיטה משפרת שקיפות הג'ל לצילום מתקדם ומאפשרת ניתוח ביטוי גנים בזמן אמת.

תרבית תאים IDG-SW3 במטריצה חוץ-תאית תלת-ממדית

גלה סרטונים נוספים