Name: בידוד טיפות שומנים פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T14:20:00.000+00:00
Duration: 10 min 35 s
Description: למדו פרוטוקול יעיל לבידוד טיפות שומנים פלסטוגלובול מצמחים וציאנובקטריה. השיטה משלבת סוניקציה ואולטרה-צנטריפוגציה לניתוח ביוכימי מולקולרי של מטבוליזם ליפידים ביצורים פוטוסינתטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר בקבוצת המעבדה של לונדקוויסט נתמך על ידי מענקים מה-NSF (MCB-2034631) ו-USDA (MICL08607) ל-P.K.L. המחברים מודים לד"ר קארי הייזר (MSU) על התמיכה בפיתוח שיטת הבידוד של פלסטוגלובול ציאנובקטריאלי.

1. בידוד פלסטוגלובול גולמי
<ol><li>מיצוי פלסטוגלובול גולמי מרקמת עלי תירס לא מתוחים<ol><li>רכשו שישה שתילי תירס בריאים כבני 3 שבועות וכמעט בשלב הצמיחה של V5, במשקל של כ-120 גרם.</li>
		<li>חותכים את כל העלים שבבסיס הגבעול, מטביעים אותם במהירות באמבט קרח, ומעבירים לחדר הקר.</li>
		<li>עובדים תחת מנורת בטיחות ירוקה, מוציאים את עלי התירס מאמבט הקרח וחותכים אותם לחתיכות קטנות יותר (כ-5X5 ס"מ) באמצעות מספריים.</li>
		<li>טחנו בעדינות אך ביסודיות מחצית מרקמת העלה החתוך בבלנדר מסחרי ב-350 מ"ל של חיץ השחזה (טבלה 1). התחילו לעצור את הבלנדר 5x-6x כדי לוודא שכל העלים נחתכים. אין להשתמש מעל רמה 7 בבלנדר.</li>
		<li>סנן את ההומוגנט דרך שכבה אחת של בד ניילון 25 מיקרומטר על משפך גדול לארבעה בקבוקי צנטריפוגות של 250 מ"ל. לאחר מכן, חזור על שלב 1.1.4 עם המחצית השנייה של רקמת העלה החתוך.</li>
		<li>מחלקים באופן שווה את התסנין בין ארבעת הבקבוקים והצנטריפוגה למשך 6 דקות ב-1,840 x גרם ב-4 מעלות צלזיוס. מוציאים אליקוט של תסנין העלה ומניחים אותו בצד לפני הצנטריפוגה כדי לאחסן אותו כמדגם עלים כולל מייצג.</li>
		<li>יש לשפוך את ה-supernatant שנוצר ולתלות בעדינות את הכדור ב-12 מ"ל של R בינוני 0.2 המכיל סוכרוז של 0.2 M (טבלה 1) על ידי מערבולת והחייאה עם תנועות עדינות של המברשת. לאחר השעיית כל כדור, העבר את המתלה לבקבוק הבא וחזור על ההשעיה. אכל את המתלים לבקבוק אחד.</li>
		<li>חלקו את המתלים המאוגדים בין שישה צינורות אולטרה-צנטריפוגה של 3 מ"ל, והגיעו לנפח מרבי של 2.5 מ"ל בכל צינור.</li>
		<li>סוניקטור כל שפופרת 4x, במשך 10 שניות בכל פעם, באמצעות sonicator קצה באמפליטודה של 100%. הקפידו לשמור על צופר הסוניקטור שקוע והרחק ממשטח הנוזל כדי למנוע קצף.</li>
		<li>הזיזו באיטיות את צופר הסוניקטור למעלה ולמטה בתוך המתלים במהלך כל סיבוב. החליפו בין ארבעת הצינורות, החזירו כל צינור לדלי קרח לאחר כל סוניקציה כדי לאפשר לדגימה להתקרר.</li>
		<li>צנטריפוגה מתלה thylakoid גולמי sonicated ב 150,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. קצור את הפד הצף שנוצר כתוצאה מכך של פלסטוגלובולים גולמיים מפני השטח של כרית הסוכרוז (הנראית בקלות כרית צהובה ושמנונית) באמצעות מזרק ומחט 22 G על ידי רפרוף על פני השטח של הכרית עם פתח המחט, ושחזר כ-500 μL מכל צינור. הפקדה לתוך צינור 2.0 מ"ל.</li>
		<li>לאסוף aliquots של thylakoid גס לפני ואחרי סוניקציה ושחרור של plastoglobules. המשך לשלב 2.1. לחלופין, אחסנו את הפלסטוגלובולים הגולמיים בטמפרטורה של −80 מעלות צלזיוס וטיהרו במועד מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
	<li>מיצוי פלסטוגלובול גולמי מרקמת עלה E. nindensis מיובשת<ol><li>רכשו עציץ (המורכב משלושה צמחים בודדים לכל עציץ) של E. nindensis בן 8-9 שבועות מיובש לחלוטין (כמעט 40 גרם רקמה).</li>
		<li>נתקו את כל רקמת העלה מבסיס הצמח, ממש מעל האדמה, בעזרת מספריים ומיד טבלו את הרקמה באמבט קרח. מעבירים את הרקמה לחדר הקר.</li>
		<li>עבודה תחת מנורת בטיחות ירוקה, לחתוך את E. עלי נינדנסיס לחתיכות קטנות יותר (כ-5X5 ס"מ) באמצעות מספריים.</li>
		<li>בעדינות אך ביסודיות טוחנים את העלים עם 100 מ"ל של חיץ טחינה (טבלה 1) בבלנדר מסחרי. התחילו לעצור את הבלנדר מספר פעמים כדי לוודא שכל העלים נחתכים. אין להשתמש מעל רמה 7 בבלנדר.</li>
		<li>מסננים את ההומוגנט דרך שכבה אחת של בד ניילון 25 מיקרומטר על משפך גדול לתוך בקבוק חרוטי של 250 מ"ל. מוציאים אליקוט של תסנין העלה ומניחים אותו בצד לפני הצנטריפוגה כדי לאחסן אותו כמדגם עלים כולל מייצג.</li>
		<li>מוסיפים את הכמות המתאימה של סוכרוז כדי להביא לריכוז סופי של 0.5 M ולהפיץ את התמיסה לתוך צינורות צנטריפוגה 250 מ"ל. הערה: ריכוז גבוה יותר של סוכרוז בהשוואה לתכשיר Z. mays משמש להבטחת ציפה של טיפות השומנים הציטוזוליות לפני הסוניקציה/שחרור הבאים של הפלסטוגלובולים הקשורים לתילקואיד.</li>
		<li>צנטריפוגה הצינורות ב 45,000 x גרם במשך 30 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. תערובת של פלסטוגלובולים וטיפות שומנים ציטוזוליות תיראה בקלות ככרית צהובה ושמנונית על פני השטח של כרית הסוכרוז או בסמוך לה (איור 1B). לאסוף את החומר הצף באמצעות מזרק עם מחט 22 G על ידי רפרוף על פני השטח של הכרית עם פתח המחט, ולהפקיד לתוך צינור.</li>
		<li>השליכו את שאריות הסופר-נטנט לאחר איסוף תערובת טיפות הפלסטוגלובול/ליפידים הצפות בחופשיות.</li>
		<li>כדי לבודד את הפלסטוגלובולים המחוברים לשאריות thylakoid, יש לתלות את הכדור ב-12 מ"ל של R בינוני 0.2 על ידי מערבולת והחייאה בתנועות עדינות של המברשת. אכל את המתלים לבקבוק אחד. המשך לשלב 1.1.8.</li>
	</ol></li>
	<li>מיצוי פלסטוגלובול גולמי מציאנובקטריה<ol><li>לגדל תרבית 50 מ"ל של Synechocystis sp. PCC 6803 לשלב נייח (כ 7-10 ימים) ולהתאים את צפיפות התא OD750 של 2.0 באמצעות ספקטרופוטומטר. לתנאי תרבית, השתמש במדיית BG-11 וגדל באינקובטור בעוצמת אור של 150 פוטונים μmol/m 2/s, 2% CO2, 32 °C, ועם רעידות מתמשכות ב-150 סל"ד.</li>
		<li>כדי להסיר את הפוליסכרידים, לשטוף את התאים על ידי צנטריפוגה תרבית 50 מ"ל ב 6,000 x גרם במשך 45 דקות ב 4 מעלות צלזיוס ולאחר מכן הסרת supernatant. המשך על ידי שטיפת התאים פעמיים ב-50 מ"ל של חיץ A (טבלה 1). הסר אליקוט של ההומוגנט של התא והניח אותו בצד לפני הצנטריפוגה כדי לאחסן אותו כדגימת תא כוללת מייצגת</li>
		<li>יש לתלות את הכדור השטוף ב-25 מ"ל של Buffer A ולשבור את התאים באמצעות תא לחץ צרפתי ב-1,100 psi, תוך חזרה על התהליך פי 3 (לשים את הדגימה על הקרח בין כל מחזור כדי למנוע דנטורציה של חלבונים) עד שהצבע השחוק משתנה מירוק לאדום-כחול-ירוק תחת אור לבן. השתמש בתא מקורר מראש ובצע שלב זה בחדר הקר.</li>
		<li>להפיץ את ההומוגנט שנוצר בין שמונה צינורות ultracentrifuge 3 מ"ל מלא עד מקסימום של 2.5 מ"ל בכל צינור ולאחר מכן בזהירות כיסוי עם 400 μL של R בינוני, לייצר שיפוע צעד. הערה: עיין ב- Yang, et al. ו- Kelekar, et al. לתיאורים מפורטים של הכנת גרדיאנט סוכרוז25,26.</li>
		<li>אזנו בזהירות את הצינורות על ידי הוספת R בינוני נוסף, לפי הצורך, וצנטריפוגה למשך 30 דקות ב-150,000 x g ב-4 מעלות צלזיוס. הת'ילאקואיד ואברונים כבדים אחרים (כולל כל הגופים הפוליהידרוקסיאלקנואטים) ייפלטו, בעוד שפלסטוגלובולים ייראו בקלות כרית צהובה ושמנונית בחלק העליון של שיפוע הסוכרוז או בסמוך לו (איור 1C).</li>
		<li>קצור את הפד הצף שנוצר כתוצאה מכך של פלסטוגלובולים גולמיים עם מזרק ומחט 22G והשקע לתוך צינור 2 מ"ל. גרד פלסטוגלובולים מהצד של קיר צינור ultracentrifuge עם קצה המחט במידת הצורך.</li>
		<li>המשך לשלב 2.2. לחלופין, אחסנו פלסטוגלובולים גולמיים בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס וטיהרו מאוחר יותר.</li>
	</ol></li>
</ol>2. קצירת פלסטוגלובולים טהורים
<ol><li>עיבוד רקמות צמחים<ol><li>הפק גרדיאנטים של סוכרוז בצינורות אולטרה-צנטריפוגה של 2.5 מ"ל על ידי שכבה ראשונה עם 500 μL של פלסטוגלובולים גולמיים משלב 1.1 או שלב 1.2 מעורבב עם 500 μL של R בינוני 0.7, כדי להביא לנפח כולל של 1 מ"ל, ולאחר מכן כיסוי עם 400 μL של R בינוני 0.2, ואחריו כיסוי עם 400 μL של R בינוני. הערה: עיין Yang et al. ו- Kelekar et al. לתיאורים מפורטים של הכנת שיפוע סוכרוז25,26.</li>
		<li>אזנו בזהירות את הצינורות על ידי הוספת R בינוני עודף לשכבה העליונה, לפי הצורך. לאחר מכן צנטריפוגה ב 150,000 x גרם במשך 1.5 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>קצור את הפד הצף שנוצר כתוצאה מכך של פלסטוגלובולים טהורים (איור 1A) עם מזרק ומחט 22G והשקע בצינור של 2 מ"ל. גרד פלסטוגלובולים מהחלק העליון של דופן צינור הצנטריפוגה עם קצה המחט במידת הצורך.</li>
		<li>Aliquot את plastoglobules טהור להקפיא הבזק חנקן נוזלי. יש לאחסן ישירות בטמפרטורה של -80°C או לבצע lyophilize לאבקה יבשה.</li>
	</ol></li>
	<li>עיבוד ציאנובקטריה<ol><li>הפק שיפוע סוכרוז בארבעה צינורות אולטרה-צנטריפוגה של 2.5 מ"ל בשכבות תחילה עם 500 μL של הפלסטוגלובולים הגולמיים משלב 1.3 מעורבב עם 750 μL של R בינוני 0.7, ולאחר מכן כיסוי עם 750 μL של R בינוני 0.2. הערה: עיין Yang et al. ו- Kelekar et al. לתיאורים מפורטים של הכנת שיפוע סוכרוז25,26.</li>
		<li>צנטריפוגה שיפוע סוכרוז ב 150,000 x גרם במשך 90 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. אסוף את הפלסטוגלובולים הטהורים (איור 1C) באמצעות מזרק ומחט של 22 G מהשלב העליון של שיפוע הסוכרוז והעבר לצינור של 1.5 מ"ל.</li>
		<li>אליקוט את הפלסטוגלובולים הטהורים ואת הקפאת הבזק בחנקן נוזלי. יש לאחסן ישירות בטמפרטורה של −80°C או לבצע lyophilize לאבקה יבשה.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Lundquist, P. K., Shivaiah, K. K., Espinoza-Corral, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplets+throughout+the+evolutionary+tree%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Lipid droplets throughout the evolutionary tree.</a> Progress in Lipid Research. 78, 101029(2020).</li>
<li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+network+of+the+Arabidopsis+plastoglobule+proteome+based+on+quantitative+proteomics+and+genome-wide+coexpression+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">The functional network of the Arabidopsis plastoglobule proteome based on quantitative proteomics and genome-wide coexpression analysis.</a> Plant Physiology. 158 (3), 1172-1192 (2012).</li>
<li>Ytterberg, A. J., Peltier, J. B., van Wijk, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+profiling+of+plastoglobules+in+chloroplasts+and+chromoplasts.+A+surprising+site+for+differential+accumulation+of+metabolic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Protein profiling of plastoglobules in chloroplasts and chromoplasts. A surprising site for differential accumulation of metabolic enzymes.</a> Plant Physiology. 140 (3), 984-997 (2006).</li>
<li>Lundquist, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+plastoglobule+kinases+ABC1K1+and+ABC1K3+causes+conditional+degreening%2C+modified+prenyl-lipids%2C+and+recruitment+of+the+jasmonic+acid+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Loss of plastoglobule kinases ABC1K1 and ABC1K3 causes conditional degreening, modified prenyl-lipids, and recruitment of the jasmonic acid pathway.</a> The Plant Cell. 25 (5), 1818-1839 (2013).</li>
<li>Vidi, P. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tocopherol+cyclase+%28VTE1%29+localization+and+vitamin+E+accumulation+in+chloroplast+plastoglobule+lipoprotein+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Tocopherol cyclase (VTE1) localization and vitamin E accumulation in chloroplast plastoglobule lipoprotein particles.</a> Journal of Biological Chemistry. 281 (16), 11225-11234 (2006).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobuli+and+the+fine+structure+of+plastids%5BTitle%5D)+AND+%22Endeavour%22%5BJournal%5D)">Plastoglobuli and the fine structure of plastids.</a> Endeavour. 27 (102), 144-149 (1965).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K., Peveling, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobuli+in+different+types+of+plastids+from+Allium+cepa+L%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Plastoglobuli in different types of plastids from Allium cepa L.</a> Planta. 72 (1), 1-13 (1966).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Die+Plastoglobuli+von+Spinat%2C+ihre+Gr%C3%B6%CE%B2e%2C+Isolierung+und+Lipochinonzusammensetzung%5BTitle%5D)+AND+%22Protoplasma%22%5BJournal%5D)">Die Plastoglobuli von Spinat, ihre Gröβe, Isolierung und Lipochinonzusammensetzung.</a> Protoplasma. 68 (1-2), 65-77 (1969).</li>
<li>Lichtenthaler, H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobuli+and+lipoquinone+content+of+chloroplasts+from+Cereus+peruvianus+%28L%29+Mill%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Plastoglobuli and lipoquinone content of chloroplasts from Cereus peruvianus (L) Mill.</a> Planta. 87 (4), 304-310 (1969).</li>
<li>Simpson, D. J., Baqar, M. R., Lee, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromoplast+ultrastructure+of+Capsicum+carotenoid+mutants+I.+Ultrastructure+and+carotenoid+composition+of+a+new+mutant%5BTitle%5D)+AND+%22Zeitschrift+f%C3%BCr+Pflanzenphysiologie%22%5BJournal%5D)">Chromoplast ultrastructure of Capsicum carotenoid mutants I. Ultrastructure and carotenoid composition of a new mutant.</a> Zeitschrift für Pflanzenphysiologie. 83 (4), 293-308 (1977).</li>
<li>Hansmann, P., Sitte, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+molecular+structure+of+chromoplast+globules+of+Viola+tricolor%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Composition and molecular structure of chromoplast globules of Viola tricolor.</a> Plant Cell Reports. 1 (3), 111-114 (1982).</li>
<li>Steinmuller, D., Tevini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+function+of+plastoglobuli+%3A+I.+Isolation+and+purification+from+chloroplasts+and+chromoplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Composition and function of plastoglobuli : I. Isolation and purification from chloroplasts and chromoplasts.</a> Planta. 163 (2), 201-207 (1985).</li>
<li>Kessler, F., Schnell, D., Blobel, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+proteins+associated+with+plastoglobules+isolated+from+pea+%28Pisum+sativum+L.%29+chloroplasts%5BTitle%5D)+AND+%22Planta%22%5BJournal%5D)">Identification of proteins associated with plastoglobules isolated from pea (Pisum sativum L.) chloroplasts.</a> Planta. 208 (1), 107-113 (1999).</li>
<li>Grennan, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobule+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">Plastoglobule proteome.</a> Plant Physiology. 147 (2), 443-445 (2008).</li>
<li>Peramuna, A., Summers, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Composition+and+occurrence+of+lipid+droplets+in+the+cyanobacterium+Nostoc+punctiforme%5BTitle%5D)+AND+%22Archives+of+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Composition and occurrence of lipid droplets in the cyanobacterium Nostoc punctiforme.</a> Archives of Microbiology. 196 (12), 881-890 (2014).</li>
<li>Austin, J. R., Frost, E., Vidi, P. A., Kessler, F., Staehelin, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastoglobules+are+lipoprotein+subcompartments+of+the+chloroplast+that+are+permanently+coupled+to+thylakoid+membranes+and+contain+biosynthetic+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Plastoglobules are lipoprotein subcompartments of the chloroplast that are permanently coupled to thylakoid membranes and contain biosynthetic enzymes.</a> The Plant Cell. 18 (7), 1693-1703 (2006).</li>
<li>Eugeni Piller, L., Abraham, M., Dormann, P., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plastid+lipid+droplets+at+the+crossroads+of+prenylquinone+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Experimental+Botany%22%5BJournal%5D)">Plastid lipid droplets at the crossroads of prenylquinone metabolism.</a> Journal of Experimental Botany. 63 (4), 1609-1618 (2012).</li>
<li>Eugeni Piller, L., Glauser, G., Kessler, F., Besagni, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+plastoglobules+in+metabolite+repair+in+the+tocopherol+redox+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Plant+Science%22%5BJournal%5D)">Role of plastoglobules in metabolite repair in the tocopherol redox cycle.</a> Frontiers in Plant Science. 5, 298(2014).</li>
<li>Xu, C., Fan, J., Shanklin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+and+functional+connections+between+cytoplasmic+and+chloroplast+triacylglycerol+storage%5BTitle%5D)+AND+%22Progress+in+Lipid+Research%22%5BJournal%5D)">Metabolic and functional connections between cytoplasmic and chloroplast triacylglycerol storage.</a> Progress in Lipid Research. 80, 101069(2020).</li>
<li>Izquierdo, Y., Fernandez-Santos, R., Cascon, T., Castresana, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet+isolation+from+Arabidopsis+thaliana+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet isolation from Arabidopsis thaliana leaves.</a> Bio-Protocols. 10 (24), 3867(2020).</li>
<li>Espinoza-Corral, R., Schwenkert, S., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+changes+of+Arabidopsis+thaliana+plastoglobules+facilitate+thylakoid+membrane+remodeling+under+high+light+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">Molecular changes of Arabidopsis thaliana plastoglobules facilitate thylakoid membrane remodeling under high light stress.</a> Plant Journal. 106 (6), 1571-1587 (2021).</li>
<li>Espinoza-Corral, R., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+plastoglobule-localized+protein+AtABC1K6+is+a+Mn2%2B-dependent+kinase+necessary+for+timely+transition+to+reproductive+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The plastoglobule-localized protein AtABC1K6 is a Mn2+-dependent kinase necessary for timely transition to reproductive growth.</a> Journal of Biological Chemistry. 298 (4), 101762(2022).</li>
<li>Espinoza-Corral, R., Herrera-Tequia, A., Lundquist, P. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insights+into+topology+and+membrane+interaction+characteristics+of+plastoglobule-localized+AtFBN1a+and+AtLOX2%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Signalling+%26+Behavior%22%5BJournal%5D)">Insights into topology and membrane interaction characteristics of plastoglobule-localized AtFBN1a and AtLOX2.</a> Plant Signalling & Behavior. 16 (10), 1945213(2021).</li>
<li>Besagni, C., Piller, L. E., Bréhélin, C. Preparation of Plastoglobules from Arabidopsis Plastids for Proteomic Analysis and Other Studies. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBesagni%2C+C+%22Chloroplast+Research+in+Arabidopsis%22">Chloroplast Research in Arabidopsis</a>. Jarvis, R. P. , Humana Press. Totowa, NJ. Chapter 12 223-239 (2011).</li>
<li>Yang, H., Murphy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+preparation%2C+sucrose+density+gradients+and+two-phase+separation+fractionation+from+five-day-old+Arabidopsis+seedlings%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Protocols%22%5BJournal%5D)">Membrane preparation, sucrose density gradients and two-phase separation fractionation from five-day-old Arabidopsis seedlings.</a> Bio-Protocols. 3 (24), 1014(2022).</li>
<li>Kelekar, P., Wei, M., Yang, P. Isolation and Analysis of Radial Spoke Proteins. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKelekar%2C+P+%22Cilia%3A+Motors+and+Regulation.+Methods+in+Cell+Biology%22">Cilia: Motors and Regulation. Methods in Cell Biology</a>. Pazour, G. J., King, S. M. 92, Academic Press. Cambridge, MA. Chapter 12 181-196 (2009).</li>
<li>Chen, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear-encoded+synthesis+of+the+D1+subunit+of+photosystem+II+increases+photosynthetic+efficiency+and+crop+yield%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Plants%22%5BJournal%5D)">Nuclear-encoded synthesis of the D1 subunit of photosystem II increases photosynthetic efficiency and crop yield.</a> Nature Plants. 6 (5), 570-580 (2020).</li>
<li>Liu, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultramicroscopy+reveals+that+senescence+induces+in-situ+and+vacuolar+degradation+of+plastoglobules+in+aging+watermelon+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Ultramicroscopy reveals that senescence induces in-situ and vacuolar degradation of plastoglobules in aging watermelon leaves.</a> Micron. 80, 135-144 (2016).</li>
<li>Singh, D. K., Laremore, T. N., Smith, P. B., Maximova, S. N., McNellis, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+FIBRILLIN4+gene+expression+in+apple+decreases+plastoglobule+plastoquinone+content%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Knockdown of FIBRILLIN4 gene expression in apple decreases plastoglobule plastoquinone content.</a> PLoS One. 7 (10), 47547(2012).</li>
<li>Singh, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIBRILLIN4+is+required+for+plastoglobule+development+and+stress+resistance+in+apple+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiology%22%5BJournal%5D)">FIBRILLIN4 is required for plastoglobule development and stress resistance in apple and Arabidopsis.</a> Plant Physiology. 154 (3), 1281-1293 (2010).</li>
<li>Zheng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gardenia+carotenoid+cleavage+dioxygenase+4a+is+an+efficient+tool+for+biotechnological+production+of+crocins+in+green+and+non-green+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnology+Journal%22%5BJournal%5D)">Gardenia carotenoid cleavage dioxygenase 4a is an efficient tool for biotechnological production of crocins in green and non-green plant tissues.</a> Plant Biotechnology Journal. , (2022).</li>
<li>Bligh, E. G., Dyer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+of+total+lipid+extraction+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Canadian+Journal+of+Biochemistry+%26+Physiology%22%5BJournal%5D)">A rapid method of total lipid extraction and purification.</a> Canadian Journal of Biochemistry & Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).</li>
</ol>

אין ניגודי עניינים להצהיר.

כדי למזער את השינויים הפיזיולוגיים/ביוכימיים בחומר ולהגן על פיגמנטים מסוימים של פרניל ליפידים פוטו-לביליים ותרמו-לביליים שהם מרכיב עשיר של פלסטוגלובולים, חיוני לבצע את הבידוד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס ומוגן מפני אור. כפי שצוין לעיל, הצעדים הראשונים מבוצעים בחדר הקירור תחת מנורת בטיחות באמצעות נורה פולטת ירוק. השלבים הבאים המבוצעים במעבדה הם תחת אורות מעומעמים ומשתמשים בקרח או בצנטריפוגה מקוררת. מסיבות דומות, הכללתם של מעכבי פרוטאזות טריות (ומעכבי פוספטאז אם יש עניין לחקור את ויסות הפוספו של חלבונים) היא קריטית (<strong...

ההבנה הנוכחית של הרכב ותפקוד הפלסטוגלובול התפתחה באמצעות מחקרים פרוטאומיים וליפידומיים מפורטים 1,2,3,4,5. מחקרים כאלה נעזרו רבות בשיטת בידוד מהירה ויעילה המסתמכת על צפיפותם הנמוכה מאוד להפרדה יעילה באמצעות שיפועים של סוכרוז. שיטות ראשוניות לבידוד פלסטוגלובול הושגו ממינים כגון עץ האשור (Fagus sylvatica), מטאטא סקוטי (Sarothamnus scoparius), בצל (Allium cepa), תרד (Spinacia oleracea), פאנסי (ויולה טריקולור), פלפל (Capsicum annuum) ואפונה (Pisum sativum)6,7,8,9,10,11 ,12,13. שיטה מעודכנת לבידוד פלסטוגלובולים של כלורופלסט בצורה יעילה יותר ומניבה טוב יותר הוצגה מאוחר יותר על ידי Ytterberg et al.3,14. בעוד שבתחילה נעשה שימוש במחקר של פלסטוגלובולים של כלורופלסטים מעלי אראבידופסיס טליאנה, השתמשנו בהצלחה בשיטה מעודכנת זו לרקמת העלים הבריאה של מיני צמחים אחרים, הן מונוקוט והן דיקוט, כולל תירס (Zea mays), עגבנייה (Solanum lycopersicum), עשב אהבה (Eragrostis nindensis)), ברום מזויף סגול (Brachypodium distachyon) וטבק בר (Nicotiana benthamiana) ; תוצאות שלא פורסמו). יתר על כן, שיטת הבידוד הותאמה בהצלחה לפלסטוגלובולים של ציאנובקטריה, כולל Synechocystis sp. PCC 6803 ו- Anabaena sp. PCC 712015, ורקמת העלה המיובשת של צמח התחייה, E. nindensis.
פלסטוגלובולים של כלורופלסט של רקמת עלים בריאה מחוברים פיזית לקרום התילקואיד16. למרות ההמשכיות הפיזיקלית הזו, שני תתי-התאים של כלורופלסט שומרים על הרכבי שומנים וחלבונים נפרדים, אם כי חילופי השומנים והחלבון המוסדרים בין שני התאים הוצעו 2,4,17,18,19. למעשה, מודל hemifusion מעניין הוצע לאחרונה לסחר של שומנים ניטרליים בין chloroplasts ו cytosol19. בשל ההמשכיות הפיזית של פלסטוגלובולים ותילאקואידים, שיטת הבידוד עם רקמת עלה בריאה מתחילה באיסוף של הכנת thylakoid גולמית כדורית, אשר לאחר מכן sonicated כדי להפריד את plastoglobules מן thylakoids, אשר בניגוד לשיטות המשמשות לבידוד טיפות שומנים ציטוזוליים20 . לאחר מכן, האולטרה-צנטריפוגציה על כרית סוכרוז מרחפת את הפלסטוגלובולים בעלי הצפיפות הנמוכה כלפי מעלה דרך הסורוז, ומפרידה אותם למעשה מהתילקואידים, הגרעינים וחומרים אחרים בעלי צפיפות גבוהה. לעומת זאת, פלסטוגלובולים בציאנובקטריה, כמו גם אלה של רקמת עלים מיובשים, קיימים ככל הנראה in vivo בצורה צפה חופשית. לפיכך, הבידוד שלהם כרוך בציפה ישירה על שיפוע סוכרוז. מאמר זה מדגים את שיטת הבידוד מרקמת עלה בריאה ומדגים עוד יותר שתי וריאציות שניתן להשתמש בהן כדי לבודד פלסטוגלובולים מרקמת עלים מיובשים או מתרביות ציאנובקטריאליות, ומרחיב מאוד את הרוחב הפיזיולוגי ואת ההקשר האבולוציוני שבו ניתן לחקור פלסטוגלובולים.
לאחר מכן ניתן להשתמש בפלסטוגלובולים מבודדים לכל מספר של ניתוחים במורד הזרם כדי לחקור מאפיינים מולקולריים. השתמשנו בפלסטוגלובולים המבודדים מרקמת עלי A. thaliana לניתוח פרוטאומי וליפידומי נרחב בתנאי סביבה או גנוטיפים שונים, המדגימים את השינוי הסלקטיבי של הרכב החלבון והשומנים בהתאמה ללחץ 2,4,21,22. בנוסף, בוצעו מבחני קינאז במבחנה המדגימים פעילות טרנס-זרחון הקשורה לפלסטוגלובולים מבודדים 22, המצבים האוליגומריים של רכיבי חלבון נחקרו באמצעות אלקטרופורזה מקומית בג'ל 21, ומבחני גילוח פרוטאז בוצעו23.
היתרון העיקרי של שיטה זו הוא המהירות היחסית של ההליך. מניסיוננו, ניתן להשלים את הפרוטוקולים המפורטים להלן במלואם תוך כ-4 שעות. תוארה שיטה חלופית לבידוד פלסטוגלובולים מרקמת העלה, המאפשרת בידוד סימולטני של תת-תאים אחרים של כלורופלסט24. שיטה חלופית זו מציעה כמה יתרונות ברורים כאשר יש צורך או רצוי בהשוואה כמותית לשאר תתי-תאי הכלורופלסט. עם זאת, שיטה חלופית זו היא גם מייגעת יותר ותספק תשואה נמוכה משמעותית של פלסטוגלובולים מבודדים מכמויות דומות של רקמת עלה. כאשר מחקר ממוקד של פלסטוגלובולים הוא המטרה, המתודולוגיה המתוארת כאן היא הבחירה האופטימלית. עם זאת, ניתן לאסוף את סך כל העלים ואת האליקוטים הגולמיים של thylakoid במהלך הכנת הדגימה, ומומלץ מאוד לעשות זאת, כדי לקבל דגימות ייחוס להשוואה הבאה.

<table><tbody><tr><td>AEBSF</td><td>Milipore Sigma</td><td>P7626</td><td></td></tr><tr><td>Antipain.2HCl</td><td>Bachem</td><td>H-1765.0050BA</td><td></td></tr><tr><td>Aprotinin</td><td>Milipore Sigma</td><td>A6106</td><td></td></tr><tr><td>Ascorbate</td><td>BDH</td><td>BDH9242</td><td></td></tr><tr><td>Bestatin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B8385</td><td></td></tr><tr><td>בטא-גליצרופוספט. 2Na5H2O</td><td>EMD Millipore</td><td>35675</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין</td><td>Proliant ביולוגי</td><td>68700</td><td></td></tr><tr><td>כימוסטטין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C7268</td><td></td></tr><tr><td>Eragrostis nindensis</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>E-64</td><td>Milipore Sigma</td><td>E3132</td><td></td></tr><tr><td>תא לחץ צרפתי (דגם FA-079)</td><td>SLM/Aminco</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L2884</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>אינקובטור טלטול מולטיטרון</td><td>Infors HT</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>פוספו-רמידון.2 ו</td>- <td>Sigma Aldrich</td><td>R7385</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן הידרוקסיד</td><td>פישר כימיקלים</td><td>M16050</td><td></td></tr><tr><td>ביוכימיקלים מופחתים של ציסטאין</td><td>MP</td><td>101444</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פלואוריד</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S7920</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אורתו-ונדאט</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>450243</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירופוספט &middot; 10H2O</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>3850</td><td></td></tr><tr><td>סורביטול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>S3889</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Sylvania 15 W נורת צינור גרו-לוקס פלואורסצנטית, 18 אינץ'</td> <td>Walmart</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Synechocystis sp. PCC 6803</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX-TL אולטרה-צנטריפוגה</td><td>בקמן קולטר</td><td>A95761</td><td></td></tr><tr><td>בלנדר Waring (1.2 ליטר)</td><td>VWR</td><td>58977-227</td><td>בלנדר מסחרי</td></tr><tr><td>Zea mays</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד טיפות שומנים פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה

Plastoglobule Lipid Droplet Isolation from Plant Leaf Tissue and Cyanobacteria

טיפות שומנים פלסטוגלובול הן תת-תא דינמי של כלורופלסטים צמחיים וציאנובקטריה. הם נמצאים בכל מקום בקרב מינים פוטוסינתטיים, ומאמינים שהם ממלאים תפקיד מרכזי בהסתגלות ובשיפוץ של קרום התילקואיד בתנאי סביבה המשתנים במהירות. היכולת לבודד פלסטוגלובולים בעלי טוהר גבוה הקלה מאוד על מחקרם באמצעות מתודולוגיות פרוטאומיות, ליפידומיות ואחרות. עם plastoglobules של טוהר גבוה ותשואה, ניתן לחקור את הרכב השומנים והחלבונים שלהם, פעילות אנזימטית, טופולוגיה חלבון, בין מאפיינים מולקולריים אפשריים אחרים. מאמר זה מציג פרוטוקול מהיר ויעיל לבידוד פלסטוגלובולים מכלורופלסטים של רקמת עלה צמחי ומציג וריאציות מתודולוגיות לבידוד של פלסטוגלובולים ומבני טיפות שומנים קשורים מעלי תירס, רקמת העלה המיובשת של צמח התחייה, Eragrostis nindensis, והציאנובקטריום, סינכוציסטיס sp. PCC 6803. הבידוד מסתמך על הצפיפות הנמוכה של חלקיקים עשירים בשומנים אלה, מה שמקל על טיהורם על ידי ציפה בצפיפות סוכרוז. מתודולוגיה זו תוכיח את עצמה כבעלת ערך בחקר פלסטוגלובולים ממינים מגוונים.

עם השלמת שלב 1 של הפרוטוקול, יש לראות בקלות כמות ניכרת של חומר טיפות פלסטוגלובול/שומנים שצף על השכבה העליונה של כרית הסוכרוז (או בסמוך לה) (איור 1B-C). ניתן לאסוף גם שברים אחרים בשלב זה. לדוגמה, thylakoids יהיה גלולה וניתן להשעות מחדש עם בינוני R 0.2 עבור ניתוחים הבאים. לאחר הצנטריפוגה הבאה, פלסטוגלובולים מטוהרים יתקבלו על פני השטח של שיפוע הסוכרוז או בסמוך לו, כפי שמוצג באיור 1A,C. בנסיבות מסוימות (למשל, קווים ...

פרוטוקול מהיר ויעיל מוצג לבידוד של טיפות שומנים plastoglobule הקשורים אורגניזמים פוטוסינתטיים שונים. הכנה מוצלחת של פלסטוגלובולים מבודדים היא צעד ראשון מכריע שקדם למחקרים מולקולריים מפורטים כגון ניתוחים פרוטאומיים וליפידומיים.

Plastoglobule lipid droplets are a dynamic sub-compartment of plant chloroplasts and cyanobacteria. Found ubiquitously among photosynthetic species, they ...

הבידוד של פלסטוגלובולים טהורים מאוד הוא קריטי למחקר שלהם. פרוטוקול מהיר ויעיל לבידודם המאפשר את חקירתם הביוכימית במורד הזרם מוצג כאן. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא המהירות היחסית של ההליך והתאמתו למיני צמחים רבים ולתנאי הסביבה.יש לנקוט זהירות מיוחדת בעת סוניקציה של מתלי תילאקואיד כדי להבטיח כוח מספיק כדי להסיר פלסטוגלובולים מתילאקואידים ועם מיצוי לאחר מכן של פלסטוגלובולים משיפוע סוכרוז. מי שידגימו את התהליך הזה יהיו ד"ר אלסינרג'ו דבדסו, חוקר פוסט-דוקטורט במעבדה שלי, ופברי סוזנטו, דוקטורנט במעבדה שלי. התחילו ברכישת שתילים בני שלושה שבועות של שישה תירס בריאים, בעלי שלב צמיחה V5 ובמשקל של כ -120 גרם.גזרו את כל העלים שבבסיס הגבעול והטבילו אותם במהירות באמבט קרח לפני העברתם לחדר הקר. עבודה תחת מנורת בטיחות ירוקה, מוציאים את עלי התירס מאמבט הקרח וחותכים אותם לחתיכות קטנות יותר של חמישה על חמישה סנטימטרים באמצעות מספריים. טוחנים בעדינות וביסודיות מחצית מרקמת העלה החתוכה ב-350 מיליליטר של חיץ הטחינה ברמה נמוכה משבע בבלנדר מסחרי.התחל ועצור את הבלנדר חמש עד שש פעמים כדי להבטיח שכל העלים נחתכים. מסננים את ההומוגנט דרך שכבה אחת של בד ניילון 25 מיקרון על משפך גדול לארבעה בקבוקי צנטריפוגות 250 מיליליטר. לאחר חזרה על שלב הערבוב עם רקמת העלה החתוכה הנותרת, חלקו את התסנין באופן שווה בין ארבעת הבקבוקים.הסר אליציטוט של תסנין העלה והניחו אותו בצד לאחסון כדגימת עלה כוללת מייצגת. לאחר מכן, צנטריפוגה את התסנין במשך שש דקות ב 1, 840 גרם וארבע מעלות צלזיוס. יוצקים את הסופרנאטנט המתקבל, ובתנועות מערבולות עדינות של המברשת, משעים מחדש את הגלולה ב-12 מיליליטר של R 0.2 בינוני, המכיל 0.2 סוכרוז טוחן.לאחר השעיית הגלולה בבקבוק אחד, מוסיפים את המתלה לבקבוק הבא וחוזרים על המתלים כדי לאגד את המתלים לבקבוק אחד. מפזרים את המתלה המשולב בין שישה צינורות אולטרה-צנטריפוגות של שלושה מיליליטר, ומגיעים לנפח מרבי של 2.5 מיליליטר בכל צינור. לאחר מכן השתמש בסוניקטור החוד באמפליטודה של 100% כדי לסניק כל צינור ארבע פעמים למשך 10 שניות כל אחת.הקפד לשמור על קרן הסוניקטור שקועה והרחק מפני השטח הנוזליים כדי למנוע הקצפה. הזיזו באיטיות את קרן הסוניקטור מעלה ומטה בתוך המתלה במהלך כל סיבוב. תוך כדי חילופין בין ארבעת הצינורות, החזירו כל צינור לדלי קרח לאחר כל סוניקציה כדי לאפשר לדגימה להתקרר.לאחר שתסיים, צנטריפוגו את המתלה התילקואיד הגולמי הסוניק ב 150, 000 G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. רפרף על משטח הכרית באמצעות מזרק ומחט מד 22 וקצור את כרית הציפה הצהובה והשמנונית המתקבלת של פלסטוגלובולים גולמיים מכרית הסוכרוז. לשחזר כ 500 מיקרוליטר מכל צינור ולהפקיד אותם לתוך צינור 2.0 מיליליטר.לאסוף aliquots thylakoid גס לפני ואחרי סוניקציה ושחרור של plastoglobules. לאחר שתסיים, או להמשיך את עיבוד רקמות הצמח או לאחסן את הפלסטוגלובולים הגולמי במינוס 80 מעלות צלזיוס ולטהר אותם מאוחר יותר. לגדל 50 מיליליטר של מיני סינכוציסטיס PCC 6802 תרבית במדיה BG11 במשך 7 עד 10 ימים כדי להגיע לשלב נייח.באמצעות ספקטרופוטומטר, להתאים את צפיפות התא לצפיפות אופטית של 2.0 ב 750 ננומטר. כדי להסיר את הרב-סוכרים, צנטריפוגה 50 מיליליטר של תרבית ולהסיר את supernatant. שטיפה חוזרת של התאים ב 50 מיליליטר של חיץ A פעמיים.להשהות מחדש את הגלולה שטופה ב 25 מיליליטר של חיץ A ולשבור את התאים באמצעות תא לחץ צרפתי ב 1, 100 פאונד אינץ 'מרובע. חזור על התהליך שלוש פעמים בתנאי קור עד שצבע הליזה משתנה מירוק לאדום, כחול, ירוק תחת אור לבן. הסר את aliquot של הומוגנט התא ולשים אותו בצד לאחסון כדגימת תא כוללת מייצגת.להפיץ את ההומוגנט שנוצר בשמונה צינורות אולטרה-צנטריפוגה של שלושה מיליליטר מלאים עד למקסימום של 2.5 מיליליטר בכל צינור. לכסות הומוגנט זה עם 400 מיקרוליטר של R בינוני, לייצר שיפוע צעד. אזנו בזהירות את הצינורות על ידי הוספת R בינוני נוסף לפי הצורך לפני צנטריפוגת הצינורות.הזאב הטסמני ואברונים כבדים אחרים, כולל גופים פוליהידרוקסיאלקנואטים, מראים היווצרות כדוריות, בעוד שפלסטוגלובולים יוצרים פד שמנוני צהוב על או בסמוך לחלק העליון של שיפוע הסוכרוז. קצרו את הכרית הצפה המתקבלת של פלסטוגלובולים גולמיים עם מזרק, כפי שהודגם קודם לכן, והפקידו את הקציר בצינור של שני מיליליטר. יש לגרד פלסטוגלובולים מהצד של דופן צינור האולטרה-צנטריפוגה בעזרת קצה מחט במידת הצורך.או להמשיך עם עיבוד ציאנובקטריה או לאחסן פלסטוגלובולים גולמיים במינוס 80 מעלות צלזיוס ולטהר מאוחר יותר. כדי לקצור את הפלסטוגלובולים הטהורים בשיטת עיבוד רקמות הצמח, הכינו את שיפוע הסוכרוז שתואר קודם לכן באמצעות 500 מיקרוליטר של פלסטוגלובולים גולמיים, 400 מיקרוליטר של מדיום R 0.2, ו-400 מיקרוליטר של R בינוני. לאחר צנטריפוגה, קצרו את המשטח הצף שנוצר של פלסטוגלובולים טהורים לתוך צינור של שני מיליליטר. לאחר ציטוט הפלסטוגלובולים הטהורים והקפאת הבזק של האליציטוטים בחנקן נוזלי, יש לאחסן אותם בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס או להפוך אותם לאבקה יבשה.כדי לקצור פלסטוגלובולים טהורים מציאנובקטריה, צור שיפוע סוכרוז, כפי שהוזכר קודם לכן, באמצעות 500 מיקרוליטר של פלסטוגלובולים גולמיים, 750 מיקרוליטר של בינוני R 0.7, ו 750 מיקרוליטר של בינוני R 0.2. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את plastoglobules טהור בצינור 1.5 מיליליטר aliquot פלסטוגלובולים טהורים. לאחר שתסיים, הקפיאו את הפלסטוגלובולים הטהורים בחנקן נוזלי ואחסנו אותם ישירות במינוס 80 מעלות צלזיוס או ליופיליזציה לאבקה יבשה.בשיטה זו נצפתה כמות משמעותית של פלסטוגלובול או חומר טיפתי שומני צף על השכבה העליונה של כרית הסוכרוז. לאחר הצנטריפוגה שלאחר מכן, פלסטוגלובולים מטוהרים התקבלו על או בסמוך לפני השטח של שיפוע הסוכרוז. לאחר הבידוד המוצלח של פלסטוגלובולים, אימונובלוטים שפותחו להערכת טוהר באמצעות נוגדנים שהועלו כנגד Arabidopsis thaliana fibrillin 1a ו- Arabidopsis thaliana photosystem II subunit D1 הראו כי הומולוגים פיברילין היו קשורים בעיקר לתילקואידים מאשר לפלסטוגלובולים.כדי להבטיח מיצוי יעיל ומרוכז של הפד הצף, הניחו את פתח מחט המזרק ממש מתחת לפני השטח הנוזליים של החיץ בעודכם שקועים לחלוטין, ואז משכו בעדינות כלפי מעלה. דגימות פלסטוגלובול מבודדות מקובלות על מחקרים פרוטאומיים או ליפידומיים מאוחרים יותר ושימשו להדגמת השינויים בהרכב החלבון-שומנים הממוקד בתנאים סביבתיים שונים. טכניקה זו אפשרה מחקרים חדשים של פלסטוגלובול, כולל גילוי של פעילות קינאז חלבון הקשורים נוכחות של קומפלקסים חלבונים אוליגומריים באמצעות חקירה ביוכימית לאחר מכן.

plastoglobule-lipid-droplet-isolation-from-plant-leaf-tissue

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הרכב תמציות השומנים הקוטב הרכב חומצות שומן של glycerolipids הפרט נקבעים ניסוי פשוט חזקים פרופיל השומנים. לענין זה, glycerolipids מבודדים על ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה נתונה transmethylation של קבוצות acyl שלהם. Methylesters acyl שומן הם לכמת ידי כרומטוגרפיה גז נוזלי.

Thaliana ארבידופסיס פולאר Glycerolipid פרופיל ידי כרומטוגרפיה בשכבה דקה (TLC) יחד עם כרומטוגרפיה גז נוזלי (GLC)

מקור: Shivaiah, K., et al. בידוד טיפות ליפידים של פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון מדגים את הבידוד של פלסטוגלובולות מציאנובקטריה. זה מתחיל בתרבית של ציאנובקטריה וממשיך דרך שיבוש תאים באמצעות כוח מכני. שחרור פיגמנטים פוטוסינתטיים מעיד על ליזה מוצלחת. לאחר מכן משתמשים בשיפוע צעד סוכרוז כדי להפריד רכיבים תאיים לפי צפיפות, מה שמאפשר לפלסטגלובולות בצפיפות נמוכה ליצור פס מובהק בחלקו העליון. חלק זה נאסף ונשמר להמשך ניתוח.

מיצוי וטיהור פלסטוגלובולות מחיידקים פוטוסינתטיים

מקור: Shivaiah, K., et al. בידוד טיפות ליפידים של פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה. J. Vis. Exp. (2022).סרטון זה מדגים את הבידוד של פלסטוגלובולות מציאנובקטריה באמצעות צנטריפוגה של שיפוע צפיפות סוכרוז, מדגיש את אופיים העשיר בשומנים ובצפיפות נמוכה ומבטיח את שימורם המבני לניתוח במורד הזרם.

טיהור שיפוע צפיפות של פלסטוגלובולים ציאנובקטריאליים

שתי טכניקות לבידוד טיפות שומנים סלולריות מ1) תאי שמרים ו2) שליות אדם מוצגות. במרכזו של שני ההליכים הוא צנטריפוגה שיפוע הצפיפות, שבו השכבה הצפה וכתוצאה מכך המכילה טיפות ניתן דמיינו בקלות על ידי העין, שחולצה, ולכמת על ידי ניתוח כתם מערבי לטוהר.

בידוד של טיפות שומנים נייד: שתי טכניקות טיהור החל מתאי שמרים ושליות אדם

פוליאסטרים ליפידים מהווים את המרכיבים המבניים של שני שינויים בדופן התא, ציפורן הצמח ומחסומי דיפוזיה המכילים סוברין. בסרטון זה אנו מתארים שיטה לדה-פולימריזציה של קוטין מעלים שלמים נטולי שומן. ניתן ליישם את השיטה לחקירת מוטציות שנפגעו בביוסינתזה של קוטין או סוברין.

בידוד והלחנת ניתוח של צמח מונומרים פוליאסטר שומנים ציפורן

A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד fucoxanthin כלורופיל a/c מחייב חלבונים (FCP) מ- diatoms ועד לשלב אותם בתוך ליפוזומים עם יצירות השומנים טבעית ללמוד עירור העברת אנרגיה על שינויים בהרכב יון.

בידוד, שילוב אנטנות קציר-אור של צורניות Cyclotella Meneghiniana בתוך ליפוזומים עם שומנים תילקואיד

כאן, אנו מתארים שיטה לטהר מהכלורופלסט ללא פגע מן העלים תודרנית שלהם שלוש הראשי תת התאים (מעטפה, משתית, thylakoids), באמצעות שילוב של centrifugations דיפרנציאלית, מעברי צבע, Percoll רציף, מעברי צבע סוכרוז מקוטע. השיטה היא יקר עבור subplastidial ולוקליזציה subcellular של חלבונים על-ידי immunoblotting פרוטאומיקס.

הכנת כלורופלסט תאי המשנה של תודרנית לניתוח של חלבון לוקליזציה Immunoblotting או פרוטאומיקס

פרוטוקול זה יוצר שיטה של השומנים droplet בידוד והיטהרות מן העכבר כבדים, באמצעות ערכת בידוד ומבוססת רשתית תוך-פלזמית.

השומנים מהירה Droplet בידוד פרוטוקול באמצעות ערכת בידוד להקציע אברון

הפרוטוקול הנוכחי מפרט את הבידוד של phycobililisomes מציאנובקטריה על ידי צנטריפוגציה באמצעות שיפוע צפיפות סוכרוז בלתי פוסק. השברים של phycobilisomes שלמים מאושרים על ידי ספקטרום פליטה פלואורסצנטי 77K וניתוח SDS-PAGE. שברי הפיזיקוביליוזום המתקבלים מתאימים להכתמה שלילית של TEM וניתוח ספקטרומטריית מסה.

בידוד ואפיון של פיקוביליזום שלם בציאנובקטריה

למדו פרוטוקול יעיל לבידוד טיפות שומנים פלסטוגלובול מצמחים וציאנובקטריה. השיטה משלבת סוניקציה ואולטרה-צנטריפוגציה לניתוח ביוכימי מולקולרי של מטבוליזם ליפידים ביצורים פוטוסינתטיים.

בידוד טיפות שומנים פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה

גלה סרטונים נוספים