בידוד טיפות שומנים פלסטוגלובול מרקמת עלי הצמח וציאנובקטריה

פרוטוקול מהיר ויעיל מוצג לבידוד של טיפות שומנים plastoglobule הקשורים אורגניזמים פוטוסינתטיים שונים. הכנה מוצלחת של פלסטוגלובולים מבודדים היא צעד ראשון מכריע שקדם למחקרים מולקולריים מפורטים כגון ניתוחים פרוטאומיים וליפידומיים.

הבידוד של פלסטוגלובולים טהורים מאוד הוא קריטי למחקר שלהם. פרוטוקול מהיר ויעיל לבידודם המאפשר את חקירתם הביוכימית במורד הזרם מוצג כאן. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא המהירות היחסית של ההליך והתאמתו למיני צמחים רבים ולתנאי הסביבה.

יש לנקוט זהירות מיוחדת בעת סוניקציה של מתלי תילאקואיד כדי להבטיח כוח מספיק כדי להסיר פלסטוגלובולים מתילאקואידים ועם מיצוי לאחר מכן של פלסטוגלובולים משיפוע סוכרוז. מי שידגימו את התהליך הזה יהיו ד"ר אלסינרג'ו דבדסו, חוקר פוסט-דוקטורט במעבדה שלי, ופברי סוזנטו, דוקטורנט במעבדה שלי. התחילו ברכישת שתילים בני שלושה שבועות של שישה תירס בריאים, בעלי שלב צמיחה V5 ובמשקל של כ -120 גרם.

גזרו את כל העלים שבבסיס הגבעול והטבילו אותם במהירות באמבט קרח לפני העברתם לחדר הקר. עבודה תחת מנורת בטיחות ירוקה, מוציאים את עלי התירס מאמבט הקרח וחותכים אותם לחתיכות קטנות יותר של חמישה על חמישה סנטימטרים באמצעות מספריים. טוחנים בעדינות וביסודיות מחצית מרקמת העלה החתוכה ב-350 מיליליטר של חיץ הטחינה ברמה נמוכה משבע בבלנדר מסחרי.

התחל ועצור את הבלנדר חמש עד שש פעמים כדי להבטיח שכל העלים נחתכים. מסננים את ההומוגנט דרך שכבה אחת של בד ניילון 25 מיקרון על משפך גדול לארבעה בקבוקי צנטריפוגות 250 מיליליטר. לאחר חזרה על שלב הערבוב עם רקמת העלה החתוכה הנותרת, חלקו את התסנין באופן שווה בין ארבעת הבקבוקים.

הסר אליציטוט של תסנין העלה והניחו אותו בצד לאחסון כדגימת עלה כוללת מייצגת. לאחר מכן, צנטריפוגה את התסנין במשך שש דקות ב 1, 840 גרם וארבע מעלות צלזיוס. יוצקים את הסופרנאטנט המתקבל, ובתנועות מערבולות עדינות של המברשת, משעים מחדש את הגלולה ב-12 מיליליטר של R 0.2 בינוני, המכיל 0.2 סוכרוז טוחן.

לאחר השעיית הגלולה בבקבוק אחד, מוסיפים את המתלה לבקבוק הבא וחוזרים על המתלים כדי לאגד את המתלים לבקבוק אחד. מפזרים את המתלה המשולב בין שישה צינורות אולטרה-צנטריפוגות של שלושה מיליליטר, ומגיעים לנפח מרבי של 2.5 מיליליטר בכל צינור. לאחר מכן השתמש בסוניקטור החוד באמפליטודה של 100% כדי לסניק כל צינור ארבע פעמים למשך 10 שניות כל אחת.

הקפד לשמור על קרן הסוניקטור שקועה והרחק מפני השטח הנוזליים כדי למנוע הקצפה. הזיזו באיטיות את קרן הסוניקטור מעלה ומטה בתוך המתלה במהלך כל סיבוב. תוך כדי חילופין בין ארבעת הצינורות, החזירו כל צינור לדלי קרח לאחר כל סוניקציה כדי לאפשר לדגימה להתקרר.

לאחר שתסיים, צנטריפוגו את המתלה התילקואיד הגולמי הסוניק ב 150, 000 G למשך 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס. רפרף על משטח הכרית באמצעות מזרק ומחט מד 22 וקצור את כרית הציפה הצהובה והשמנונית המתקבלת של פלסטוגלובולים גולמיים מכרית הסוכרוז. לשחזר כ 500 מיקרוליטר מכל צינור ולהפקיד אותם לתוך צינור 2.0 מיליליטר.

לאסוף aliquots thylakoid גס לפני ואחרי סוניקציה ושחרור של plastoglobules. לאחר שתסיים, או להמשיך את עיבוד רקמות הצמח או לאחסן את הפלסטוגלובולים הגולמי במינוס 80 מעלות צלזיוס ולטהר אותם מאוחר יותר. לגדל 50 מיליליטר של מיני סינכוציסטיס PCC 6802 תרבית במדיה BG11 במשך 7 עד 10 ימים כדי להגיע לשלב נייח.

באמצעות ספקטרופוטומטר, להתאים את צפיפות התא לצפיפות אופטית של 2.0 ב 750 ננומטר. כדי להסיר את הרב-סוכרים, צנטריפוגה 50 מיליליטר של תרבית ולהסיר את supernatant. שטיפה חוזרת של התאים ב 50 מיליליטר של חיץ A פעמיים.

להשהות מחדש את הגלולה שטופה ב 25 מיליליטר של חיץ A ולשבור את התאים באמצעות תא לחץ צרפתי ב 1, 100 פאונד אינץ 'מרובע. חזור על התהליך שלוש פעמים בתנאי קור עד שצבע הליזה משתנה מירוק לאדום, כחול, ירוק תחת אור לבן. הסר את aliquot של הומוגנט התא ולשים אותו בצד לאחסון כדגימת תא כוללת מייצגת.

להפיץ את ההומוגנט שנוצר בשמונה צינורות אולטרה-צנטריפוגה של שלושה מיליליטר מלאים עד למקסימום של 2.5 מיליליטר בכל צינור. לכסות הומוגנט זה עם 400 מיקרוליטר של R בינוני, לייצר שיפוע צעד. אזנו בזהירות את הצינורות על ידי הוספת R בינוני נוסף לפי הצורך לפני צנטריפוגת הצינורות.

הזאב הטסמני ואברונים כבדים אחרים, כולל גופים פוליהידרוקסיאלקנואטים, מראים היווצרות כדוריות, בעוד שפלסטוגלובולים יוצרים פד שמנוני צהוב על או בסמוך לחלק העליון של שיפוע הסוכרוז. קצרו את הכרית הצפה המתקבלת של פלסטוגלובולים גולמיים עם מזרק, כפי שהודגם קודם לכן, והפקידו את הקציר בצינור של שני מיליליטר. יש לגרד פלסטוגלובולים מהצד של דופן צינור האולטרה-צנטריפוגה בעזרת קצה מחט במידת הצורך.

או להמשיך עם עיבוד ציאנובקטריה או לאחסן פלסטוגלובולים גולמיים במינוס 80 מעלות צלזיוס ולטהר מאוחר יותר. כדי לקצור את הפלסטוגלובולים הטהורים בשיטת עיבוד רקמות הצמח, הכינו את שיפוע הסוכרוז שתואר קודם לכן באמצעות 500 מיקרוליטר של פלסטוגלובולים גולמיים, 400 מיקרוליטר של מדיום R 0.2, ו-400 מיקרוליטר של R בינוני. לאחר צנטריפוגה, קצרו את המשטח הצף שנוצר של פלסטוגלובולים טהורים לתוך צינור של שני מיליליטר. לאחר ציטוט הפלסטוגלובולים הטהורים והקפאת הבזק של האליציטוטים בחנקן נוזלי, יש לאחסן אותם בטמפרטורה של מינוס 80 מעלות צלזיוס או להפוך אותם לאבקה יבשה.

כדי לקצור פלסטוגלובולים טהורים מציאנובקטריה, צור שיפוע סוכרוז, כפי שהוזכר קודם לכן, באמצעות 500 מיקרוליטר של פלסטוגלובולים גולמיים, 750 מיקרוליטר של בינוני R 0.7, ו 750 מיקרוליטר של בינוני R 0.2. לאחר צנטריפוגה, לאסוף את plastoglobules טהור בצינור 1.5 מיליליטר aliquot פלסטוגלובולים טהורים. לאחר שתסיים, הקפיאו את הפלסטוגלובולים הטהורים בחנקן נוזלי ואחסנו אותם ישירות במינוס 80 מעלות צלזיוס או ליופיליזציה לאבקה יבשה.

בשיטה זו נצפתה כמות משמעותית של פלסטוגלובול או חומר טיפתי שומני צף על השכבה העליונה של כרית הסוכרוז. לאחר הצנטריפוגה שלאחר מכן, פלסטוגלובולים מטוהרים התקבלו על או בסמוך לפני השטח של שיפוע הסוכרוז. לאחר הבידוד המוצלח של פלסטוגלובולים, אימונובלוטים שפותחו להערכת טוהר באמצעות נוגדנים שהועלו כנגד Arabidopsis thaliana fibrillin 1a ו- Arabidopsis thaliana photosystem II subunit D1 הראו כי הומולוגים פיברילין היו קשורים בעיקר לתילקואידים מאשר לפלסטוגלובולים.

כדי להבטיח מיצוי יעיל ומרוכז של הפד הצף, הניחו את פתח מחט המזרק ממש מתחת לפני השטח הנוזליים של החיץ בעודכם שקועים לחלוטין, ואז משכו בעדינות כלפי מעלה. דגימות פלסטוגלובול מבודדות מקובלות על מחקרים פרוטאומיים או ליפידומיים מאוחרים יותר ושימשו להדגמת השינויים בהרכב החלבון-שומנים הממוקד בתנאים סביבתיים שונים. טכניקה זו אפשרה מחקרים חדשים של פלסטוגלובול, כולל גילוי של פעילות קינאז חלבון הקשורים נוכחות של קומפלקסים חלבונים אוליגומריים באמצעות חקירה ביוכימית לאחר מכן.