תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

פרוטוקול זה מספק שיטה לחקור את התפקוד של תאי גזע המעי הגס בסביבה מניפולטיבית עם עלות נמוכה יותר בזמן מאשר מודלים של בעלי חיים. תרבית אורגנואידית מאפשרת לחקור את תפקוד תאי הגזע בסביבה נטולת מערכת החיסון. זה מאפשר לאתר את ההשפעות של גורם מסוים, כגון נוקאאוט של claudin-7.

הבנת המנגנונים של תפקוד תאי גזע עשויה לשפוך אור על יעדים טיפוליים חדשים למחלות מתישות כמו מחלות מעי דלקתיות וסרטן המעי הגס. כדי להתחיל בבידוד של קריפטות המעי הגס מהעכבר המומת, בצע חתך של כשני סנטימטרים לאורך קו האמצע של העכבר. לאחר מכן, הצמד בחזרה את העור כדי לחשוף את הבטן.

חותכים את המעי הגס ממש מתחת לקואקום מהצד הפרוקסימלי ומעל פי הטבעת מהצד הדיסטלי כדי לבודד את המעי הגס. לאחר מכן, להסיר את רקמת השומן מחובר המעי הגס באמצעות מלקחיים. לאחר דחיפת צואה מהמעי הגס המבודד עם הקצה השטוח של המלקחיים, חותכים את הרקמה פתוחה לאורך.

שטפו את הרקמה 10 עד 15 פעמים עם PBS קר על ידי סיבוב הרקמה ב-PBS בין שטיפות עם מלקחיים. לאחר מכן באמצעות זוג מספריים נקיים וחדים, חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות הנעות בין כשלושה לחמישה מילימטרים. לאחר בידוד המעי הגס מעכבר אחר, יש לשלב את כל חלקי הרקמה בצינור צנטריפוגה בקוטר 50 מיליליטר המכיל מדיית דיסוציאציה אפיתליאלית קרה ולדגור את חלקי רקמת המעי הגס במדיית דיסוציאציה אפיתליאלית למשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה.

לאחר הדגירה, אפשרו לשברי הרקמה לשקוע לתחתית הצינור. לאחר ההתיישבות, יש להשליך את מדיית הדיסוציאציה האפיתליאלית מבלי לשבש את שברי הרקמות. חזור על התהליך בעת שטיפת הרקמה 10 עד 15 פעמים עם PBS קר.

יש להשליך כמה שיותר PBS במהלך הכביסה הסופית. לאחר מכן, הוסיפו מדיית דיסוציאציה קרה לחתיכות רקמת המעי הגס השטופות בצינור של 50 מיליליטר ונערו במשך חמש עד 10 דקות ביד. מתחת למכסה המנוע של תרבית התאים, סננו את המדיה המכילה את הרקמה באמצעות מסננת תאי ניילון בגודל 70 מיקרון לתוך צינור צנטריפוגה טרי של 50 מיליליטר.

לאחר הסינון, צנטריפוגה של הצינור ב 200 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן השלכת supernatant מבלי להפריע את הקריפטות כדורי. להשעות את הכדור בשלושה עד ארבעה מיליליטר של PBS קר. פיפטה 10 מיקרוליטר של מתלה הקריפטה בשורה על שקופית מיקרוסקופ.

באמצעות המיקרוסקופ, יש לספור את מספר הקריפטות המלאות והארוכות כדי להעריך את ריכוז הקריפטות ולחשב את נפח הקריפטות המתאים הנדרש לצלחת 10 קריפטות למיקרוליטר בלוח של 96 בארות. צנטריפוגה נפח מתאים של קריפטות מבודדות בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר ב 200 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר מבלי לשבש את הקריפטות הגלולות.

לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטרים של מטריצת ג'ל לקריפטות הכדוריות מבלי להציג בועות אוויר. המתן דקה עד שתי דקות עד שמטריצת הג'ל תתמצק חלקית. לאחר מכן, צלחת 10 מיקרוליטרים של מטריצת הג'ל מעורבבים עם הקריפטות בכל באר של צלחת תרבית 96 באר שחוממה מראש כדי ליצור צורת כיפה.

יש להמתין 10 עד 20 דקות עד להגדרה מלאה של מטריצת הג'ל על ידי הנחת הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. לבסוף, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסת העבודה הטרייה של מדיה L-WRN בתוספת אנטיביוטיקה לכל באר ודגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. כדי לקצור את האורגנואידים, הסר מדיה ישנה מהבארות על ידי הפעלת שאיבה ואקום ותקן את האורגנואידים עם 4% paraformaldehyde במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן הסר 4% paraformaldehyde מן הבארות על ידי שאיבה ואקום ולטפל אורגנואידים עם 100 microliters של 30% סוכרוז לכל באר בארבע מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, יש להסיר 30% סוכרוז מהבארות על ידי שאיבה בוואקום לפני הוספת 10 מיקרוליטרים של PBS לכל באר. השתמש בקצה פיפטה כדי לגרד בעדינות את החלק התחתון של הבאר כדי לנתק את האורגנואידים המכילים כיפה.

לאחר מכן, הסר את ה- PBS המכיל את האורגנואידים המנותקים מהבאר עם פיפטה והעבר אותו לתבנית פלסטיק מסומנת מלאה 90% עם טמפרטורת חיתוך אופטימלית, או OCT, תרכובת. ממשיכים בתהליך עד שכל האורגנואידים הוסרו מכל הבארות. הוסיפו 2-מתילבוטאן לבקבוק דיואר מפלדת אל-חלד המכיל כדורי קרח יבשים, מספיק כדי לכסות את הכדורים.

הקפיאו את האורגנואיד המכיל בלוק OCT על ידי החזקתו בהתמדה מעל 2-מתילבוטאן. לבסוף, אחסנו את בלוק ה-OCT המכיל אורגנואיד במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לחתך. התמונה המייצגת מדגישה את הצמיחה המוצלחת של קולונואידים מקריפטות רגילות המכילות קלודין-7.

הקריפטות שהכילו קלודין-7 החלו ליצור ספרואידים ביום השני, התחילו לנדוד ביום החמישי, והמשיכו לגדול ולנבוט עד שנקטפו ביום התשיעי. לעומת זאת, קריפטות חסרות קלודין-7 לא הצליחו ליצור קולונואידים תקינים. לאחר טיפול עם 4-hydroxytamoxifen במשך יומיים עד שלושה ימים, קריפטות נוקאאוט claudin-7 הופיעו כגושים עגולים של תאים.

שלא כמו הבקרה, הקריפטות לא גדלו לספרואידים בריאים. הכתמה אימונופלואורסצנטית של קלאודין-7 בבקרה שנקטפה והאורגנואידים המותנים של נוקאאוט אישרו את הנוקאאוט המוצלח של קלודין-7 בתרבית. מושבי הבקרה הפגינו מעט מאוד אות אפופטוטי ביום התשיעי.

עם זאת, קולונואידים נוקאאוט claudin-7 הציגו אפופטוזיס גבוה באותו זמן. יש לוודא התמצקות חלקית לפני הציפוי. ציפוי לפני התמצקות חלקית יגרום למטריצת הג'ל להתפשט והכיפה לא תיווצר, מה שישפיע על הישרדותן וצמיחתן של הקריפטות.

פרוטוקול זה עשוי לשמש לגילוי תרופות, חקר תקשורת תאית, חילוף חומרים של תרופות, כדאיות, שגשוג ופיתוח טיפול מותאם אישית ספציפי למטופל. כינון התרבות האורגנואידית חולל מהפכה בחקר מחלות וברפואה מותאמת אישית.