Name: תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-11T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 46 s
Description: חקור תרבית אורגנואידים תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס במודל עכברי לחקר תפקוד תאי גזע. שיטה זו מאפשרת ניתוח השפעת מחיקת claudin-7 על פעילות תאי הגזע ומספקת פלטפורמה לחקר מחלות מעיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה מומן על ידי NIH DK103166.

כל הניסויים והנהלים בבעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול והשימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת מזרח קרוליינה (ECU) (IACUC) ונערכו בהתאם להנחיות המכונים הלאומיים לבריאות ו-ECU לגבי טיפול ושימוש בחיות מעבדה. עכברי נוקאאוט מסוג claudin-7 שאינם ניתנים להשראה וספציפיים למעיים נוצרו על-ידי חציית C57BL6 claudin-7-flox עכברים מהונדסים עם עכברי Villin-CreERT219. במחקר זה נעשה שימוש בעכברים זכרים ונקבות בני 3 חודשים.
1. הכנת ריאגנט/ציוד
<ol><li>לקרר את הריאגנטים/הציוד הבאים לפני תחילת הניסויים הקשורים אליהם: מלח חצוב פוספט (PBS) לשטיפת רקמת המעי הגס במהלך בידוד קריפטה; נדנדה/רוטטור (מקום במקרר 4 מעלות צלזיוס) לדגירה עם מדיית דיסוציאציה אפיתליאלית.<ol><li>מוציאים את מטריצת הג'ל (ראו טבלת חומרים) מ-20°C- ומפשירים על קרח לפני הציפוי.</li>
		<li>מצננים את הצנטריפוגה ל-4 מעלות צלזיוס לפני סיבוב הקריפטות לציפוי.</li>
		<li>מצננים 0.1% נתרן ציטראט (ראו טבלת חומרים) ושומרים על הקרח לפני זיהוי מוות של תאים באתרם .</li>
	</ol></li>
	<li>חממו את הריאגנטים הבאים לפני תחילת הניסויים הקשורים אליהם: צלחת תרבית של 96 בארות למשך 24 שעות לפני הציפוי; מדיית L-WRN (ראה טבלת חומרים) לפני הוספה לקריפטות מצופות ולפני כל שינוי מדיה.<ol><li>מחממים את אמבט המים ל-94°C לפני הכתמת.</li>
	</ol></li>
</ol>2. בידוד קריפטת המעי הגס מורין
<ol><li>הכן את המדיה הדרושה לפי השלבים הבאים. הערה: נפחי המדיה מחושבים כאן עבור רקמת המעי הגס של שני עכברים.<ol><li>הכן מדיית דיסוציאציה אפיתליאלית: 30 מ"ל של 1x PBS + 400 μL של 0.5 M EDTA + 50 μL של 10 mM Y-27632 דיהידרוכלוריד (ראה טבלת חומרים). יש לשמור על הקרח עד לשימוש.</li>
		<li>הכן מדיה דיסוציאציה קריפטה: 10 מ"ל של 1x PBS + 10 μL של 10 mM Y-27632 דיהידרוכלוריד. יש לשמור על הקרח עד לשימוש.</li>
		<li>תוסף L-WRN מדיה: 50 מ"ל של מדיה L-WRN + 47.5 מ"ל של DMEM גלוקוז גבוה עם L-גלוטמין + 500 μL של L-גלוטמין + 500 μL של פניצילין/סטרפטומיצין + 1,000 μL של תוסף B-27 (50x) + 500 μL של תוסף N2 (100x) + 50 μL של HEPES (1 M) פתרון חיץ (ראה טבלת חומרים).</li>
		<li>סנן את מדיית ה-L-WRN המלאה (הנוספת) ואת ה-aliquot לאחסון בטמפרטורה של -20°C למשך עד 3 חודשים. הערה: המדיה המופשרה יציבה ב-4 °C למשך עד שבועיים.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע את בידוד הקריפטה.<ol><li>להרדמה כללית, יש להוסיף 1 מ"ל של איזופלוראן לכותנה ולהניח אותה בתוך קלטת פלסטיק בתוך תא הרדמה של 0.09 רגל מעוקב (ראו טבלת חומרים). מניחים את העכבר בתא ההרדמה עד שהנשימה נעצרת (כ-3-5 דקות) ולאחר מכן מבצעים נקע צוואר הרחם20.</li>
		<li>בצע חתך של כ-2 אינץ' לאורך קו האמצע של העכבר, תוך הצמדת העור האחורי לחשיפת הבטן. לבודד את המעי הגס על ידי חיתוך ממש מתחת לצקום מהצד הפרוקסימלי ומעל פי הטבעת מהצד הדיסטלי21.</li>
		<li>באמצעות מלקחיים, להסיר את רקמת השומן מחובר המעי הגס. דוחפים בעדינות את הצואה החוצה תוך שימוש בקצה השטוח של המלקחיים וחותכים את הרקמה לאורך.</li>
		<li>שטפו את הרקמה 10-15 פעמים עם PBS קר 1x באמצעות מלקחיים כדי "לסובב" את הרקמה סביב PBS בין שטיפות.</li>
		<li>באמצעות מספריים נקיים וחדים, חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות, בגודל של כ -3-5 מ"מ.</li>
		<li>חזור על התהליך עבור העכבר השני ושלב את חתיכות הרקמה בצינור 50 מ"ל המכיל מדיית דיסוציאציה אפיתל קרה (שלב 2.1.1).</li>
		<li>דגירה של חתיכות רקמת המעי הגס במדיית דיסוציאציה אפיתל למשך 90 דקות ב-4 מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה.</li>
		<li>אפשרו לשברי הרקמה לשקוע לתחתית הצינור, ולאחר מכן השליכו בזהירות את מדיית הדיסוציאציה האפיתליאלית מבלי לשבש את הרקמה. חזור על תהליך זה בעת שטיפת הרקמה 10-15 פעמים עם PBS קר 1x. יש להשליך כמה שיותר PBS במהלך הכביסה הסופית.</li>
		<li>הוסיפו מדיית דיסוציאציה של קריפטה (שלב 2.1.2) לצינור 50 מ"ל המכיל חתיכות רקמת המעי הגס ונענעו ברציפות במשך 5-10 דקות ביד. הערה: המדיה חייבת להיות עכורה מהקריפטות המנותקות.</li>
		<li>מתחת למכסה המנוע של תרביות התאים, סננו את הרקמה והמדיה באמצעות מסננת תאי ניילון בגודל 70 מיקרומטר (ראו טבלת חומרים) לתוך צינור טרי של 50 מ"ל.</li>
		<li>צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר ולהשליך את supernatant מבלי להפריע את הכדור המכיל קריפטה. הערה: בהתאם לציוד, ניתן להעביר את המדיה המתוחה לצינור של 15 מ"ל עבור צנטריפוגה.</li>
		<li>השהה את הכדור ב~ 3-4 מ"ל של PBS קר 1x.</li>
		<li>פיפטה 10 μL של הקריפטות המבודדות בשורה על שקופית מיקרוסקופ. תחת המיקרוסקופ, ספרו את מספר הקריפטות המלאות והארוכות כדי להעריך את ריכוז הקריפטה לכל 10 μL.</li>
		<li>חשב את הנפח המתאים של קריפטות כדי להסתובב למטה כדי לצלוח 10 קריפטות/μL בלוח של 96 בארות.</li>
	</ol></li>
</ol>3. ציפוי קריפטה
<ol><li>צנטריפוגה נפח מתאים של קריפטות מבודדות בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל ב 200 x גרם למשך 5 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>הסר בזהירות את הסופרנטנט באמצעות פיפטה של 1,000 μL מבלי לשבש את הקריפטות הגלולות.</li>
	<li>הוסף 100 μL של מטריצת ג'ל (מספיק לתשע בארות) לקריפטות הכדוריות ולפיפטה בזהירות כדי למנוע החדרת בועות אוויר. הערה: עיין בסעיף הדיון לקבלת תיאור מפורט של אופן הערבוב של מטריצת הג'ל והקריפטות. בדרך כלל, 100 μL מספיק עבור תשע בארות.</li>
	<li>אפשרו למטריצת הג'ל להתמצק חלקית (~1-2 דקות).</li>
	<li>צלחת 10 μL של מטריצת הג'ל מעורבבת עם הקריפטות בכל באר של צלחת תרבית 96 באר שחוממה מראש ליצירת צורת כיפה. הערה: מניחים את הכיפה במרכז הבאר. היזהרו לא לאפשר למטריצת הג'ל להתפשט לצידי הבאר. עיין בסעיף הדיון לקבלת תיאור מפורט על התמצקות וציפוי.</li>
	<li>אפשר למטריצת הג'ל להיות מוגדרת במלואה במשך 10-20 דקות באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO2.</li>
	<li>הכן את פתרון העבודה הסופי של מדיית L-WRN.<ol><li>יש להוסיף 100 μL פניצילין/סטרפטומיצין לאליקוט של 10 מ"ל של מדיית L-WRN (ראה שלב 2.1.3) (יציב במשך שבועיים ב-4 מעלות צלזיוס).</li>
		<li>הוסף תוספים ל-900 μL של מצע L-WRN עם פניצילין/סטרפטומיצין: 0.9 μL של 1 מ"ג/מ"ל EGF + 0.9 μL של 10 mM Y-27632 דיהידרוכלוריד. הערה: הכרכים מבוססים על תשע בארות. Y-27632 דיהידרוכלוריד מתווסף רק ביום 0 (בזמן הציפוי).</li>
	</ol></li>
	<li>הוסף 100 μL של מדיה לכל באר. היזהר לא לשבש את הכיפה.</li>
	<li>דגירה ב-37°C עם 5% CO2 למשך 24 שעות.</li>
</ol>4. יצירת נוקאאוט קלודין-7 בתרבות
<ol><li>אפשרו לקריפטות לגדול כרגיל בתרבית במשך 24 שעות לאחר הציפוי.</li>
	<li>בצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מ"ל, יש להוסיף 2.7 מיקרו-ליטר של 1 מילימול/ל' 4-הידרוקסיטמוקסיפן (4OH-טמוקסיפן) ל-900 מיקרו-ל' של מדיית L-WRN (ריכוז סופי של 3 מיקרומול/ל') + 0.9 מיקרו-ל' של 1 מ"ג/מ"ל EGF. הערה: תמיסת המלאי של 4OH-Tamoxifen מוכנה על-ידי ערבוב אבקת 4OH-טמוקסיפן (ראו טבלת חומרים) עם 1x PBS לריכוז של 1 mmol/L.</li>
	<li>הסר מדיה ישנה מהבארות באמצעות שאיבה בוואקום.</li>
	<li>הוסף 100 μL של מדיה המכילה 4OH-טמוקסיפן לכל באר ותייג אותם כקלודין-7 cKO/4OH-TAM. הערה: יש להוסיף DMSO לבארות הבקרה. יש להוסיף מדיה טרייה המכילה 4OH-טמוקסיפן כל יומיים.</li>
	<li>דגירה ב-37 מעלות צלזיוס עד לשינוי המדיה הבא (~2-3 ימים).</li>
</ol>5. תחזוקת אורגנואיד המעי הגס
הערה: יש לשנות את המדיה כל 2-3 ימים. תרבות עד 12 יום.
<ol><li>הכן פתרון עבודה סופי טרי של מדיית L-WRN: 900 μL של מדיית L-WRN + 0.9 μL של 1 מ"ג / מ"ל EGF.</li>
	<li>הסר מדיה ישנה מהבארות באמצעות שאיבה בוואקום. הוסיפו מדיה טרייה לבארות. הערה: היזהר לא לשבש את הכיפה.</li>
	<li>דגירה ב-37 מעלות צלזיוס עד לשינוי המדיה הבא. הערה: ניתן לשמור ולהעביר תרבויות למשך הזמן הרצוי לניסוי. התרביות של המחקר הנוכחי נשמרו בדרך כלל בין 9-12 ימים, אך ייתכן שתרצה להמשיך הלאה, במשך 15 או 20 יום.</li>
</ol>6. קציר והטבעה של אורגנואידים במעי הגס
<ol><li>הסר מדיה ישנה מהבארות באמצעות שאיבה בוואקום.</li>
	<li>לתקן את האורגנואידים עם 4% paraformaldehyde (PFA) במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר. הערה: PFA הוא חומר רעיל. נקוט אמצעי זהירות בעת שימוש במגיב זה.</li>
	<li>הסר 4% PFA מהבארות באמצעות שאיבה בוואקום והוסף 30% סוכרוז במשך 24 שעות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>תייג תבנית פלסטיק ומלא אותה עד 90% בתרכובת בטמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT) (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>יש להוציא 30% סוכרוז מהבארות באמצעות שאיבה בוואקום. הוסף 10 μL של 1x PBS לכל באר.</li>
	<li>בעזרת קצה פיפטה, מגרדים בעדינות את תחתית הבאר כדי לנתק את הכיפה המכילה אורגנואידים.</li>
	<li>בעזרת פיפטה, הסר את ה- PBS המכיל את האורגנואידים המנותקים וטען את הנוזל לתבנית המכילה OCT. הערה: יש להימנע מהכנסת בועות לתרכובת ה-OCT.</li>
	<li>המשך בתהליך זה עד שכל האורגנואידים יוסרו מכל הבארות.</li>
	<li>בבקבוק דיואר מפלדת אל-חלד, הוסיפו כדורי קרח יבש ו-2-מתילבוטאן (מספיק כדי לכסות את כדורי הקרח היבשים) (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>יש להחזיק בהתמדה את בלוק ה-OCT המכיל אורגנואיד מעל 2-מתילבוטאן כדי להקפיא את ההבזק.</li>
	<li>אחסנו את בלוק ה-OCT המכיל אורגנואיד בטמפרטורה של -80°C עד שיהיה מוכן למקטע (ניתן לאחסן אותו עד שנה).</li>
</ol>7. אימונופלואורסצנציה
<ol><li>חתכו את בלוק ה-OCT המכיל אורגנואיד בעובי של 5 מיקרומטר באמצעות קריוסטאט (ראו טבלת חומרים) בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>עבור כל קטע, בדוק מתחת למיקרוסקופ כדי לוודא שאורגנואיד נלכד. בסיום החיתוך, אחסנו את השקופיות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס עד שיהיו מוכנות להכתמה (ניתן לאחסן עד 6 חודשים).</li>
	<li>מחממים את המגלשות במאגר נתרן ציטראט של 10 mM למשך 10 דקות בטמפרטורה של 94 מעלות צלזיוס. הערה: החיץ נוצר על ידי המסת נתרן ציטראט במים שעברו דה-יוניזציה. התאם את ה- pH ל- 6 עם חומצה הידרוכלורית.</li>
	<li>תנו למגלשות להתקרר על הספסל למשך 20 דקות. יש לשטוף במים מזוקקים למשך 5 דקות.</li>
	<li>הרכיבו את השקופיות במדף צביעה (ראו טבלת חומרים) עם 0.2% Triton X-100 ודגירה עם גליצין של 100 mM למשך 15 דקות.</li>
	<li>יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS אחד למשך 5 דקות כל אחת. יש לחסום עם אלבומין בסרום בקר (BSA) למשך 45 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>דגירה עם claudin-7 נוגדן ארנב ראשוני22 (מדולל ב 1% BSA) לילה ב 4 מעלות צלזיוס. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS אחד למשך 10 דקות כל אחת.</li>
	<li>דגירה עם נוגדן משני נגד ארנב Cy323 (מדולל ב-1% BSA) למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר. יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS אחד למשך 10 דקות כל אחת.</li>
	<li>הרכב את המגלשות עם מדיום הרכבה מתאים (ראה טבלת חומרים) עם DAPI והוסף מכסה תלוש.</li>
</ol>8. זיהוי מוות תאי
<ol><li>לתקן את האורגנואידים בתוך הבארות עם 4% paraformaldehyde במשך 1 שעה בטמפרטורת החדר. יש לשטוף עם PBS אחד למשך 5 דקות.</li>
	<li>דגרו את צלחת התרבית על קרח עם 0.1% טריטון X-100 בחיץ נתרן ציטראט קר של 0.1% למשך 2 דקות. יש לשטוף פעמיים עם PBS אחד למשך 5 דקות כל אחד.</li>
	<li>הכן את תגובת TUNEL24,25 באמצעות TMR Red, ערכה לזיהוי מוות תאי באתרה(ראו טבלת חומרים). הוסף 50 μL של ריאגנטים לתגובת TUNEL לכל באר.</li>
	<li>דגירה באטמוספירה לחה במשך שעה אחת ב-37 מעלות צלזיוס בחושך. הערה: יש להשלים את כל השלבים הנותרים בחושך.</li>
	<li>יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS אחד למשך 5 דקות כל אחת. דגירה עם 1:2,500 Hoechst (מדולל ב 1x PBS, ראה טבלת חומרים) במשך 3 דקות.</li>
	<li>יש לשטוף שלוש פעמים עם PBS אחד למשך 5 דקות כל אחת. השתמש במסנן TRITC כדי להמחיש תמונות במיקרוסקופ פלואורסצנטי (ראו טבלת חומרים).</li>
</ol>

<ol><li>Hughes, C. S., Postovit, L. M., Lajoie, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrigel%3A+a+complex+protein+mixture+required+for+optimal+growth+of+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Matrigel: a complex protein mixture required for optimal growth of cell culture.</a> Proteomics. 10 (9), 1886-1890 (2010).</li>
<li>Sato, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+expansion+of+epithelial+organoids+from+human+colon%2C+adenoma%2C+adenocarcinoma%2C+and+Barrett%27s+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Long-term expansion of epithelial organoids from human colon, adenoma, adenocarcinoma, and Barrett's epithelium.</a> Gastroenterology. 141 (5), 1762-1772 (2011).</li>
<li>Wallach, T. E., Bayrer, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids%3A+new+frontiers+in+the+study+of+intestinal+disease+and+physiology%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pediatric+Gastroenterology+and+Nutrition%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids: new frontiers in the study of intestinal disease and physiology.</a> Journal of Pediatric Gastroenterology and Nutrition. 64 (2), 180-185 (2017).</li>
<li>Shankaran, A., Prasad, K., Chaudhari, S., Brand, A., Satyamoorthy, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+development+and+application+of+human+organoids%5BTitle%5D)+AND+%223+Biotech%22%5BJournal%5D)">Advances in development and application of human organoids.</a> 3 Biotech. 11 (6), 257(2021).</li>
<li>Angus, H., Butt, A., Schultz, M., Kemp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+organoids+as+a+tool+for+inflammatory+bowel+disease+research%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Medicine%22%5BJournal%5D)">Intestinal organoids as a tool for inflammatory bowel disease research.</a> Frontiers in Medicine. 6, 334(2020).</li>
<li>Fan, Y., Davidson, L. A., Chapkin, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+colonic+organoid+culture+system+and+down+stream+assay+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Murine colonic organoid culture system and down stream assay applications.</a> Methods in Molecular Biology. 1576, 171-181 (2019).</li>
<li>Gupta, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidics-based+3D+cell+culture+models%3A+Utility+in+novel+drug+discovery+and+delivery+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+and+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Microfluidics-based 3D cell culture models: Utility in novel drug discovery and delivery research.</a> Bioengineering and Translational Medicine. 1 (1), 63-81 (2016).</li>
<li>Yoo, J., Donowitz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intesitnal+enteroids%2Forganoids%3A+A+novel+platform+for+drug+discovery+in+inflammatory+bowel+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Intesitnal enteroids/organoids: A novel platform for drug discovery in inflammatory bowel diseases.</a> World Journal of Gastroenterology. 25 (30), 4125-4147 (2019).</li>
<li>Qu, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+intestinal+organoid+cultures+modeling+injury-associated+epithelial+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of intestinal organoid cultures modeling injury-associated epithelial regeneration.</a> Cell Research. 31 (3), 259-271 (2021).</li>
<li>Xing, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tight+junction+protein+claudin-7+is+essential+for+intestinal+epithelial+stem+cell+self-renewal+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cellular+and+Molecular+Gastroenterology+and+Hepatology%22%5BJournal%5D)">Tight junction protein claudin-7 is essential for intestinal epithelial stem cell self-renewal and differentiation.</a> Cellular and Molecular Gastroenterology and Hepatology. 9 (4), 641-659 (2020).</li>
<li>Ding, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inflammation+and+disruption+of+the+mucosal+architecture+in+claudin-7-deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Inflammation and disruption of the mucosal architecture in claudin-7-deficient mice.</a> Gastroenterology. 142 (2), 305-315 (2012).</li>
<li>Lu, Z., Ding, L., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudins+in+intestines%3A+distribution+and+functional+significance+in+health+and+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Barriers%22%5BJournal%5D)">Claudins in intestines: distribution and functional significance in health and diseases.</a> Tissue Barriers. 1 (3), 24978(2013).</li>
<li>Ding, L., Lu, Z., Lu, Q., Chen, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+claudin+family+of+proteins+in+human+malignancy%3A+a+clinical+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Management+and+Research%22%5BJournal%5D)">The claudin family of proteins in human malignancy: a clinical perspective.</a> Cancer Management and Research. 5, 367-375 (2013).</li>
<li>Bhat, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-7+expression+induces+mesenchymal+to+epithelial+transformation+%28MET%29+to+inhibit+colon+tumorigenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Claudin-7 expression induces mesenchymal to epithelial transformation (MET) to inhibit colon tumorigenesis.</a> Oncogene. 34 (35), 4570-4580 (2015).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-tight+junction+function+of+claudin-7-interaction+with+integrin+signaling+in+suppressing+lung+cancer+cell+proliferation+and+detachement%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cancer%22%5BJournal%5D)">A non-tight junction function of claudin-7-interaction with integrin signaling in suppressing lung cancer cell proliferation and detachement.</a> Molecular Cancer. 14, 120(2015).</li>
<li>Wang, K., Xu, C., Li, W., Ding, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+clinical+significance+of+claudin-7+in+colorectal+cancer%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Management+and+Research%22%5BJournal%5D)">Emerging clinical significance of claudin-7 in colorectal cancer: a review.</a> Cancer Management and Research. 10, 3741-3752 (2018).</li>
<li>Wang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Claudin-7+downregulation+induces+metastasis+and+invasion+in+colorectal+cancer+via+the+promotion+of+epithelial-mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Claudin-7 downregulation induces metastasis and invasion in colorectal cancer via the promotion of epithelial-mesenchymal transition.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 508 (3), 797-804 (2019).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+intestinal+stem+cells+based+on+surface+marker+combinations+and+colony-formation+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Gastroenterology%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of intestinal stem cells based on surface marker combinations and colony-formation assay.</a> Gastroenterology. 145 (2), 383(2013).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Severe+intestinal+inflammation+in+the+small+intestine+of+mice+induced+by+controllable+deletion+of+claudin-7%5BTitle%5D)+AND+%22Digestive+Diseases+and+Sciences%22%5BJournal%5D)">Severe intestinal inflammation in the small intestine of mice induced by controllable deletion of claudin-7.</a> Digestive Diseases and Sciences. 63 (5), 1200-1209 (2018).</li>
<li>Donovan, J., Brown, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Euthanasia%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">Euthanasia.</a> Current Protocols in Immunology. 73 (1), (2006).</li>
<li>Khalil, H., Nie, W., Edwards, R. A., Yoo, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+myofibroblasts+from+mouse+and+human+colon+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visual+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary myofibroblasts from mouse and human colon tissue.</a> Journal of Visual Experiments. (80), e50611(2013).</li>
<li>Sugimoto, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+signals+regulate+the+nuclear+receptor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion signals regulate the nuclear receptor activity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 116 (49), 24600-24609 (2019).</li>
<li>Mansour, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Connexin+30+expression+and+frewuency+of+connexin+heterogeneity+in+astrocyte+gap+junction+plaques+increase+with+age+in+the+rat+retina%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Connexin 30 expression and frewuency of connexin heterogeneity in astrocyte gap junction plaques increase with age in the rat retina.</a> PLoS One. 8 (3), 57038(2013).</li>
<li>Miranda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antioxidants+rescue+photoreceptors+in+rd1+mice%3A+relationship+with+thiol+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Biology+and+Medicine%22%5BJournal%5D)">Antioxidants rescue photoreceptors in rd1 mice: relationship with thiol metabolism.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (2), 216-222 (2010).</li>
<li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+ameliorate+oxidative+stress-induced+islet+endothelium+apoptosis+and+functional+impairment+via+Wnt4-%CE%B2-catenin+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research+and+Therapy%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells ameliorate oxidative stress-induced islet endothelium apoptosis and functional impairment via Wnt4-β-catenin signaling.</a> Stem Cell Research and Therapy. 8 (1), 188(2017).</li>
<li>Almeqdadi, M., Mana, M., Roper, J., Yilmaz, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gut+organoids%3A+mini-tissues+in+culture+to+study+intestinal+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology-Cell+Physiology%22%5BJournal%5D)">Gut organoids: mini-tissues in culture to study intestinal physiology and disease.</a> American Journal of Physiology-Cell Physiology. 317 (3), 405-419 (2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים על היעדר ניגוד עניינים.

תרבית אורגנואידית היא מודל מצוין לחקר תפקוד תאי גזע, פיזיולוגיה של המעי, גילוי תרופות, מחלות מעיים אנושיות והתחדשות ותיקון רקמות 7,8,9,10,11,26. אמנם יש לו יתרונות רבים, אך הוא יכול להיות מאתגר לבסס. יש להקפיד על כל השלבים לאורך הפרוטוקול, אך הכי חשוב בשלב הציפוי. בעת ערבוב הקריפטות המבודדות עם מטריצת ג'ל, הקפידו על פיפטה יסו...

תרבית אורגנואידית מעיים היא מערכת ex vivo תלת-ממדית (3D) שבה מבודדים תאי גזע משכבות המעיים של הרקמה הראשונית ומצופים למטריצת ג'ל 1,2. תאי גזע אלה מסוגלים להתחדשות עצמית, ארגון עצמי ותפקוד איברים2. אורגנואידים מחקים את המיקרו-סביבה של הרקמה ודומים יותר למודלים של in vivo מאשר למודלים דו-ממדיים (דו-ממדיים) של תרביות תאים במבחנה, אם כי פחות ניתנים למניפולציה מאשר לתאים 3,4. מודל זה מבטל מכשולים שנתקלים בהם במודלים דו-ממדיים, כגון היעדר הידבקויות תקינות בין תאים לתאים, אינטראקציות בין תאים ואוכלוסיות הומוגניות, וגם מצמצם את המגבלות של מודלים של בעלי חיים, כולל עלויות גבוהות ותקופות זמן ארוכות5. אורגנואידים במעיים - המכונים גם קולונואידים עבור אלה שגדלו מתאי גזע שמקורם בקריפטה של המעי הגס - הם למעשה מיני-איברים המכילים אפיתל הכולל את כל סוגי התאים שיהיו נוכחים ב- vivo, כמו גם לומן. מודל זה מאפשר מניפולציה של המערכת כדי לחקור היבטים רבים של המעי, כגון נישה של תאי גזע, פיזיולוגיה של המעי, פתופיזיולוגיה ומורפוגנזה של המעיים 3,5,6. הוא גם מספק מודל נהדר לגילוי תרופות, חקר הפרעות מעיים אנושיות כגון מחלות מעי דלקתיות (IBD) וסרטן המעי הגס, פיתוח טיפול מותאם אישית ספציפי למטופל, וחקר התחדשות רקמות 4,7,8,9. בנוסף, המערכת האורגנואידית יכולה לשמש גם לחקר תקשורת תאית, מטבוליזם של תרופות, כדאיות, התפשטות ותגובה לגירויים 7,8. בעוד שניתן להשתמש במודלים של בעלי חיים כדי לבחון טיפולים פוטנציאליים עבור מצבים פתולוגיים במעיים, הם מוגבלים למדי, מכיוון שחקר תרופות מרובות בו-זמנית מהווה אתגר. ישנם משתנים מבלבלים יותר in vivo, והעלות והזמן הקשורים הם גבוהים וארוכים, בהתאמה. מאידך גיסא, מערכת התרבית האורגנואידית מאפשרת סינון של טיפולים רבים בבת אחת בפרק זמן קצר יותר וכן מאפשרת טיפול מותאם אישית באמצעות שימוש בתרבית אורגנואידיתשמקורה בחולה 4,8. היכולת של אורגנואידים במעי הגס לחקות ארגון רקמות, מיקרו-סביבה ופונקציונליות הופכת אותם גם למודל מצוין לחקר התחדשות ותיקון רקמות9. המעבדה שלנו הקימה מערכת תרבית אורגנואידית במעי הדק כדי לחקור את ההשפעה של קלודין-7 על תפקודי תאי גזע במעי הדק10. במחקר זה הוקמה מערכת תרבית אורגנואידית במעי הגס כדי לחקור את יכולתם, או חוסר יכולתם של תאי גזע, לחדש את עצמם, להתמיין ולהתרבות במודל של נוקאאוט קלודין-7 מותנה (cKO).
קלודין-7 הוא חלבון חשוב מאוד של צומת הדוק (TJ) המתבטא מאוד במעי וחיוני לשמירה על תפקוד ותקינות TJ11. עכברי cKO סובלים מפנוטיפ דמוי IBD, המציג דלקת קשה, כיבים, רפיון תאי אפיתל, אדנומות ורמות ציטוקינים מוגברות11,12. בעוד שמקובל לחשוב שקלודינים חיוניים לתפקוד מחסום אפיתל, מתפתחים תפקידים חדשים לקלאודינים; הם מעורבים בהתפשטות, הגירה, התקדמות סרטן ותפקוד תאי גזע 10,12,13,14,15,16,17. כיום לא ידוע כיצד קלודין-7 משפיע על נישה של תאי גזע ותפקוד של תאי גזע במעי הגס. מכיוון שהמעי מתחדש במהירות כל 5-7 ימים בערך, תחזוקה של נישת תאי הגזע ותפקוד תקין של תאי הגזע הפעילים חיוניים18. כאן הוקמה מערכת לבחינת ההשפעות הרגולטוריות הפוטנציאליות של קלודין-7 על נישת תאי הגזע של המעי הגס.

<table><tbody><tr><td>0.09 רגל מעוקב מייבש ואקום חוסך מקום&nbsp;</td><td>ארצות הברית Plastic Corp</td><td>78564</td><td>תא הרדמה</td></tr><tr><td>0.5 M EDTA pH 8.0</td><td>Invitrogen</td><td>AM9261</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td>ThermoFisher</td><td>69715</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינורות צנטריפוגה חרוטיים</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>1x Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט</td><td>Gibco</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>2-methylbutane</td><td>Sigma</td><td>277258</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde</td><td>ThermoFisher</td><td>J61899. </td><td></td>AK</tr><tr><td>4-hydroxytamoxifen (4OH-TAM)</td><td>Sigma</td><td>579002</td><td></td></tr><tr><td>צינורות צנטריפוגה חרוטיים 50 מ"ל</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>70 ומיקרו; m מסננת תאי ניילון</td><td>קורנינג</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>96 צלחת תרבית</td><td>באר גריינר ביו-וואן</td><td>655180</td><td></td></tr><tr><td>B-27 תוסף (50x)</td> <td>Gibco</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1605-100</td><td></td></tr><tr><td>קלודין-7 נוגדן ארנב נגד עכברים</td><td>מעבדות אימונו-ביולוגיות&nbsp;</td><td>18875</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית (24 x 50-1.5)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12544E</td><td></td></tr><tr><td>Cryomolds</td><td>vwr</td><td>25608-916</td><td></td></tr><tr><td>Cultrex RCF BME, סוג 2</td><td>R& D Systems</td><td>3533-005-02</td><td>מטריצת ג'ל</td></tr><tr><td>Cy3 נוגדן נגד ארנב</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>111-165-003</td><td></td></tr><tr><td>Dewar Flask</td><td>Thomas Scientific</td><td>1173F61</td><td></td></tr><tr><td>DMEM גלוקוז גבוה עם L-גלוטמין</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>EVOS FLoid Imaging System</td><td>ThermoFisher</td><td>4477136</td><td></td></tr><tr><td>Fluoro-Gel II עם</td><td>DAPI Electron מדעי המיקרוסקופיה</td><td>17985-50</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>JT Baker</td><td>4059-02</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (1 מ') תמיסת חיץ</td><td>Gibco</td><td>15630-080</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst</td><td>ThermoFisher</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>ערכת זיהוי מוות תאים באתר, TMR Red</td><td>Roche</td><td>12156792910</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Pivetal</td><td>07-893-8440</td><td></td></tr><tr><td>L-WRN Media</td><td>בית הספר לרפואה של הרווארד גזירה ותרבות אורגנואידים במערכת העיכול N</td><td>/ A</td><td></td></tr><tr><td>ערכה כירורגית לעכבר</td><td>Kent Scientific Corporation</td><td>INSMOUSEKIT</td><td></td></tr><tr><td>עכברי EGF</td><td>PeproTech</td><td>315-09-500UG</td><td></td></tr><tr><td>N2 תוסף (100x)</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>תרכובת טמפרטורת חיתוך אופטימלית (OCT)&nbsp;</td><td>Agar Scientific</td><td>AGR1180</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>מתלה Sequenza</td><td>vwr</td><td>10129-584</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>S-279</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>מסנן ואקום (0.22 & מיקרו; m; אצטט תאית)</td><td>קורנינג</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 דיהידרוכלוריד</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1254</td><td></td></tr></tbody></table>

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

Three-Dimensional Culture of Murine Colonic Crypts to Study Intestinal Stem Cell Function Ex Vivo

אפיתל המעי מתחדש כל 5-7 ימים, ונשלט על ידי אוכלוסיית תאי הגזע של אפיתל המעי (IESC) הממוקמת בתחתית אזור הקריפטה. IESCs כוללים תאי גזע פעילים, המחדשים את עצמם ומתמיינים לסוגי תאי אפיתל שונים, ותאי גזע שקטים, המשמשים כתאי גזע עתודות במקרה של פציעה. התחדשות אפיתל המעי נשלטת על ידי יכולות ההתחדשות וההבחנה של IESCs פעילים אלה. בנוסף, איזון אוכלוסיית תאי הגזע בקריפטה ושמירה על נישת תאי הגזע חיוניים להתחדשות המעיים. תרבית אורגנואידית היא גישה חשובה ואטרקטיבית לחקר חלבונים, מולקולות איתות ורמזים סביבתיים המווסתים את ההישרדות והתפקוד של תאי גזע. דגם זה זול יותר, גוזל פחות זמן וניתן למניפולציה רבה יותר ממודלים של בעלי חיים. אורגנואידים גם מחקים את המיקרו-סביבה של הרקמה, ומספקים רלוונטיות in vivo . הפרוטוקול הנוכחי מתאר את בידודן של קריפטות המעי הגס, הטמעת תאי קריפטה מבודדים אלה במערכת מטריצת ג'ל תלת-ממדית והפיכת תאי קריפטה ליצירת אורגנואידים של המעי הגס המסוגלים לארגון עצמי, התפשטות, התחדשות עצמית והתמיינות. מודל זה מאפשר לאדם לתמרן את הסביבה - לדפוק חלבונים ספציפיים כגון claudin-7, הפעלה/השבתה של מסלולי איתות וכו' - כדי לחקור כיצד השפעות אלה משפיעות על תפקודם של תאי גזע במעי הגס. באופן ספציפי, נבדק תפקידו של חלבון הצומת ההדוק קלודין-7 בתפקוד תאי גזע המעי הגס. Claudin-7 חיוני לשמירה על הומאוסטזיס במעיים ועל תפקוד המחסום ותקינותם. נוקאאוט של קלודין-7 בעכברים גורם לפנוטיפ דמוי מחלת מעי דלקתית המציג דלקת מעיים, היפרפלזיה אפיתליאלית, ירידה במשקל, כיבים ברירית, רפיון תאי אפיתל ואדנומות. בעבר דווח כי קלודין-7 נדרש לתפקודי תאי גזע אפיתל במעי הדק. בפרוטוקול זה, מערכת תרבית אורגנואידית המעי הגס הוקמה כדי לחקור את התפקיד של claudin-7 במעי הגס.

כדי לבחון את ההשפעות הרגולטוריות של קלודין-7 על תאי גזע של המעי הגס, בודדו קריפטות של המעי הגס מרקמת המעי הגס כפי שתואר לעיל ומוצג באיור 1A. לאחר שהקריפטות בודדו מהרקמה הראשונית, הן צופו במטריצה תלת-ממדית בלוח של 96 בארות כדי לגדול במשך 11 ימים (איור 1). קריפטות בריאות רגילות יסגרו את הלומן ויהפכו לספרואידים עד היום השני, ובסופו של דבר יתחילו לנדוד וליצור את סוגי תאי האפיתל השונים בערך ביום 5 (איור 1B). קולונואידים הורשו לגדול עד לי...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הקמת מערכת אורגנואידית של המעי הגס כדי לחקור את הפעילות והתפקוד של תאי גזע המעי הגס במודל נוקאאוט של קלודין-7.

The intestinal epithelium regenerates every 5-7 days, and is controlled by the intestinal epithelial stem cell (IESC) population located at the bottom of ...

פרוטוקול זה מספק שיטה לחקור את התפקוד של תאי גזע המעי הגס בסביבה מניפולטיבית עם עלות נמוכה יותר בזמן מאשר מודלים של בעלי חיים. תרבית אורגנואידית מאפשרת לחקור את תפקוד תאי הגזע בסביבה נטולת מערכת החיסון. זה מאפשר לאתר את ההשפעות של גורם מסוים, כגון נוקאאוט של claudin-7.הבנת המנגנונים של תפקוד תאי גזע עשויה לשפוך אור על יעדים טיפוליים חדשים למחלות מתישות כמו מחלות מעי דלקתיות וסרטן המעי הגס. כדי להתחיל בבידוד של קריפטות המעי הגס מהעכבר המומת, בצע חתך של כשני סנטימטרים לאורך קו האמצע של העכבר. לאחר מכן, הצמד בחזרה את העור כדי לחשוף את הבטן.חותכים את המעי הגס ממש מתחת לקואקום מהצד הפרוקסימלי ומעל פי הטבעת מהצד הדיסטלי כדי לבודד את המעי הגס. לאחר מכן, להסיר את רקמת השומן מחובר המעי הגס באמצעות מלקחיים. לאחר דחיפת צואה מהמעי הגס המבודד עם הקצה השטוח של המלקחיים, חותכים את הרקמה פתוחה לאורך.שטפו את הרקמה 10 עד 15 פעמים עם PBS קר על ידי סיבוב הרקמה ב-PBS בין שטיפות עם מלקחיים. לאחר מכן באמצעות זוג מספריים נקיים וחדים, חותכים את הרקמה לחתיכות קטנות הנעות בין כשלושה לחמישה מילימטרים. לאחר בידוד המעי הגס מעכבר אחר, יש לשלב את כל חלקי הרקמה בצינור צנטריפוגה בקוטר 50 מיליליטר המכיל מדיית דיסוציאציה אפיתליאלית קרה ולדגור את חלקי רקמת המעי הגס במדיית דיסוציאציה אפיתליאלית למשך 90 דקות בארבע מעלות צלזיוס עם נדנדה עדינה.לאחר הדגירה, אפשרו לשברי הרקמה לשקוע לתחתית הצינור. לאחר ההתיישבות, יש להשליך את מדיית הדיסוציאציה האפיתליאלית מבלי לשבש את שברי הרקמות. חזור על התהליך בעת שטיפת הרקמה 10 עד 15 פעמים עם PBS קר.יש להשליך כמה שיותר PBS במהלך הכביסה הסופית. לאחר מכן, הוסיפו מדיית דיסוציאציה קרה לחתיכות רקמת המעי הגס השטופות בצינור של 50 מיליליטר ונערו במשך חמש עד 10 דקות ביד. מתחת למכסה המנוע של תרבית התאים, סננו את המדיה המכילה את הרקמה באמצעות מסננת תאי ניילון בגודל 70 מיקרון לתוך צינור צנטריפוגה טרי של 50 מיליליטר.לאחר הסינון, צנטריפוגה של הצינור ב 200 G במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר, ולאחר מכן השלכת supernatant מבלי להפריע את הקריפטות כדורי. להשעות את הכדור בשלושה עד ארבעה מיליליטר של PBS קר. פיפטה 10 מיקרוליטר של מתלה הקריפטה בשורה על שקופית מיקרוסקופ.באמצעות המיקרוסקופ, יש לספור את מספר הקריפטות המלאות והארוכות כדי להעריך את ריכוז הקריפטות ולחשב את נפח הקריפטות המתאים הנדרש לצלחת 10 קריפטות למיקרוליטר בלוח של 96 בארות. צנטריפוגה נפח מתאים של קריפטות מבודדות בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר ב 200 G במשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן, הסר את הסופרנטנט באמצעות פיפטה של 1, 000 מיקרוליטר מבלי לשבש את הקריפטות הגלולות.לאחר מכן, הוסף 100 מיקרוליטרים של מטריצת ג'ל לקריפטות הכדוריות מבלי להציג בועות אוויר. המתן דקה עד שתי דקות עד שמטריצת הג'ל תתמצק חלקית. לאחר מכן, צלחת 10 מיקרוליטרים של מטריצת הג'ל מעורבבים עם הקריפטות בכל באר של צלחת תרבית 96 באר שחוממה מראש כדי ליצור צורת כיפה.יש להמתין 10 עד 20 דקות עד להגדרה מלאה של מטריצת הג'ל על ידי הנחת הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני. לבסוף, הוסיפו 100 מיקרוליטרים של תמיסת העבודה הטרייה של מדיה L-WRN בתוספת אנטיביוטיקה לכל באר ודגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תחת 5% פחמן דו חמצני למשך 24 שעות. כדי לקצור את האורגנואידים, הסר מדיה ישנה מהבארות על ידי הפעלת שאיבה ואקום ותקן את האורגנואידים עם 4% paraformaldehyde במשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.לאחר מכן הסר 4% paraformaldehyde מן הבארות על ידי שאיבה ואקום ולטפל אורגנואידים עם 100 microliters של 30% סוכרוז לכל באר בארבע מעלות צלזיוס. לאחר 24 שעות, יש להסיר 30% סוכרוז מהבארות על ידי שאיבה בוואקום לפני הוספת 10 מיקרוליטרים של PBS לכל באר. השתמש בקצה פיפטה כדי לגרד בעדינות את החלק התחתון של הבאר כדי לנתק את האורגנואידים המכילים כיפה.לאחר מכן, הסר את ה- PBS המכיל את האורגנואידים המנותקים מהבאר עם פיפטה והעבר אותו לתבנית פלסטיק מסומנת מלאה 90% עם טמפרטורת חיתוך אופטימלית, או OCT, תרכובת. ממשיכים בתהליך עד שכל האורגנואידים הוסרו מכל הבארות. הוסיפו 2-מתילבוטאן לבקבוק דיואר מפלדת אל-חלד המכיל כדורי קרח יבשים, מספיק כדי לכסות את הכדורים.הקפיאו את האורגנואיד המכיל בלוק OCT על ידי החזקתו בהתמדה מעל 2-מתילבוטאן. לבסוף, אחסנו את בלוק ה-OCT המכיל אורגנואיד במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שיהיה מוכן לחתך. התמונה המייצגת מדגישה את הצמיחה המוצלחת של קולונואידים מקריפטות רגילות המכילות קלודין-7.הקריפטות שהכילו קלודין-7 החלו ליצור ספרואידים ביום השני, התחילו לנדוד ביום החמישי, והמשיכו לגדול ולנבוט עד שנקטפו ביום התשיעי. לעומת זאת, קריפטות חסרות קלודין-7 לא הצליחו ליצור קולונואידים תקינים. לאחר טיפול עם 4-hydroxytamoxifen במשך יומיים עד שלושה ימים, קריפטות נוקאאוט claudin-7 הופיעו כגושים עגולים של תאים.שלא כמו הבקרה, הקריפטות לא גדלו לספרואידים בריאים. הכתמה אימונופלואורסצנטית של קלאודין-7 בבקרה שנקטפה והאורגנואידים המותנים של נוקאאוט אישרו את הנוקאאוט המוצלח של קלודין-7 בתרבית. מושבי הבקרה הפגינו מעט מאוד אות אפופטוטי ביום התשיעי.עם זאת, קולונואידים נוקאאוט claudin-7 הציגו אפופטוזיס גבוה באותו זמן. יש לוודא התמצקות חלקית לפני הציפוי. ציפוי לפני התמצקות חלקית יגרום למטריצת הג'ל להתפשט והכיפה לא תיווצר, מה שישפיע על הישרדותן וצמיחתן של הקריפטות.פרוטוקול זה עשוי לשמש לגילוי תרופות, חקר תקשורת תאית, חילוף חומרים של תרופות, כדאיות, שגשוג ופיתוח טיפול מותאם אישית ספציפי למטופל. כינון התרבות האורגנואידית חולל מהפכה בחקר מחלות וברפואה מותאמת אישית.

three-dimensional-culture-murine-colonic-crypts-to-study-intestinal

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

בסרטון זה אנו מדגימים טכניקה לבידוד קריפטים שלמים מהמעי הדק של עכבר. ניתן להשתמש בקריפטים השלמים המבודדים כדי להפיץ אורגנואידים תלת-ממדיים מאריכי חיים ומתחדשים במבחנה.

בידוד קריפטים במעי: שיטה לבידוד קריפטות שלמות ממודל המעי הדק של מורין

טכנולוגיית הדמיה משופרת מאפשרת הדמיה תלת מימדית של איברים במהלך ההתפתחות. כאן אנו מתארים מערכת תרבית איברים שלמה המאפשרת הדמיה חיה של הווילי המתפתח במעי העכבר העוברי.

מערכת תרבות עכבר העוברי שלם מעי ל Ex Vivo מניפולציה של מסלולי איתות והדמית חיה תלת ממדית של פיתוח שליה

אנו מתארים שיטה להקמת אנטרואידים אנושיים מקריפטות מעי דק וקולונואידים מקריפטות המעי הגס שנאספו הן מרקמות כירורגיות והן מביופסיות. במאמר מתודולוגי זה, אנו מציגים את אופני התרבות החיוניים לצמיחה ותחזוקה מוצלחת של אנטרואידים וקולונואידים אנושיים.

הקמתו של ארגון Human אפיתל Enteroids וColonoids מרקמות שלמות וביופסיה

תאי אפיתל במעי גזע (ISCs) מתערבבים עם תאי פנט. תאים אלה נבדלים צאצאים של ISC, התומך בISCs ולספק הגנה אנטי-בקטריאלי. כאן אנו מדגימים כיצד אנו השתמשנו במודלי עכבר מהונדסים מותנים לקבוע כי תאי פנט לשחק תפקיד מכריע בשמירה על epithelia המעיים.

פרוטוקולים לניתוח תפקידם של תאי פנט התחדשות Murine המעי באמצעות מותנה<em&gt; Cre-לקס</em&gt; מודלי עכבר

אנו מתארים הוראות צעד אחר צעד ל: 1) ביעילות מהנדס מעיים אורגנואידים באמצעות ננו חלקיקים מגנטיים עבור התמרה-או כפוף, ו, 2) ליצור קטעים קפואים מן הנדסה ארגונית. גישה זו מספקת כלי רב עוצמה כדי לשנות ביעילות ביטוי גנים באורגנואידים לחקירת השפעות במורד הזרם.

הנדסה גנטית של מעיים עכבר ראשי אורגנואידים באמצעות מגנטית ננו-חלקיק התמרה וקטורים ויראלי עבור הקפאת שימוש

כאן, אנו מציגים פרוטוקול התרבות האנושית enteroid או monolayers colonoid שיש להם פונקציה נפגע המחסום ללמוד אינטראקציות אפיתל-microbiota מארח ברמה התאית וביוכימי.

Monolayers Colonoid האדם ללמוד אינטראקציות בין גורמי מחלה, Commensals אפיתל המעי מארח

ההליך מתאר בידוד של villi מן אפיתל מעי העכבר עובר דיפרנטיציה כדי לקבוע את פוטנציאל יצירת האורגנויד שלהם.

פולחן תלת מימדי של אורגנוידים מאפיתל וילי במעיים העוברים דיפרנציה

בפרוטוקול זה, אנו מתארים כיצד ליצור מונוליירים אפיתל ראשוניים של אפיתל ישירות מקריפטות מעיים. אנו מספקים גישות ניסיוניות כדי ליצור monolayers confluent על מסננים חדירים, monolayers confluent לריפוי פצעי גירוד ומחקרים ביוכימיים, ו monolayers דליל ונוח לניתוח כשל חיסוני.

דור של מונוליירים אפיתל המעי הגס הראשי מורין מקריפטות מעיים

אנו מתארים פרוטוקול המפרט את הבידוד של קריפטים המעי הגס מורין לפיתוח קולונואידים תלת ממדיים. לאחר מכן ניתן להתמיין באופן סופני בין הקולונואידים המבוססים כדי לשקף את ההרכב התאי של אפיתל המארח לפני קבלת אתגר דלקתי או הפניה להקמת חד-שכבה אפיתליאלית.

חקר ההשפעות האפיתליאליות של דלקת מעיים במבחנה על קולונואידים מורינים מבוססים

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד קריפטים של מעי דק מורין ואורגנואידים תלת-ממדיים של תרבית מעיים מהקריפטים. בנוסף, אנו מתארים שיטה ליצירת אורגנואידים מתא גזע יחיד במעי בהיעדר נישה תאית תת-אפיתלית.

תרבית תלת-ממדית של אורגנואידים מקריפטים של מעי מורין ותא גזע יחיד למחקר אורגנואידים

כאן אנו מתארים בניית מערכת מודל בסיסית תלת ממדית (3D) של קו תאי מעי ופרוטוקול הטמעת פרפין להערכה מיקרוסקופית קלה של מקבילות מעיים קבועות. צביעה של חלבונים נבחרים מאפשרת ניתוח של פרמטרים חזותיים מרובים מניסוי יחיד לשימוש פוטנציאלי במחקרי סינון תרופות פרה-קליניים.

מערכת מודל מעי תלת-ממדית בסיסית (3D) עם מרכיב חיסוני

חקור תרבית אורגנואידים תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס במודל עכברי לחקר תפקוד תאי גזע. שיטה זו מאפשרת ניתוח השפעת מחיקת claudin-7 על פעילות תאי הגזע ומספקת פלטפורמה לחקר מחלות מעיים.

תרבית תלת-ממדית של קריפטות המעי הגס של מורין לחקר תפקוד תאי גזע במעיים ex vivo

גלה סרטונים נוספים