מעגלים דיגיטליים גנטיים המבוססים על מערכות CRISPR-Cas וחלבונים אנטי-קריספר

הפרוטוקול שלנו מסביר כיצד לתכנן, לבנות ולנתח מעגלים דיגיטליים של גנים של שמרים המשתמשים במערכות CRISPR dCas מסוג שתיים וחמש ובחלבוני האנטי-קריספר המתאימים. זה הרכבה להישאר כי זה אוסף אפס נהלים סטנדרטיים כדי להרכיב ולבדוק רשתות תמלול סינתטי בשירותים. כדי להתחיל, הכינו תערובת תגובה המכילה 20 עד 40 ננוגרם של תבנית DNA, מיקרוליטר אחד של פריימר קדמי, מיקרוליטר אחד של פריימר הפוך, חמישה מיקרוליטרים של תערובת DNTP, 0.5 מיקרוליטר של DNA פולימראז, 10 מיקרוליטרים של חיץ תגובת DNA פולימראז 5x, ומים מזוקקים פעמיים עד לנפח כולל של 50 מיקרוליטר.

להגביר את רצפי ה- DNA באמצעות תוכנית ה- PCR touchdown על thermocycler כמתואר בכתב היד. בודדו את מוצרי ה-PCR באמצעות אלקטרופורזה בג'ל ודללו את רצפי ה-DNA מג'ל האגרוז באמצעות ערכת מיצוי ג'ל DNA. באמצעות שיטת ההרכבה של גיבסון, הכניסו את מוצרי ה-PCR המטוהרים לווקטור המעבורת החתוך-פתוח על ידי הכנסת תערובת הדנ"א השקולה בטמפרטורה של 50 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת.

בנה את וקטור הקבלה dCas12a באמצעות PCR טאצ'דאון ושיטת ההרכבה של גיבסון כפי שהודגם בעבר. הכנס את קודון השמרים הממוטב לחלבוני dCas12a לשני וקטורי הקבלה החדשים שנבנו באמצעות עיכול עם BamH1 ו- Xhol1 וקשירה עם ליגאז DNA T4. באופן דומה, בנו את הפלסמידים על בסיס וקטור המעבורת pRS2403 כדי לבטא את חלבוני האנטי-קריספר באמצעות PCR טאצ'דאון ושיטת ההרכבה של גיבסון.

כדי לבצע זיהוי תאי מיקרוסקופיה, הניחו שני מיקרוליטרים של תמיסת התא על מגלשת זכוכית וכסו אותה בהחלקת כיסוי. התבוננו בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי על ידי הפעלת מקור האור הפלואורסצנטי, המיקרוסקופ והמחשב. לאחר כתיבת מספר מקור האור הפלואורסצנטי, פתח את תוכנת המיקרוסקופ במחשב.

הניחו את השקופית על במת המיקרוסקופ ובחרו את עדשת ה-40x האובייקטיבית תוך התבוננות בתאים תחת האור הירוק. הזיזו את ידית מיקוד המסלול עד שיופיע קווי המתאר של תאי השמרים ואת ידית המיקוד העדינה כדי למקד את התאים. כדי לזהות את התאים, לאחר סגירת שדה הראייה של המיקרוסקופ לעבור למסך המחשב ולחץ על חי.

המתן שלוש עד חמש שניות. לחץ על צלם כדי לצלם תמונה ולשמור את התמונה. לאחר מכן, כבה את המחשב, המיקרוסקופ ומקור האור הפלואורסצנטי.

הפעל את מכונת FACS 20 דקות לפני המדידות כדי לחמם את הלייזר ולערבב 20 מיקרוליטר של תרבית התאים עם 300 מיקרוליטר של מים מזוקקים כפול. הפעל את תוכנת FACS במחשב המחובר למחשב FACS וצור ניסוי חדש. לאחר מכן הגדר את פרמטרי המדידה.

לאחר מכן, בחר את המסנן בהתאם לאורכי גל העירור והפליטה של הדגימות והגדר את מספר תא הרכישה ל -10, 000. כוונן את מתח מסנן FITC על ידי מדידת עוצמת החרוזים הפלואורסצנטיים, וודא שההבדל היחסי בעוצמת החרוזים בין שני ניסויים עוקבים אינו עולה על 5% שטוף את המכונה במים מזוקקים כפול למשך מספר שניות כדי להסיר חרוזים עודפים אפשריים. מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של הדגימה ולחץ על תצוגה מקדימה תוך המתנה של שלוש עד חמש שניות ליציבות הזרקת הדגימה.

לבסוף לחץ על רכישה. מדדו שוב את החרוזים בסוף הניסוי. לאחר בדיקה אם ההבדל היחסי בין שתי מדידות החרוזים עולה על 5%ייצא את נתוני FACS כקבצי FCS.

פתח את סטודיו R וטען את BDverse_analysis התסריט. R כדי לנתח את קבצי FCS. הגדר את שם הניסוי כ- ename, נתיב הספרייה שבו מאוחסנים קבצי FCS כ- dir_d וקובצי התוצאה ייווצרו כ- dir_r.

לאחר מכן, הגדר את ערוץ הפלואורסצנטיות. הגדר את מספר הדגימות שנמדדו. הממדים של חלקות נקודות והאורך המרבי של ציר x ו- y עבור חלקות עמודות וחלקות תיבות.

בחר את שיטת הדירוג על ידי הסרת hashtag מן השורות המתאימות. בחר בעצם flowSet המגודר בהתאם לשיטת gating שנבחרה וברזולוציית התוויית הנקודות, שצריכה להיות שווה לפחות ל- 256. בטל את הערות שתי הוראות הסינון כדי להסיר מדידות שבהן הפלואורסצנטיות שלילית ולהסיר חריגות עקב ניסויים אחרים כמתואר בכתב היד.

לחץ על המקור והפעל את הסקריפט. כל הקבצים המכילים את תוצאות הניתוח נוצרים ב- dir_r. יעילות ההפעלה הטובה ביותר של dSpCas9-VP64 הושגה כאשר היו שישה אתרי יעד של lexOp במקדם הסינתטי.

בעוד עבור dCas12a-VPR יעילות ההפעלה הגבוהה ביותר כאשר שלושה עותקים של lexOp הוכנסו לתוך המקדם הסינתטי. ההפעלה על ידי RNA קריספר ורנ"א מנחה יחיד הממוקם על פלסמיד אינטגרטיבי הייתה גבוהה פי 1.4 עד 2.4, ופי 1.1 עד 1.5 יותר מאשר כאשר הונחה על פלסמיד אפיזומלי. תוצאות RT-qPCR הראו כי וקטור אפיזומלי הפיק רמה גבוהה בהרבה של RNA קריספר מדריך יחיד מאשר וקטור אינטגרטיבי, ללא קשר למערכת הביטוי.

יעילות ההפעלה של dSpCas9 מורכב RNA פיגומים גיוס MCP-VP64 נבדקה. RNA הפיגום שהכיל סוג פראי יחיד וסיכת ראש F6MS2 נתן הפעלה של פי 5.27 ופי 4.3 בהתאמה. עם זאת, השילוב של שתי סיכות הראש הביא לקיפול של 7.54 עם יעילות ההפעלה הגבוהה ביותר.

ארבעה מקדמים שונים שימשו כדי להניע את הביטוי של שלושה סוגים של אנטי קריספר סוג 2, מה שמראה שהם עובדים באופן תלוי מינון. מקדם חזק הפחית את רמת הפלואורסצנטיות ל-0.21, 0.11 ו-0.13 מערכו בהתאמה. עקומת הטיטרציה מראה שהמעגל מתנהג כמו הילוך קשר עם יחס הפעלה לסירוגין שמתקרב ל-2.3.

סוג חמש אנטי-קריספר A אחד מפחית את ביטוי הפלואורסצנטיות של denAS-Cas12a ו-dLB-Cas12a כמפעילים מ-19% ל-71%הקשר בין מפעילים ומדכאים נחקר כאשר Acr-VA הציג תנודות גדולות בביצועיו כאשר הופק על ידי pGAL1 תחת pTEF1 וגנטי CYC1t-pCYC1noTata מסוג חמש אנטי-CRISPR-A1 הראה דיכוי מסוים ב-dLB Cas12a החשוף בלבד. מכונת FACS היא שברירית, ולכן יש לטפל בה בזהירות. תמיסת התא לעולם לא צריכה להיות צפופה מדי והמכונה תישמר נקייה.