Name: ניתוח אוכלוסייה ותא בודד של התמדה אנטיביוטית ב- Escherichia coli (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-03-24T13:50:00.000+00:00
Duration: 12 min 29 s
Description: חקור התמדה אנטיביוטית ב-Escherichia coli באמצעות שילוב של מבחני מיקרוביולוגיה קלאסיים עם הדמיית תאים בודדים. השיטה מאפשרת אפיון מולקולרי ותאי של תופעת ההתמדה ברמות האוכלוסייה והתא הבודד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

העבודה במעבדת ואן מלדרן נתמכת על ידי פעולות ARC 2018-2023, Fonds National de la Recherche Scientifique (FNRS CDR J.0182.21F). T.O. נתמך על ידי מלגת ULB. T.S. נתמכת על ידי מלגת FRIA (FNRS). J.C. נתמך על ידי מלגת פוסט-דוקטורט "chargé de recherches" (FNRS).

<ol><li>Balaban, N. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definitions+and+guidelines+for+research+on+antibiotic+persistence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence.</a> Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).</li>
<li>Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinguishing+between+resistance%2C+tolerance+and+persistence+to+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment.</a> Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).</li>
<li>Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress-induced+mutagenesis%2C+gambler+cells%2C+and+stealth+targeting+antibiotic-induced+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution.</a> mBio. 13 (3), 01074(2022).</li>
<li>Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposon-sequencing+analysis+unveils+novel+genes+involved+in+the+generation+of+persister+cells+in+uropathogenic+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Antimicrobial+Agents+and+Chemotherapy%22%5BJournal%5D)">Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli.</a> Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).</li>
<li>Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genetic+determinant+of+persister+cell+formation+in+bacterial+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens.</a> Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).</li>
<li>Cui, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+involved+in+bacteriostatic+antibiotic-induced+persister+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation.</a> Frontiers in Microbiology. 9, 413(2018).</li>
<li>Li, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+novel+genes+involved+in+Escherichia+coli+persistence+to+tosufloxacin%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Cellular+and+Infection+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin.</a> Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986(2020).</li>
<li>Verstraeten, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obg+and+membrane+depolarization+are+part+of+a+microbial+bet-hedging+strategy+that+leads+to+antibiotic+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance.</a> Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).</li>
<li>Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+persister+fractions+suggests+different+mechanisms+of+formation+among+environmental+isolates+of+E.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli.</a> BMC Microbiology. 13 (1), 25(2013).</li>
<li>Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+resistance+and+persistence-Implications+for+human+health+and+treatment+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Reports%22%5BJournal%5D)">Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives.</a> EMBO Reports. 21 (12), 51034(2020).</li>
<li>Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+mechanisms+leading+to+persister+formation+and+awakening%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">General mechanisms leading to persister formation and awakening.</a> Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).</li>
<li>Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+is+an+important+determinant+of+fluoroquinolone+persister+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival.</a> Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).</li>
<li>Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluoroquinolone+persistence+in+Escherichia+coli+requires+DNA+repair+despite+differing+between+starving+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations.</a> Microorganisms. 10 (2), 286(2022).</li>
<li>Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persistence+as+a+phenotypic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Bacterial persistence as a phenotypic switch.</a> Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).</li>
<li>Morawska, L. P., Kuipers, O. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+tolerance+in+environmentally+stressed+Bacillus+subtilis%3A+Physical+barriers+and+induction+of+a+viable+but+nonculturable+state%5BTitle%5D)+AND+%22microLife%22%5BJournal%5D)">Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state.</a> microLife. 3, (2022).</li>
<li>Windels, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+persisters+enabled+by+a+%C3%9F-lactam-induced+filamentation+method+reveals+their+stochastic+single-cell+awakening%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Enrichment of persisters enabled by a ß-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening.</a> Communications Biology. 2 (1), 426(2019).</li>
<li>Leygeber, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+microbial+population+heterogeneity-Expanding+the+toolbox+of+microfluidic+single-cell+cultivations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations.</a> Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).</li>
<li>Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Response+of+Escherichia+coli+growth+rate+to+osmotic+shock%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).</li>
<li>Shi, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Starvation+induces+shrinkage+of+the+bacterial+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118(2021).</li>
<li>Goode, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persister+Escherichia+coli+cells+have+a+lower+intracellular+pH+than+susceptible+cells+but+maintain+their+pH+in+response+to+antibiotic+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment.</a> mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).</li>
<li>Manuse, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+persisters+are+a+stochastically+formed+subpopulation+of+low-energy+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biology%22%5BJournal%5D)">Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells.</a> PLoS Biology. 19 (4), 3001194(2021).</li>
<li>Fisher, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Four-dimensional+imaging+of+E.+coli+nucleoid+organization+and+dynamics+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells.</a> Cell. 153 (4), 882-895 (2013).</li>
<li>Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotic+persistence+as+a+metabolic+adaptation%3A+Stress%2C+metabolism%2C+the+host%2C+and+new+directions%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceuticals%22%5BJournal%5D)">Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions.</a> Pharmaceuticals. 11 (1), 14(2018).</li>
<li>Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agar+and+broth+dilution+methods+to+determine+the+minimal+inhibitory+concentration+%28MIC%29+of+antimicrobial+substances%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances.</a> Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).</li>
<li>Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+imaging+and+characterization+of+Escherichia+coli+persister+cells+to+ofloxacin+in+exponential+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Science+Advances%22%5BJournal%5D)">Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures.</a> Science Advances. 5 (6), (2019).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+An+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: An open-source platform for biological-image analysis.</a> Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicrobeJ%2C+a+tool+for+high+throughput+bacterial+cell+detection+and+quantitative+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Microbiology%22%5BJournal%5D)">MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis.</a> Nature Microbiology. 1 (7), 16077(2016).</li>
<li>Odsbu, I., Skarstad, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+compaction+in+the+early+part+of+the+SOS+response+is+dependent+on+RecN+and+RecA%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA.</a> Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).</li>
<li>Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quinolone+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22MedChemComm%22%5BJournal%5D)">Quinolone antibiotics.</a> MedChemComm. 10 (10), 1719-1739 (2019).</li>
<li>Drlica, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quinolones%3A+Action+and+resistance+updated%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Topics+in+Medicinal+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quinolones: Action and resistance updated.</a> Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).</li>
<li>Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+antibiotics+kill+bacteria%3A+From+targets+to+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Microbiology%22%5BJournal%5D)">How antibiotics kill bacteria: From targets to networks.</a> Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).</li>
<li>Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+and+architecture+of+active+DNA+replication+machinery+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli.</a> Science. 328 (5977), 498-501 (2010).</li>
<li>Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RecA+bundles+mediate+homology+pairing+between+distant+sisters+during+DNA+break+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair.</a> Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).</li>
<li>Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+interactions+of+early+and+late+assembling+division+proteins+in+Escherichia+coli+cells+resolved+by+FRET%3A+Bacterial+division+studied+by+spectral+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET.</a> Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).</li>
<li>Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+secretion+and+synaptic+transmission+with+pH-sensitive+green+fluorescent+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins.</a> Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).</li>
<li>Yaginuma, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diversity+in+ATP+concentrations+in+a+single+bacterial+cell+population+revealed+by+quantitative+single-cell+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging.</a> Scientific Reports. 4, 6522(2014).</li>
<li>Ermakova, Y. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Red+fluorescent+genetically+encoded+indicator+for+intracellular+hydrogen+peroxide%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide.</a> Nature Communications. 5, 5222(2014).</li>
<li>Kapuscinski, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAPI%3A+A+DNA-specific+fluorescent+probe%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnic+%26+Histochemistry%22%5BJournal%5D)">DAPI: A DNA-specific fluorescent probe.</a> Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

הפרוטוקול המוצג במאמר זה מאפשר ניתוח של פנוטיפ ההתמדה שנצפה בתגובה לטיפול אנטיביוטי באוכלוסייה וברמת התא הבודד. הניסויים בוצעו עם זן E. coli MG1655, אשר גדל בתווך מוגדר כימית (MOPS גליצרול 0.4%). מבחני הרג בזמן וניסויים במיקרוסקופ בוצעו על תרביות פאזה מעריכית. השתמשנו ב-OFX, פלואורוקינולון, בריכוז של 5 מיקרוגרם·מ"ל−1 כדי לחשוף את התאים המתמידים. הגישות המתוארות כאן יכולות להיות מיושמות על אנטיביוטיקה חיידקית אחרת, כגון β-lactams, aminoglycosides, או תרכובות מיקרוביאליות31. בהתאם לכך, ניתן להשתמש בזני חיידקים אחרים, מדיה או תנאי גידול. ניטור איחוי פלואורסצנטי שונה במערך דומה לזה המתואר כאן יכול להיות שימושי למעקב אחר תהליכים תאיים כגון שכפול דנ"א32, תיקון דנ"א25,33 וחלוקת תאים34 לפני, במהלך ואחרי הטיפול האנטיביוטי. באופן דומה, ניתן לנצל כתבים פלואורסצנטיים כדי לחקור היבטים שונים של פיזיולוגיה של התא, כגון רמות pH 35, ATP36 או ROS37. לחלופין לאיחוי פלואורסצנטי, ניתן ליישם גם צבעים כימיים. לדוגמה, היתוך hupA-mCherry יכול להיות מוחלף על ידי 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI), צבע פלואורסצנטי שמכתים DNA38. עם זאת, יש להימנע מביצוע מיקרוסקופ בהילוך מהיר בשילוב עם צבעים פלואורסצנטיים כאלה, מכיוון שטכניקות צביעה אלה יכולות להפריע לדינמיקה של מחזור התא במהלך ניסויים בהילוך מהיר. לחלופין, ניסויים כאלה יכולים להיות מוחלפים על ידי ניתוח מסלול זמן של הדמיית בזק בנקודות זמן רלוונטיות.
בעוד שכתבים פלואורסצנטיים כאלה מועילים, אין להזניח את כמות המידע שניתן לחלץ באמצעות ניתוח תמונות עם ניגודיות פאזה. כאן, עקבנו אחר התפתחות אורך התא לאורך שלבי הגדילה, הטיפול ב-OFX וההתאוששות. פרמטרים אחרים המבוססים על תמונות עם ניגודיות פאזה, כגון רוחב התא, עוצמת ניגודיות הפאזה והעקמומיות של תאי החיידקים, יכולים גם הם להיות מופקים בקלות באמצעות תוכנה מתאימה, כגון MicrobeJ27.
לסיכום, ההליך המתואר כאן יכול להיות מיושם על תנאים אחרים ומיני חיידקים כדי לנטר תגובות תאיות לסביבות משתנות או גורמי עקה18,19. על ידי שימוש בכתבים פלואורסצנטיים אחרים (כתבי תמלול ותרגום, צבע כימי) בשילוב עם ניתוח אוכלוסייה, כגון ציטומטריית זרימה / FACS, ניתן להתייחס לשאלות מעניינות במסגרת רב-ממדית.

פרוטוקול זה נועד לנתח את פנוטיפ ההתמדה החיידקית בתגובה לטיפול אנטיביוטי ספציפי ברמת התא הבודד והאוכלוסייה. התמדה מתארת את היכולת של תת-אוכלוסיות קטנות בתוך אוכלוסייה איזוגנית לסבול מינונים גבוהים של אנטיביוטיקה חיידקית (פלואורוקינולונים, אמינוגליקוזידים, β-לקטמים וכו '), כאשר הריכוז המעכב המינימלי (MIC) של מה שמכונה תאים מתמידים זהה לזה של רוב האוכלוסייה. דינמיקת הרג ביפאזית, כאשר מודדים הישרדות חיידקים לאורך זמן בנוכחות אנטיביוטיקה, חושפת את נוכחותם של תאים עמידים לתרופות באופן חולף, עם חיסול מהיר ראשוני של התאים שאינם מתמידים, ואחריו קצב הרג איטי בהרבה של התאים המתמידים. עם הסרת אנטיביוטיקה, תאים אלה יוצרים אוכלוסייה זהה גנטית המציגה דינמיקת הרג דומה כאשר מטופלים באותה אנטיביוטיקה 1,2. בניגוד להתמדה, עמידות לאנטיביוטיקה מוגדרת ברמת האוכלוסייה והיא בדרך כלל תוצאה של מוטציות דה נובו או העברה גנטית אופקית של פלסמיד3 המעניק עמידות. בעוד שהמוטציות האחראיות לעמידות ממוקמות לרוב ביעד התרופה או באזורים הפרו-מוטוריים של משאבות השטף של התרופה, גנים המשנים את תדירות ההתמדה שזוהו על ידי גישות ניתוח מוטציות רחבות גנום וממוקדות הוכיחו את עצמם כרבים ומגוונים 2,3,4,5,6,7,8 . לכן, סביר להניח שתאי חיידקים יכולים להיכנס למצב המתמיד דרך מסלולים מרובים 9,10,11, ויש צורך בגישות לחקור את תופעת ההתמדה ברמת התא הבודד כדי לאפיין את הפיזיולוגיה של תאים מתמידים אלה.
הפיתוח האחרון של כלים מיקרופלואידים המשמשים בשילוב עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי סלל את הדרך לאפיון פנוטיפ ההתמדה והדגיש את תפקידם של תהליכים תאיים מרכזיים, כגון שכפול כרומוזומים12, תיקון DNA 13 וחלוקת תאים14, ביצירת תאים מתמידים. במאמר זה, אנו מתארים גישה משולבת המשלבת בדיקות מיקרוביולוגיה קלאסיות עם הדמיה חיה של תא בודד כדי לאפיין תאים מתמידים שנוצרו בתרביות Escherichia coli הגדלות באופן אקספוננציאלי וטופלו במינון גבוה של אופלוקסצין. הפרוטוקול המתואר כאן יכול להיות מיושם כדי לחקור את תופעת ההתמדה האנטיביוטית במינים חיידקיים אחרים, כגון Bacillus subtilis15, או מצבים (למשל, התמדה אנטיביוטית לאחר טיפול β-lactam 16) וניתן בקלות לשנות אותו כדי לחקור את התופעות הרבות הקשורות להטרוגניות פנוטיפית17,18,19 . יתר על כן, ניתן לשלב את המערך המתואר במאמר זה עם כתבים פלואורסצנטיים אחרים כדי לחקור פרמטרים תאיים שונים בעלי עניין, כגון רמות תוך-תאיות של pH20 או ATP21 ברמת התא הבודד, אשר עשויים להפיק תובנות חדשות על תופעת ההתמדה האנטיביוטית.

<table><tbody><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך</td>של <td>Axio Observer</td><td>Zeiss</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2.2H2O&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.02382.0250</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% גידול בינוני</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX Microfluidic System&nbsp;</td><td>Merck</td><td>CAX2-S0000&nbsp;</td><td>מערכת מיקרופלואידית</td></tr><tr><td>CellASIC ONIX2 FG</td><td>Merck</td><td>ONIX2 1.0.1&nbsp;</td><td>תוכנה מיקרופלואידית</td></tr><tr><td>סעפת CellASIC ONIX2 בסיסית&nbsp;</td><td>Merck</td><td>CAX2-MBC20</td><td>מערכת סעפת</td></tr><tr><td>CoCl2.6H2O</td><td>Merck</td><td>1.02539.0100</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול</td></tr><tr><td>CuSO4.5H2O</td><td>Merck</td><td>1.02790.0250</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול</td></tr><tr><td>D-(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>G7021-1KG</td><td>מקור פחמן לגלוקוז MOPS 0.4% מדיום גידול</td></tr><tr><td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+)</td><td></td><td>BE10</td><td>wt זן ייחוס, זן מעבדה</td></tr><tr><td>E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT</td><td></td><td>BE16</td><td>היתוך HU-mCherry משולב באמצעות התמרת P1 בלוקוס המקורי, זן מעבדה</td></tr><tr><td>FeSO4.7H2O&nbsp;</td><td>VWR Chemicals</td><td>24244.232</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול</td></tr><tr><td>פיג'י</td><td>ImageJ</td><td>https://fiji.sc/&nbsp;</td><td>תוכנת תמונה; שינדלין ואחרים אם נעשה בו שימוש בפרסום</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>Merck</td><td>56815</td><td>מקור פחמן ל-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול</td></tr><tr><td>גריינר CELLSTAR&reg; צלחת תרבית רב-באר</td><td>Merck</td><td>M8812-100EA</td><td>צלחת תרבית בנפח 24 מ"ל שטוחה 24 בארות לקורא צלחות אוטומטי</td></tr><tr><td>H3BO3&nbsp; </sub</td><td>>Sigma-Aldrich</td><td>B6768-1KG</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול</td></tr><tr><td>Hamamatsu ORCA פלאש 4.0 מצלמה דיגיטלית</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td>Digital Image Acqusition</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Merck</td><td>1.05099.1000</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Merck</td><td>1.05029.1000</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול</td></tr><tr><td>K2SO4&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.05153.0500</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול</td></tr><tr><td>מדיום אגר Luria-Broth</td><td>Invitrogen</td><td>22700041</td><td>מדיום גידול לבדיקת ציפוי</td></tr><tr><td>מדיום גידול Invitrogen</td><td>12780029</td><td>מדיום גידול לקביעת MIC</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2.6H2O&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.05832.1000</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% גידול בינוני</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck</td><td>7487-88-9</td><td>תמיסת דילול לבדיקת הישרדות חיידקים המשמשת ב-10mM</td></tr><tr><td>MicrobeJ&nbsp;</td><td>תוסף Imagej/Fiji</td><td>https://www.microbej.com/</td> <td>תוסף ניתוח תמונות מיקרוסקופיה. Ducret et al.for בפרסום; הגדרות זיהוי: עבור חיידקים: אזור (&mu; מ"ר): 0,1 מקסימום; אורך (&mu; מ'): 0,5 מקסימום; רוחב (&mu; m): 0,6 מקסימום; טווח (&mu; מ'): 0,5 מקסימום; זווית (rad): 0-0,3; 0-מקסימום עבור כל שאר הפרמטרים.&nbsp;</td></tr><tr><td>לוחות מיקרופלואידיים CellASIC ONIX</td><td>Merck</td><td>B04A-03-5PK&nbsp;</td><td>צלחת למערכת מיקרופלואידית</td></tr><tr><td>MnCl2.4H2O</td><td>Merck</td><td>1.05927.0100</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% גידול</td></tr><tr><td>בינוני MOPS, חומצה חופשית ULTROL&reg; דרגה</td><td>Merck</td><td>475898-500GM</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIgma-Aldrich</td><td>S5886-1KG</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול</td></tr> <tr><td>(NH4)6Mo7O24.4H2O</td><td>Merck</td><td>1.01180.0250</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול</td></tr><tr><td>NH4Cl&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.01145.0500</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול</td></tr><tr><td>אופלוקסצין</td><td>Merck</td><td>82419-36-1</td><td>אנטיביוטיקה פלואורוקווינולון המשמשת לטיפול בתאי החיידקים</td></tr><tr><td>פוספט חוצץ מלח (PBS) pH 7.4, 1x</td><td>Merck</td><td>P3813</td><td>מאגר דילול</td></tr><tr><td>GENESYS 10S ספקטרופוטומטר UV גלוי</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>&nbsp; 840-208200</td><td>ספקטרופוטומטר גלוי UV, מחזיק תא יחיד / שישה עם מדפסתמדידת צפיפות אופטית OD600nm</td></tr><tr><td>SoftMax Pro</td><td>מכשירים מולקולריים</td><td></td><td>תוכנת קורא מיקרופלייט</td></tr><tr><td>SpectraMax i3x</td><td>מכשירים</td><td></td> מולקולריים <td>קורא מיקרופלייט</td></tr><tr><td>N-[Tris(hydroxym&eacute; thyl)-m&eacute; thyl]-glycine</td><td>Merck</td><td>1.08602.0250</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% מדיום גידול</td></tr><tr><td>Zeiss&reg; שמן טבילה 518F</td><td>Zeiss</td><td></td><td>שמן טבילה להגברת הרזולוציה של המיקרוסקופ</td></tr><tr><td>Zen3.2 Pro</td><td>Zeiss</td><td></td><td>תוכנת רכישת ועיבוד תמונה מיקרוסקופית</td></tr><tr><td>ZnSO4.7H2O&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1.08883.0500</td><td>עבור MOPS גלוקוז 0.4% ו-MOPS גליצרול 0.4% גידול בינוני</td></tr></tbody></table>

ניתוח אוכלוסייה ותא בודד של התמדה אנטיביוטית ב- escherichia coli

Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli

התמדה אנטיביוטית מתייחסת ליכולת של תת-אוכלוסיות חיידקים קטנות לסבול באופן זמני מינונים גבוהים של אנטיביוטיקה קוטלת חיידקים. לאחר טיפול אנטיביוטי קוטל חיידקים, רוב אוכלוסיית החיידקים מומתת במהירות. השלב המהיר הראשון של ההרג מלווה בירידה משמעותית בקצב ההרג ככל שהתאים המתמידים נשארים בני קיימא. באופן קלאסי, התמדה נקבעת ברמת האוכלוסייה על ידי בדיקות זמן/הרג המבוצעות עם מינונים גבוהים של אנטיביוטיקה ועבור זמני חשיפה מוגדרים. בעוד ששיטה זו מספקת מידע על רמת התאים המתמידים ועל קינטיקה ההורגת, היא אינה משקפת את ההטרוגניות הפנימית בין תאים העומדת בבסיס תופעת ההתמדה. הפרוטוקול המתואר כאן משלב מבחני זמן/הרג קלאסיים עם אנליזה של תא בודד באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי בזמן אמת. על ידי שימוש בכתבים פלואורסצנטיים מתאימים, הדמיה מיקרוסקופית של תאים חיים יכולה לספק מידע לגבי השפעות האנטיביוטיקה על תהליכים תאיים, כגון שכפול כרומוזומים והפרדתם, התארכות תאים וחלוקת תאים. שילוב של אוכלוסייה ואנליזה של תא בודד מאפשר אפיון מולקולרי ותאי של פנוטיפ ההתמדה.

התמדה אנטיביוטית מתארת את היכולת של תת-אוכלוסיות קטנות בתוך אוכלוסייה איזוגנית רגישה לסבול באופן זמני מינונים גבוהים של אנטיביוטיקה קוטלת חיידקים. הפרוטוקול הנוכחי משלב גישות לאפיון פנוטיפ ההתמדה האנטיביוטית ברמה המולקולרית והתאית לאחר חשיפת Escherichia coli למינונים קטלניים של אופלוקסצין.

ניתוח אוכלוסייה ותא בודד של התמדה אנטיביוטית ב- Escherichia coli

Antibiotic persistence refers to the capacity of small bacterial subpopulations to transiently tolerate high doses of bactericidal antibiotics. Upon ...

הפרוטוקול המתואר כאן מספק שיטה אינטגרטיבית המשלבת בדיקות מיקרוביולוגיה קלאסיות עם הדמיה חיה של תא בודד כדי לאפיין תאים מתמידים של Escherichia coli לאחר טיפול גבוה באופלוקסצין. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא לנתח את תופעת ההתמדה ברמת האוכלוסייה והתא הבודד. שילוב של אוכלוסייה ואנליזה של תא בודד מאפשר אפיון מולקולרי ותאי של פנוטיפ ההתמדה.כדי להתחיל, פזרו את זן החיידקים המעניין ממלאי גליצרול קפוא על צלחת אגר LB, ודגרו בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה לתקופה של 15 עד 19 שעות כדי להשיג מושבות בודדות. יש לחסן מושבה מבודדת בצינור זכוכית המכיל חמישה מיליליטר של מדיום גידול MOPS בתוספת 0.4% גלוקוז, ובמידת הצורך להוסיף אנטיביוטיקה סלקטיבית למדיום. הניחו את הצינור באינקובטור רועד בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-180 סל"ד למשך הלילה.למחרת, צנטריפוגה מיליליטר אחד של תרבית ב 2, 300 גרם במשך שלוש דקות כדי pellet את התאים, בעדינות resuspend את הגלולה עם אותו נפח של PBS. מדוד את ה-OD ב-600 ננומטר, וחשב את הנפח הדרוש ל-OD600 התחלתי של 0.01 בנפח סופי של שני מיליליטר. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של MOPS גליצרול 0.4% בינוני לתוך באר של צלחת שקופה, 24 בארות, וחסן עם נפח תרבית לילה מחושב.הכנס את הצלחת בעלת 24 הקידוחים לקורא מיקרו-צלחות אוטומטי כדי לפקח על OD600 למשך 24 שעות. הגדר את קורא המיקרו-לוחות למדוד את OD600 כל 15 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ועם סיבוב מסלול גבוה של 140 סל"ד. ממיסים 100 מיליליטר של אגר LB, וממלאים את הבקבוק ב 55 מעלות צלזיוס כדי למנוע התמצקות.הכינו שש צלוחיות זכוכית קטנות, ופיפטה חמישה מיליליטר של מדיום אגר LB נוזלי לכל בקבוק באמצעות פיפטה סטרילית. קח 10 מיקרוליטר של חמישה מיליגרם למיליליטר של תמיסת מלאי ofloxacin, ודלל 90 מיקרוליטר של מים טהורים במיוחד. הוסף נפחים הולכים וגדלים של ofloxacin מדולל לכל אחת משש צלוחיות זכוכית המכילות LB אגר בינוני כדי לקבל ריכוז סופי של אפס עד 0.1 מיקרוגרם למיליליטר של ofloxacin.מערבבים את התמיסה על ידי סיבוב הצלוחיות מספר פעמים, ויוצקים את מצע האגר LB שהוסיף אנטיביוטיקה לצלחת תרבית בת שש בארות. מניחים לאגר להתקרר עד להתמצקות, ומייבשים את הצלחת לפני השימוש. לדלל תרבית חיידקים בן לילה לצפיפות תאים סופית של פי 10 עד 7 CFU למיליליטר עם PBS.הבחינו בשני מיקרוליטרים של תרבית מדוללת על כל באר של צלחת שש בארות מיובשת. תנו לכתמים להתייבש לפני שתכניסו את הצלחת לאינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות למשך הלילה. למחרת, לבדוק באיזה ריכוז ofloxacin הצמיחה של מושבות חיידקים מעוכב.יוצקים כ-25 מיליליטר של אגר LB מוכן לתוך צלחת פטרי. לאחר מכן הוסיפו חמישה עד שמונה חרוזי זכוכית סטריליים לכל צלחת מוצקה ומיובשת. הפוך ותייג את הצלחות.לאחר מכן, הכינו צינורות זכוכית דילול סדרתי פי עשרה המכילים 900 מיקרוליטר של תמיסת מגנזיום סולפט 0.01 טוחנת. בצינור זכוכית, מדללים תרבית לילה בתווך טרי ומותאם טמפרטורה ל-OD600 סופי של כ-0.001, ומאפשרים לתרבית לגדול בן לילה באינקובטור. למחרת, כאשר OD600 מגיע 0.3, להעביר 100 מיקרוליטר של התרבות לדילול על פי נתוני הבדיקה נקודתית.לבצע דילול סדרתי פי עשרה של תרבית החיידקים. ואז צלחת 100 מיקרוליטר של התרבות מדולל על לוחות אגר LB מוכן. מוסיפים את הריכוז הרצוי של אופלוקסצין לתרבית החיידקים, וממשיכים לדגור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידה.בנקודות הזמן הרלוונטיות, משכו 100 מיקרוליטר של התרבית, ודללו את התרבית בהתאם לנתוני הבדיקה הנקודתית. צלחת 100 מיקרוליטר של התרבות המדוללת על צלחות אגר LB. למחרת, ספרו את מושבות הלוחות המודגרים בלילה בשני הדילולים הגבוהים ביותר שעבורם ניתן לזהות מושבות.חשב את יחס ההישרדות על ידי נרמול CFU למיליליטר בכל נקודת זמן ב- CFU למיליליטר ב- T0, והתווה את בסיס היומן 10 ערך מנורמל כפונקציה של זמן. הסר את תמיסת השימור מכל באר של הצלחת המיקרופלואידית, והחלף אותה במדיום תרבית טרי. אטמו את הצלחת המיקרופלואידית עם מערכת הסעפת על ידי לחיצה על כפתור האטימה או באמצעות התוכנה המיקרופלואידית.לאחר מכן, בממשק התוכנה microfluidic, בצע רצף ראשוני ראשון על ידי לחיצה על Run Liquid Priming Sequence. יש לדגור על הצלחת בארון מבוקר תרמוסטטית של המיקרוסקופ בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך שעתיים לפחות לפני תחילת ההדמיה במיקרוסקופיה. לאחר מכן התחל רצף הפעלה נוזלי שני לפני תחילת הניסוי.אטם את הצלחת המיקרופלואידית על ידי לחיצה על Unseal Plate בממשק התוכנה המיקרופלואידית. החליפו את התווך בבארות ב-200 מיקרוליטר מדיום טרי, אנטיביוטיקה המכילה מדיום טרי, ודגימת תרבית מדוללת 0.01 OD בתווך הטרי. לאחר איטום הצלחת המיקרופלואידית כפי שהודגם קודם, הניחו את הצלחת על מטרת המיקרוסקופ בתוך ארון המיקרוסקופ.בתוכנה microfluidic, לחץ על Run Cell Loading Sequence כדי לאפשר טעינה של התאים לתוך הצלחת microfluidic. הגדר מיקוד אופטימלי באמצעות מצב האור המשודר, ובחר מספר אזורי עניין שבהם ניתן לצפות במספר תאים מתאים של עד 300 תאים לכל שדה. בתוכנה המיקרופלואידית, ערוך את Run a Custom Sequence כדי לתכנת את הזרקת התווך הטרי ב-6.9 קילופסקל למשך שש שעות לבארות אחת ושתיים, לאחר מכן התווך המכיל אנטיביוטיקה ב-6.9 קילופסקל או שש שעות לבאר שלוש, ולבסוף התווך הטרי ב-6.9 קילופסקל למשך 24 שעות לבארות ארבע וחמש.בצע הדמיה מיקרוסקופית במצב קיטועי זמן עם פריים אחד כל 15 דקות באמצעות האור המשודר ומקור אור העירור עבור כתב הפלואורסצנט, והתחל את התוכנית המיקרופלואידית. פתח את תוכנת ImageJ או Fiji במחשב וגרור את התמונות במיקרוסקופ עם קיטועי זמן של hyperstack לסרגל הטעינה של פיג'י. השתמשו ב'תמונה', ולאחר מכן 'צבע', ולאחר מכן 'צור ללא הפרדות צבע' כדי להתיך את הערוצים השונים של ערימת ההיפר-ערימה.השתמשו ב'תמונה', 'צבע' ולאחר מכן 'סדרו ערוצים' אם הערוצים אינם תואמים לצבע הרצוי. פתחו את תוסף MicrobeJ וזהו את תאי החיידקים באמצעות ממשק העריכה הידני. מחק את התאים שזוהו באופן אוטומטי ושרטט באופן ידני את התאים המתמידים בעלי תחומי העניין מסגרת אחר מסגרת.לאחר הזיהוי, השתמש בסמל התוצאה בממשק העריכה הידני של MicrobeJ כדי ליצור טבלת ResultJ. השתמש בטבלת ResultJ כדי לקבל תובנות לגבי פרמטרים שונים המעניינים את ניתוח התא הבודד ושמור את קובץ ResultJ. ה-MIC של אופלוקסצין עבור שני הזנים נקבע כ-0.06 מיקרוגרם למיליליטר, מה שמצביע על כך שהיתוך hupA-mCherry לא השפיע על הרגישות של אופלוקסצין בהשוואה לזן איזוגני מסוג בר.הבדיקה הספוטית הראתה שיבוטים מבודדים בדילול מתאים לאורך זמן, לדוגמה, 10 לדילול החמישי השלילי בזמן אפס. במבחן ההרג בזמן נצפתה עקומה ביפאזית טיפוסית שבה המדרון הראשון משקף את ההרג המהיר של האוכלוסייה הלא מתמידה. השלב השני הראה קצב הרג איטי יותר, וחשף את נוכחותם של תאים מתמידים עמידים לתרופות.יש לציין שעקומת הזמן-הרג מראה כי חלבון ההיתוך hupA-mCherry לא השפיע על קינטיקה של הרג זמן. בניסוי המיקרופלואיד, שלב הגידול הראשון מצביע על כך שהתאים היו בני קיימא והתחלקו לפני הטיפול באופלוקסצין. לאחר שלב גדילה ראשון זה, חלוקת התאים נחסמה ברגע שהאנטיביוטיקה הגיעה לתאים.לאחר טיפול באופלוקסצין, על זילוח עם מדיום טרי, הרוב המכריע של התאים לא הצליחו לחדש את הצמיחה. לעומת זאת, תת-אוכלוסייה קטנה יכולה להתארך ולייצר תאים נימיים, המוגדרים כתאים המתמידים. חוט הלהט המתמיד המתחלק יצר תאי בת מרובים, שרובם החלו לגדול ולהתחלק בדומה לתאים לא מטופלים.העלייה באורך התא הייתה בקורלציה עם עלייה בעוצמה הפלואורסצנטית הכוללת של mCherry, המשקפת הפעלה מחדש של השכפול ועלייה בשפע הנוקלאואידים. כאשר משתמשים בזן המכיל כתב תוך-תאי לחקר התמדה, חשוב שנוכחותו של המדווח לא תפריע לצמיחה, מיקרופון והרג בהשוואה לזן פראי. ההליך המתואר כאן יכול להיות מיושם על תנאים אחרים ומיני חיידקים כדי לנטר תגובות תאיות לסביבות משתנות או לעקה.על ידי שימוש בכתבים פלואורסצנטיים אחרים במערך זהה, ניתן לחקור תובנות חדשות על הפיזיולוגיה של תאים מתמידים.

population-single-cell-analysis-antibiotic-persistence-escherichia

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

מקור: Oms, T., et al. ניתוח אוכלוסייה ותאים בודדים של התמדה אנטיביוטית ב- Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2023)סרטון זה מציג פרוטוקול לניטור תאי חיידקים בודדים המבטאים חלבון קושר DNA בעל תווית פלואורסצנטית בתוך מערכת מיקרופלואידית. הוא ממחיש כיצד אנטיביוטיקה מעכבת את רוב התאים, בעוד שתת-אוכלוסייה של תאים מתמידים שורדת את הטיפול וגדלה מחדש לאחר הסרת האנטיביוטיקה.

מיקרוסקופ זמן-lapse מיקרופלואידית לחקר התמדה אנטיביוטית בחיידקים

Source: Escudero, J. A., et.al. Testing the Role of Multicopy Plasmids in the Evolution of Antibiotic Resistance. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates how escalating cefazidime exposure is used to compare the survival of three E. coli strains with different copies of the ampicillin resistance gene. It shows that only the strain with a multicopy plasmid survives at higher drug levels, highlighting how increased gene copy number accelerates resistance evolution.

Assessing the Role of Gene Copy Number in the Evolution of Bacterial Antibiotic Resistance 

Source: Zhang, C., et al., Development and Assessment of Intracellular Infection Models for Staphylococcus aureus. J. Vis. Exp. (2025)The video demonstrates the isolation of kidneys containing Staphylococcus aureus-infected macrophages, followed by tissue homogenization to release intracellular bacteria. It quantifies bacterial persistence within macrophages in control and antibiotic-treated groups by counting colony-forming units.

Assessing Intracellular Bacterial Persistence and Antibiotic Resistance in a Mouse Model

ScanLag היא שיטה בעלת תפוקה גבוהה למדידת העיכוב בצמיחה, כלומר זמן השהיה, כמו גם קצב הצמיחה של מושבות עבור אלפי תאים במקביל. סינון באמצעות ScanLag מאפשר הבחנה בין זמן פיגור ארוך לצמיחה איטית ברמה של וריאנט בודד.

ScanLag: כימות תפוקה גבוהה של המושבה צמיחה ול&quot;ג בזמן

כאן נציג של השיטה הניסיונית כדי לבחון את התפקיד של פלסמידים multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה.

בוחן את התפקיד של פלסמידים Multicopy באבולוציה של עמידות לאנטיביוטיקה

פרוטוקול זה מאפשר תיאור בזמן הפתרון של גידול חיידקי בתנאי לחץ בתא בודד ואת רמות האוכלוסייה התא.

רב היקף ניתוח של צמיחה חיידקים תחת טיפולי סטרס

בנייר שיטה זה, אנו מציגים אסטרטגיית סינון בתפוקה גבוהה לזיהוי תרכובות כימיות, כגון אוסמוליטים, שיש להן השפעה משמעותית על התמדה חיידקית.

הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות כימיות כדי להבהיר את השפעתם על התמדה חיידקית

במאמר זה אנו מציגים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה ממים ולאפיון המולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם (ARGs). השימוש בטכניקות מבוססות תרבית ולא מבוססות תרבית (ניתוח מטגנומי) מספק מידע מלא על מגוון החיידקים הכולל ועל המאגר הכולל של ARGs שונים הנמצאים במים מתוקים ממומבאי, הודו.

בידוד וזיהוי חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה במים ואפיון מולקולרי של גני העמידות לאנטיביוטיקה שלהם

בכתב יד זה, אנו מספקים פרוטוקול מקיף להערכת הישרדות אנטיביוטיקה עבור Pseudomonas aeruginosa ו - Staphylococcus aureus, הפיכת פלסמידים ל - P. aeruginosa ו- S. aureus כדי ליצור זני כתב ולדמיין וריאנטים פנוטיפיים, כגון מתמידים, על ידי מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהילוך מהיר.

הדמיית מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי בהילוך מהיר של Pseudomonas aeruginosa ו - Staphylococcus aureus פנוטיפים הטרוגניים

עמידות לאנטיביוטיקה בקרב זני Escherichia coli פולשניים דבקים מהווה אתגרים בהערכת פלישה חיידקית באמצעות בדיקת הגנה מסורתית של ג'נטמיצין. מתוארת שיטה משופרת להערכת פלישת חיידקים באופן כמותי על ידי מניית יחידות יוצרות מושבות ובאופן איכותי באמצעות הדמיה של תאים נגועים באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי אימונופלואורסצנציה.

בדיקת הגנה על אמיקצין לכימות והדמיה של פלישת תאי אשריכיה קולי

חקור התמדה אנטיביוטית ב-Escherichia coli באמצעות שילוב של מבחני מיקרוביולוגיה קלאסיים עם הדמיית תאים בודדים. השיטה מאפשרת אפיון מולקולרי ותאי של תופעת ההתמדה ברמות האוכלוסייה והתא הבודד.

ניתוח אוכלוסייה ותא בודד של התמדה אנטיביוטית ב- Escherichia coli

גלה סרטונים נוספים