Name: קרציות האכלת קרום מלאכותי עבור Ixodes scapularis (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: למד שיטה פשוטה להאכלה מלאכותית של קרציות Ixodes scapularis באמצעות מערכת קרום סיליקון. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות קרציה-פתוגן ללא שימוש בבעלי חיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. הכנת תא קרום הקרציות
<ol><li>הכינו משטח שטוח ולא נקבובי כמו בסיס זכוכית או מתכת מצופה קרמיקה של מעמד זרוע על-ידי ניגובו באתנול 70% ולאחר מכן כסו אותו בשכבה אחת של ניילון נצמד, וודאו שהניילון הנצמד שטוח וללא בועות או קמטים (ראו איור 1A).</li>
	<li>הדביקו נייר ניקוי עדשה 100% קרני אור למשטח המוכן. ודא שהוא שטוח ומתוח מעט באמצעות סרט דבק לכל ארבעת צידי הנייר. ניתן להפוך שתי חתיכות של 4 אינץ 'x 6 בנייר עדשה לממברנות באמצעות הנפחים המתוארים בשלב 1.3. הערה: זה מספיק כדי ליצור עד 12 תאי האכלה (ראה איור 1B). אם הממברנה מיועדת לקרציות זחל, השתמשו בנייר unryu במקום בנייר ניקוי עדשות.</li>
	<li>הכינו את תערובת הסיליקון בדרגת קשיות 00-10 על ידי מדידת 5 מ"ל מכל חלק של ערכת הסיליקון לתוך מיכל חד פעמי, ערבוב קל של שני הנוזלים לפני הוספת 1.5 מ"ל הקסאן. ממשיכים לערבב עד שהתערובת הומוגנית ומעורבבת היטב. הערה: אם אתם מכינים ממברנות לקרציות בוגרות, השתמשו בסיליקון בדרגת קשיות 00-50.</li>
	<li>השתמשו בסחיטה קטנה כדי לפזר את תערובת הסיליקון על נייר העדשה. השאירו מעמד למשך דקה אחת כדי לוודא שהסיליקון נספג בנייר העדשה. מגרדים בהתמדה את עודפי הסיליקון הצידה עם הסחיטה תוך שימוש בכמות קטנה של לחץ כלפי מטה. בצע מעבר שני עם הסחיטה, ללא הפעלת לחץ כלפי מטה, כדי להסיר קווי סיליקון ולייצר שכבה חלקה. הערה: שלב זה של ההליך עשוי לדרוש תרגול מסוים כדי לייצר ממברנות בעובי אופטימלי לכל שלב בחיים (מבוגרים: 150-200 מיקרומטר; נימפות: 90-120 מיקרומטר; זחלים: 80-100 מיקרומטר). קרום עבה יותר (בתוך סובלנות ההזנה של שלב החיים) בדרך כלל יניב תוצאות טובות יותר על ידי הפחתת העיבוי בחדר ושיפור מאפיין הריפוי העצמי של הממברנה.</li>
	<li>עבור זחלים בלבד, טבלו את החלק העליון של תא ההזנה בשרף פלואורופולימר פלואון (PTFE-30) מספר פעמים, ואפשרו לו להתייבש בין יישומים כדי ליצור שכבה עקבית. הערה: היישום של Fluon ייצור שכבה נון-סטיק של שרף פלואורופולימר בדומה למחבת בישול נון סטיק. זה יפחית את מספר הזחלים שמטפסים לראש החדר21.</li>
	<li>השאירו את הממברנה לריפוי למשך 24 שעות לפחות בסביבה נטולת אבק, כגון ארון כימיקלים או בטיחות ביולוגית סגור, לפני שתעברו לשלב הבא. ראו איור 1C כיצד נייר עדשת קרני השמש נראה לאחר שהסיליקון הורשה להתייבש.</li>
	<li>הכינו את תערובת הסיליקון בעלת 30 הקשיות לחיבור התאים לממברנה על ידי ערבוב חלקים שווים של תערובת סיליקון A ו-B.</li>
	<li>טבלו את תאי הפוליקרבונט כ-6 מ"מ לתוך תערובת הסיליקון, ולאחר מכן הניחו על יריעת הממברנה, תוך הקפדה שלא לחפוף אף סרט (איור 1D).</li>
	<li>אפשרו לסיליקון המתחבר להחלים למשך 24 שעות לפחות לפני שתעברו לשלבים הבאים.</li>
	<li>בעזרת אזמל, חתכו בזהירות את הממברנה סביב כל אחד מהתאים המחוברים, חתכו את הקצוות כך שהיא תוכל להיכנס בצורה חלקה לבאר של צלחת 6 בארות ללא גירוד רב בצדדים (איור 1E). יש לאפשר הידבקות מספקת של חומר מחוץ לתא כדי למקסם את ההדבקה של הממברנה. הערה: אם נשאר יותר מדי חומר חיצוני, הסרה חוזרת ונשנית של החדר מהצלחת בעלת 6 הבארות עלולה לגרום לקרום להתנתק חלקית מהחדר. תיקון קרומים מנותקים מתואר בסעיף 5.</li>
	<li>חותכים חתיכה קטנה משאריות הקרום מכל אחת מהפינות וממרכז יריעת הממברנה. הסירו את הניילון הנצמד מכל חתיכה. למדוד את חתיכות עם מיקרומטר כדי לקבוע את עובי הממברנה הממוצע. הערה: אם עובי הממברנה אינו נופל בטווח הסיבולת לשלב החיים (ראה שלב 1.4), יש להשליך את הממברנות וליצור אותן מחדש. עובי נייר Unryu משתנה מאוד בשל גדילי סיבים עבים ואזורים דקים. בעוד מאפיין זה מאפשר לזחלים למצוא אזורים בעובי אופטימלי, הוא מקשה לקבוע את עובי הממברנה בפועל.</li>
	<li>הניחו את תאי ההאכלה יחד עם טבעת O אחת בכל תא לתוך זכוכית כדי להיות autoclaved ב 121 ° C במשך לפחות 20 דקות כדי לעקר. הניחו לתאים להתקרר לפני השימוש בהם.</li>
</ol>2. הגדרת הזנת הקרציות
<ol><li>הכינו מנורה או חדר כך שהאורות יהיו דולקים למשך 16 שעות ולאחר מכן יכבו למשך 8 שעות. אם אתה משתמש במנורה, ודא כי אמבט המים בשלב הבא הוא בחושך עבור אלה 8 שעות.</li>
	<li>הגדירו אמבט מים בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס ועם תומכים, כך שצלחת בת 6 בארות תוכל לשבת ולצוף מעט בתוכה. השתמשו בכוסות זכוכית קטנות השקועות באמבט המים כתומכות. השתמש כיסוי שקוף עבור אמבט המים כדי לשמור על מחזור בהיר-כהה עבור הקרציות; במידת הצורך, השתמש במעמד T ובניילון נצמד כדי ליצור כיסוי. כדי להפחית את הסיכון לזיהום, להוסיף 0.02% בנזלקוניום כלוריד לאמבט המים ולהגדיר אמבט מים נוסף ל 36 מעלות צלזיוס לחימום דם צונן.</li>
	<li>הוציאו את תאי הממברנה האוטוקלאביים המוכנים, הניחו את טבעת ה-O מסביב לתא (איור 1F), ואז מלאו כל תא במספיק אתנול של 70% כדי לכסות את הממברנה. מניחים לצלחת 6 בארות היטב במשך 5 דקות ולאחר מכן לחפש דליפות בין החדר לממברנה ובממברנה עצמה. הערה: אם הממברנה דולפת, אתנול יצטבר בבסיס הבאר. יש להשליך קרומים דולפים.</li>
	<li>רוקנו את האתנול מהתאים ואז תנו לו להתייבש באוויר בתוך ארון בטיחות ביולוגית או מכסה מנוע זרימה למינרית. הערה: פעולה זו עשויה להימשך מספר דקות, בהתאם ללחות הסביבה.</li>
	<li>בזמן ההמתנה, השבת בחום את המשלים בדם על ידי חימום ב 56 ° C למשך 40 דקות. יש ליטול תוסף מכני לדם בקר עם 2 גרם/ליטר גלוקוז.</li>
	<li>לאחר שהקרום יבש, יש למרוח ~20 μL של phagostimulant על החלק הפנימי של החדר ולאחר מכן להפיץ אותו על פני השטח על ידי הטיית החדר. ראה סעיף 6 להוראות לגבי הכנת פגוסטיל מריץ קרציות.</li>
	<li>המתינו עד שהפאגוסטימולנט יתייבש לפני שתוסיפו את הקרציות לתא בעזרת מברשת או מלקחיים. עבוד מהר ככל האפשר בעת העברת הקרציות לחדר כדי למנוע בריחה. הניחו את הקרציות בצינור על קרח למשך 1-2 דקות לפני העברתן כדי להאט את יכולתן לברוח. לאחר העברת הקרציות, לאטום את החלק העליון עם parafilm; אין למתוח יתר על המידה את הפרפילם, מכיוון שהחום מאמבט המים עלול לגרום לו להיקרע. הערה: מלקחיים עובדים בצורה הטובה ביותר עם שלבי חיים נימפתיים ובוגרים ומברשות פועלות בצורה הטובה ביותר עם שלבי חיי הזחל.</li>
	<li>הוסף 5 מ"ל של דם מומת בחום לכל באר / חדר לתוך צינור חרוטי ומניחים באמבט המים להגדיר על 36 ° C. הביאו דם צונן לפחות לטמפרטורת החדר לפני שאתם חושפים אליו את הקרציות. הניחו בצד ארבעה תאים לכל צלחת בת 6 בארות לטיפול קל בתאים. יש להימנע מיותר תאים לכל צלחת, עם זאת, בהתאם לגודל אמבט המים, ניתן להשתמש בצלחות נוספות.</li>
	<li>הוסף 5 μL של 3 mM ATP ו 50 μL של מלאי 100x של פניצילין/סטרפטומיצין/פטריות לכל 5 מ"ל דם לצינור.</li>
	<li>מעבירים 4.5 מ"ל של הדם לבאר של צלחת 6 בארות, ולאחר מכן מניחים בעדינות את החדר לתוך הבאר, התאמת גובה טבעת O על התא כך שהקרום יושב בדם אך רמת הדם סביב הצד אינה עולה על הבאר. הניחו את הבאר לתוך הדם בזווית כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בין הדם לממברנה. הערה: לוח שלם מוצג באיור 2.</li>
	<li>מניחים את המכסה של צלחת 6 באר על גבי תאי האכלה; לאחר מכן, לשים את צלחת 6 באר עם תאים לתוך מוכן 34 ° C מים אמבטיה ולסגור את המכסה. הערה: המכסה למעלה יעזור למנוע ממים מרוכזים ליצור קשר עם הפרפילם ולדלל את הדם בבארות.</li>
</ol>3. שמירה על קרציות האכלה על ידי שינוי הדם כל 12 שעות
<ol><li>Aliquot 5 מ"ל של דם מומת בחום לכל באר לתוך צינור לחמם אותו באמבט מים 36 מעלות צלזיוס. הפשירו את ה-ATP והפניצילין/סטרפטומיצין/פטריות באמבט המים בו זמנית.</li>
	<li>הוסף 5 μL של 3 mM ATP ו 50 μL של מלאי 100x של פניצילין/סטרפטומיצין/פטריות לכל באר לצינור הדם. מעבירים 4.5 מ"ל דם לבאר של צלחת טרייה בת 6 בארות.</li>
	<li>הוציאו את צלחת 6 הבארות עם תא הקרציות מאמבט המים. הסר את החדר מן הבאר ולשטוף את החלק החיצוני של החדר ואת הממברנה עם 10 מ"ל של סטרילי 1x PBS כדי להסיר את הדם.</li>
	<li>בעזרת נייר סינון אוטומטי, יבשו בעדינות את הממברנה ואת התא כדי להסיר את עודפי PBS. החלף את הפרפילם בחלק העליון של החדר. אם יש הרבה עיבוי בתוך התא, לטפוח יבש את הכתמים הרטובים עם נייר מסנן autoclaved לפני איטום עם parafilm טרי.</li>
	<li>הכניסו את תא השנתות לצלחת החדשה בעלת 6 הקידוחים עם דם טרי, והתאימו את גובה טבעת ה-O במידת הצורך. חזור על שלבים 3.3-3.5 עבור כל תא בצלחת. מניחים את המכסה של צלחת 6 בארות מעל החלק העליון של החדרים. העבר את צלחת 6 הבארות החדשה בחזרה לאמבט המים בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.1-3.5 כל 12 שעות עד לסיום הזנת הקרציות. המתינו עד שהקרציות יתנתקו מעצמן כאשר הן חרוטות או הוציאו אותן בעדינות מהקרום עם פינצטה רכה למגע בעודן מחוברות לקבלת קרציות חרוטות חלקית.</li>
</ol>4. טיפול אנטי פטרייתי
הערה: בצע רק כאשר צמיחה פטרייתית נראית על הממברנה. פטרייה עשויה להיווצר בצד הדם של הממברנה אם האכלה היא של משך מספיק. האינדיקציה הראשונה לזיהום פטרייתי היא פתיתים קטנים (1-3 מ"מ) של דם קרוש הנראה על הממברנה. כאשר מציינים זיהום פטרייתי, טיפולים אנטי פטרייתיים יכולים להאריך את משך הניסוי ולשפר את הצלחת הגודש.
<ol><li>יש להמיס 10,000 U nystatin למ"ל במים מזוקקים, 5 מ"ל לכל תא האכלה. יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן מזרקים בגודל 0.1 מיקרומטר.</li>
	<li>הוסף 5 מ"ל של תמיסת ניסטטין לכל באר של צלחת חדשה בת 6 בארות, באר אחת לכל תא האכלה.</li>
	<li>הכניסו את התאים שטופי PBS לתמיסה. מניחים ל-10 דקות.</li>
	<li>יש לשטוף את הקרומים המטופלים עם PBS לפני החזרתם לדם טרי.</li>
	<li>חזור על הטיפול האנטי פטרייתי כל 2-3 ימים (בהתאם למידת הזיהום הפטרייתי) עד להשלמת הניסוי.</li>
</ol>5. הדבקה מחדש של קרומים מנותקים עם דבק ציאנואקרילט
הערה: יש לבצע רק כאשר מבחינים בניתוק הממברנה.
<ol><li>הממברנות עשויות להתנתק חלקית מתאי ההזנה, במיוחד במהלך ההסרה מהצלחת בעלת 6 הקידוחים. אם זה קורה, לשטוף את קרום הדם עם PBS.</li>
	<li>יבשו בעדינות את האזור הפגוע. זה לא צריך להיות יבש לחלוטין, אבל נוכחות של לחות גורם דבק להגדיר מהר יותר. הערה: הדבקה מחדש של הממברנה מגבילה את זמן העבודה, עם זאת, בהתאם לגודל הניתוק, זמן הגדרה מהיר יותר עשוי להיות רצוי.</li>
	<li>סחטו כמות קטנה של דבק ציאנואקרילט לתוך הרווח שבו הממברנה התרחקה מהחדר. החזק במקום למשך ~2 דקות כדי לאפשר לדבק להתייצב.</li>
	<li>מניחים את החדר בחזרה לתוך הדם בצלחת 6 בארות.</li>
</ol>6. ביצוע phagostimulant
הערה: בצע בסוף הזנה או לפני תחילת הזנת ממברנה.
<ol><li>אספו צואת קרציות ממזון קרום קודם או ממקור אחר להאכלת קרציות. אחסנו את הצואה בטמפרטורה של -20°C לפני הכנת הפאגוסטימולנט. מרסקים את כדורי צואת הקרציות ומערבבים 0.1 גרם לכל 1 מ"ל מים. מוסיפים 1 mM טריפפטיד מופחת גלוטתיון, ממיסים ומערבבים היטב על ידי ערבול.</li>
	<li>יש לעקר את המסנן באמצעות מסנן מזרקים בגודל 0.1 מיקרומטר.</li>
	<li>מקפיאים ב-20°C עד לצורך.</li>
</ol>

<ol><li>Rosenberg, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vital+signs%3A+trends+in+reported+vectorborne+disease+cases+-+United+States+and+territories%2C+2004-2016%5BTitle%5D)+AND+%22Morbidity+and+Mortality+Weekly+Report%22%5BJournal%5D)">Vital signs: trends in reported vectorborne disease cases - United States and territories, 2004-2016.</a> Morbidity and Mortality Weekly Report. 67 (17), 496-501 (2018).</li>
<li>Busch, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+movement+of+invasive+cattle+fever+ticks+%28Rhipicephalus+microplus%29+in+southern+Texas+leads+to+shared+local+infestations+on+cattle+and+deer%5BTitle%5D)+AND+%22Parasites+%26+Vectors%22%5BJournal%5D)">Widespread movement of invasive cattle fever ticks (Rhipicephalus microplus) in southern Texas leads to shared local infestations on cattle and deer.</a> Parasites & Vectors. 7, 188(2014).</li>
<li>Süss, J., Klaus, C., Gerstengarbe, F. W., Werner, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((What+makes+ticks+tick%3F+Climate+change%2C+ticks%2C+and+tick-borne+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Travel+Medicine%22%5BJournal%5D)">What makes ticks tick? Climate change, ticks, and tick-borne diseases.</a> Journal of Travel Medicine. 15 (1), 39-45 (2008).</li>
<li>Gray, J. S., Dautel, H., Estrada-Peña, A., Kahl, O., Lindgren, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+climate+change+on+ticks+and+tick-borne+diseases+in+Europe%5BTitle%5D)+AND+%22Interdisciplinary+Perspectives+on+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Effects of climate change on ticks and tick-borne diseases in Europe.</a> Interdisciplinary Perspectives on Infectious Diseases. 2009, 593232(2009).</li>
<li>Sonenshine, D. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSonenshine%2C+DE+%22Biology+of+Ticks%22">Biology of Ticks</a>. , Oxford University Press. New York. (1991).</li>
<li>Schwan, T. G., Piesman, J., Golde, W. T., Dolan, M. C., Rosa, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+an+outer+surface+protein+on+Borrelia+burgdorferi+during+tick+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Induction of an outer surface protein on Borrelia burgdorferi during tick feeding.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 92 (7), 2909-2913 (1995).</li>
<li>Massung, R. F., Priestley, R. A., Miller, N. J., Mather, T. N., Levin, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inability+of+a+variant+strain+of+Anaplasma+phagocytophilum+to+infect+mice%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Infectious+Diseases%22%5BJournal%5D)">Inability of a variant strain of Anaplasma phagocytophilum to infect mice.</a> The Journal of Infectious Diseases. 188 (11), 1757-1763 (2003).</li>
<li>Koci, J., Bernard, Q., Yang, X., Pal, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Borrelia+burgdorferi+surface+protein+Lmp1+facilitates+pathogen+dissemination+through+ticks+as+studied+by+an+artificial+membrane+feeding+system%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Borrelia burgdorferi surface protein Lmp1 facilitates pathogen dissemination through ticks as studied by an artificial membrane feeding system.</a> Scientific Reports. 8 (1), 1910(2018).</li>
<li>Levin, M. L., Schumacher, L. B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Manual+for+maintenance+of+multi-host+ixodid+ticks+in+the+laboratory%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+and+Applied+Acarology%22%5BJournal%5D)">Manual for maintenance of multi-host ixodid ticks in the laboratory.</a> Experimental and Applied Acarology. 70 (3), 343-367 (2016).</li>
<li>Hart, T., Yang, X., Pal, U., Lin, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Lyme+borreliae+proteins+promoting+vertebrate+host+blood-specific+spirochete+survival+in+Ixodes+scapularis+nymphs+using+artificial+feeding+chambers%5BTitle%5D)+AND+%22Ticks+and+Tick-Borne+Diseases%22%5BJournal%5D)">Identification of Lyme borreliae proteins promoting vertebrate host blood-specific spirochete survival in Ixodes scapularis nymphs using artificial feeding chambers.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 9 (5), 1057-1063 (2018).</li>
<li>Hart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Host+tropism+determination+by+convergent+evolution+of+immunological+evasion+in+the+Lyme+disease+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathogens%22%5BJournal%5D)">Host tropism determination by convergent evolution of immunological evasion in the Lyme disease system.</a> PLoS Pathogens. 17 (7), (2021).</li>
<li>Bernard, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+early+immune+evasion+strategies+of+a+bacterial+pathogen%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Plasticity in early immune evasion strategies of a bacterial pathogen.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (16), 3788-3797 (2018).</li>
<li>Pierce, A. E., Pierce, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+note+on+the+cultivation+of+Boophilus+microplus+%28Canestrini%2C+1887%29+%28Ixodidae%3A+Acarina%29+on+the+embyonated+hen+egg%5BTitle%5D)+AND+%22Australian+Veterinary+Journal%22%5BJournal%5D)">A note on the cultivation of Boophilus microplus (Canestrini, 1887) (Ixodidae: Acarina) on the embyonated hen egg.</a> Australian Veterinary Journal. 32 (6), 144-146 (1956).</li>
<li>Doube, B. M., Kemp, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+temperature%2C+relative+humidity+and+host+factors+on+the+attachment+and+survival+of+Boophilus+microplus+%28Canestrini%29+larvae+to+skin+slices%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The influence of temperature, relative humidity and host factors on the attachment and survival of Boophilus microplus (Canestrini) larvae to skin slices.</a> International Journal for Parasitology. 9 (5), 449-454 (1979).</li>
<li>Kröber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+feeding+assay+to+test+acaricides+for+control+of+hard+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">An in vitro feeding assay to test acaricides for control of hard ticks.</a> Pest Management Science. 63 (1), 17-22 (2007).</li>
<li>Kuhnert, F., Diehl, P. A., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life-cycle+of+the+bont+tick+Amblyomma+hebraeum+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+for+Parasitology%22%5BJournal%5D)">The life-cycle of the bont tick Amblyomma hebraeum in vitro.</a> International Journal for Parasitology. 25 (8), 887-896 (1995).</li>
<li>Kröber, T., Guerin, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+feeding+assays+for+hard+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Parasitology%22%5BJournal%5D)">In vitro feeding assays for hard ticks.</a> Trends in Parasitology. 23 (9), 445-449 (2007).</li>
<li>Andrade, J. J., Xu, G., Rich, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+silicone+membrane+for+in+vitro+feeding+of+Ixodes+scapularis+%28Ixodida%3A+Ixodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">A silicone membrane for in vitro feeding of Ixodes scapularis (Ixodida: Ixodidae).</a> Journal of Medical Entomology. 51 (4), 878-879 (2014).</li>
<li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+of+immature+Ixodes+scapularis+%28Acari%3A+Ixodidae%29+by+membrane+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Medical+Entomology%22%5BJournal%5D)">Infection of immature Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae) by membrane feeding.</a> Journal of Medical Entomology. 53 (2), 409-415 (2016).</li>
<li>Oliver, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+dynamics+and+antibiotic+elimination+of+symbiotic+Rickettsia+buchneri+in+the+tick+Ixodes+scapularis+%28Acari%3A+Ixodidae%29%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+and+Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Growth dynamics and antibiotic elimination of symbiotic Rickettsia buchneri in the tick Ixodes scapularis (Acari: Ixodidae).</a> Applied and Environmental Microbiology. 87 (3), (2021).</li>
<li>Graham, E. E., Poland, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficacy+of+Fluon+conditioning+for+capturing+cerambycid+beetles+in+different+trap+designs+and+persistence+on+panel+traps+over+time%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Economic+Entomology%22%5BJournal%5D)">Efficacy of Fluon conditioning for capturing cerambycid beetles in different trap designs and persistence on panel traps over time.</a> Journal of Economic Entomology. 105 (2), 395-401 (2012).</li>
<li>Munderloh, U. G., Liu, Y., Wang, M., Chen, C., Kurtti, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment%2C+maintenance+and+description+of+cell+lines+from+the+tick+Ixodes+scapularis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Parasitology%22%5BJournal%5D)">Establishment, maintenance and description of cell lines from the tick Ixodes scapularis.</a> Journal of Parasitology. 80 (4), 533-543 (1994).</li>
<li>Lehane, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevalence+of+single+and+coinfections+of+human+pathogens+in+Ixodes+ticks+from+five+geographical+regions+in+the+United+States%2C+2013-2019%5BTitle%5D)+AND+%22Ticks+and+Tick-Borne+Diseases%22%5BJournal%5D)">Prevalence of single and coinfections of human pathogens in Ixodes ticks from five geographical regions in the United States, 2013-2019.</a> Ticks and Tick-Borne Diseases. 12 (2), (2021).</li>
<li>González, J., Bickerton, M., Toledo, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+artificial+membrane+feeding+for+ixodid+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Tropica%22%5BJournal%5D)">Applications of artificial membrane feeding for ixodid ticks.</a> Acta Tropica. 215, (2021).</li>
<li>Król, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluating+transmission+paths+for+three+different+Bartonella+spp.+in+Ixodes+ricinus+ticks+using+artificial+feeding%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Evaluating transmission paths for three different Bartonella spp. in Ixodes ricinus ticks using artificial feeding.</a> Microorganisms. 9 (5), 901(2021).</li>
<li>Anderson, J. F., Magnarelli, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+of+ticks%5BTitle%5D)+AND+%22Infectious+Disease+Clinics+of+North+America%22%5BJournal%5D)">Biology of ticks.</a> Infectious Disease Clinics of North America. 22 (2), 195-215 (2008).</li>
</ol>

האכלה מלאכותית של קרציות באמצעות ממברנות מספקת כלי שימושי למגוון הליכים ניסיוניים, אך לא צפויה להחליף את האכלת בעלי החיים בכל היישומים. שמירה על מושבות גדולות של קרציות בכל שלבי החיים ללא האכלת בעלי חיים היא בדרך כלל בלתי נסבלת. במקום זאת, מערכת ההזנה המלאכותית היא בעלת ערך למטרות אחרות כגון הדבקת קרציות בפתוגנים שאינם נתמכים על ידי פונדקאי מודל, הערכת ההשפעות של מינונים מבוקרים של תרכובות או מיקרואורגניזמים על הקרציות בסביבת הזנה פשוטה, או גידול מושבות קטנות של קרציות המסתמכות על חיות מארחות שאינן זמינות בקלות במעבדה<su...

מחלות המועברות על ידי קרציות משפיעות מאוד על בריאותם של בני אדם ובעלי חיים ברחבי העולם, ואחראיות ליותר משני שלישים מכל המחלות הקשורות לווקטורים בארה"ב בין השנים 2004 ל -20161. בנוסף, מספר המקרים גדל בשנים האחרונות, כאשר יותר אנשים ובעלי חיים מושפעים מקרציות והמחלות הקשורות אליהן 2,3. בעוד שסביר להניח שיש סיבות רבות למגמת העלייה במספר המקרים, האקלים המשתנה הוא גורם חשוב 3,4. העלייה המתמשכת הצפויה במספר מקרי המחלה המועברת על ידי קרציות מדגישה את הצורך לפתח כלים חדשים לחקר היחסים בין קרציות לפתוגנים שהן מעבירות.
ידוע כי קרציות עוברות שינויים פיזיולוגיים וביטוי גנים במהלך ההאכלה וכי שינויים אלה ממלאים תפקיד בהעברת פתוגן 5,6. ייתכן שיהיה קשה לבצע מחקרים הבוחנים את ההשפעות של הזנה מלאה וחלקית על העברה ורכישה של פתוגנים באמצעות מודלים של בעלי חיים, במיוחד במצבים שבהם מודלים של מכרסמים אינם רגישים לזיהום על ידי פתוגן מסוים. לדוגמה, זן Anaplasma phagocytophilum Variant-1 מועבר באופן טבעי בין Ixodes scapularis לאיילים אך אינו מסוגל להדביק עכברים, מה שמסבך את זיהום הקרציות במעבדה7. מערכות הזנה מלאכותיות יכולות להיות מיושמות גם כדי לסייע בחקר פתוגנים כגון Borrelia burgdorferi באמצעות שימוש במוטציות טרנסגניות שיש להן מחיקות גנים המעכבות העברה או זיהום8. שימוש במערכת הזנה מלאכותית מסייע לחוקרים לבודד את תפקיד הגנים בכך שהוא מאפשר להדבקה או העברה להתרחש רק בצד הקרציה, ובכך לבודד כל תגובה פונדקאית שעלולה לבלבל מחקרים כאלה.
באופן דומה, ייתכן שחלק משלבי החיים של קרציות המעורבות במחלות ובהעברת בעלי חיים לא יופעלו כדי להיזון ממיני מודל מעבדה נפוצים. נקבות Ixodes scapularis , למשל, חייבות להיות מוזנות מבעלי חיים גדולים יותר, בדרך כלל ארנבות9. בעוד שלעתים קרובות נגיש לניסויי מעבדה, הדרישות המנהליות והחקלאיות של שימוש בארנבים עולות על אלה של מכרסמים קטנים ועשויות להיות אסורות עבור מעבדות מסוימות. מיני קרציות אחרים, במיוחד אלה המעוררים דאגה וטרינרית, חייבים להיות מוזנים בבקר או בבעלי חיים גדולים אחרים שאינם מעשיים לשימוש ברוב המעבדות. שיטות האכלה חוץ גופית וזיהום, כגון הזנת ממברנות מלאכותיות, מספקות חלופות לשימוש בבעלי חיים מארחים גדולים או אקזוטיים.
בנוסף, השימוש במערכת הזנה מלאכותית מאפשר ניתוחים מסוימים שאולי לא יהיו אפשריים בשיטות האכלה מסורתיות של בעלי חיים. דוגמה אחת לכך היא שעל ידי הפרדת מקור הדם ממנגנון ההזנה, מתאפשרת בחינת התפקיד שעשוי להיות לדם של פונדקאים שונים בהעברת B. burgdorferi 10. בדיקה זו של הדם המארח והתפקיד שהדם עצמו ממלא בהיעדר התגובה החיסונית של המאכסן היא גורם חשוב ביכולת להבין מחזורי העברה של פתוגנים וכזה שמערכות הזנה מלאכותיות מסוגלות לעזור לענות עליו11. כמו כן, ניתן לכמת את מספרי ההעברה המדויקים של פתוגן במהלך הזנה ולא רק לבחון את הצלחת השידור והתבססותו במארח 8,12.
חלק מממברנות ההזנה המלאכותיות הראשונות שיוצרו עבור קרציות קשות יוצרו מעורות בעלי חיים או מממברנות שמקורן בבעלי חיים בשנות ה-50 וה-60 של המאה ה-2013,14. בשל האופי הביולוגי של ממברנות אלה, היו בעיות הן בייצור של ממברנות חדשות והן בחיי מדף. בשנות ה-90 פותחו קרומים מלאכותיים לחלוטין שהשתמשו בגב של רשת, נייר או בד עם ספיגת סיליקון15,16. סיליקון היה אידיאלי מכיוון שתכונותיו הפיזיות מחקות את נחיצות העור ודביקות קלה, יחד עם טבעו הביולוגי. בהתבסס על כך, קרובר וגרין, שעל עבודתם התבססה טכניקה זו, תיארו טכניקת הזנה של קרום קרניים ספוג סיליקון עבור הזנה מלאכותית של I. ricinus17.
שכלול השיטות של I. scapularis, מין קרוב, הוביל להבדלים בולטים בקשיות הסיליקון המשמש בספיגת קרום, המתכון לייצור ממברנה, מידות התא וממריץ ההתקשרות. בעוד שהשכלולים שדווחו במחקר זה הביאו למאפייני קרום דומים לאלה שדווחו על ידי Andrade et al., שפיתחו גם קרום מבוסס סיליקון המבוסס על Krober ו- Guerin לשימוש ב- I. scapularis, קיים הבדל בשלבי ספיגת הסיליקון, המאפשר את הגמישות להשתמש בפרוטוקול זה לשלבי חיים לא בוגרים של I. scapularis15, 18. מחקר זה מתאר גם תוספות ושינויים טכניים המבוססים על שימוש חוזר ונשנה בשיטה זו, שיטות עבודה מומלצות שמביאות להזנה מוצלחת ופתרון בעיות שעלולות להתעורר. שיטה זו שימשה להאכלת כל שלבי החיים הפעילים, להדבקת קרציות בחיידקים פתוגניים ולחשיפת קרציות למינונים מרובים של אנטיביוטיקה 19,20. בעוד ששיטת האכלת הממברנה המלאכותית המוצגת היא עבור I. scapularis, שיטה זו ניתנת להתאמה בקלות למינים אחרים של קרציות עם שינויים קלים בעובי הממברנה.

<table><tbody><tr><td>00-10 קשיות סיליקון</td><td>Smooth-On</td><td>Ecoflex 00-10</td><td>גודל ניסיון מחנות Smooth-On</td></tr><tr><td>00-50 קשיות סיליקון</td><td>Smooth-On</td><td>Ecoflex 00-50</td><td>גודל ניסיון מחנות Smooth-On 30</td></tr><tr><td>קשיות סיליקון</td><td>Smooth-On</td><td>Mold Star 30</td><td>גודל ניסיון מחנות Smooth-On</td></tr><tr><td>צלחות תרבית תאים 6 בארות</td><td>Corning Incorporated</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>אדנוזין טריפוספט (ATP)</td><td>Millipore Sigma</td><td>A1852-1VL</td><td>משמש לייצור תמיסה מימית של 3 מ"מ ATP שעברה סינון מעוקר באמצעות מסנן 0.2 מיקרומטר</td></tr><tr><td>דם בקר</td><td>HemoStat</td><td>DBB500</td><td>דפיברין מכני; 500 מ"ל בדרך כלל מספיקים לניסוי אחד</td></tr><tr><td>Clingwrap</td><td>Fisherbrand</td><td>22-305654&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>נייר סינון</td><td>פישרברנד</td><td>09-790-2C</td><td>חיטוי ומניחים להתקרר לפני השימוש. יכול להשתמש באיכות משובחת במקום בינונית מדי</td></tr><tr><td>פלואון (פוליטטרפלואורואתילן מימי)</td><td>Bioquip</td><td>2871</td><td>זמין ממקורות אחרים כגון https://canada-ant-colony.com/products/fluon-ptfe-10ml</td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>Millipore Sigma</td><td>G8270-100G</td><td></td></tr><tr><td>הקסאן</td><td>Millipore Sigma</td><td>139386-100ML</td><td></td></tr><tr><td>נייר עדשה</td><td>Fisherbrand</td><td>11-995</td><td>100% זהורית</td></tr><tr><td>ניסטטין &nbsp;</td><td>גולד ביוטכנולוגיה</td><td>N-750-10</td><td></td></tr><tr><td>פרפילם</td><td>פישרברנד</td><td>S37440&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין/פטריזון</td><td>Gibco</td><td>15240-096</td><td>או גנרי שווה ערך עם ריכוז כדלקמן (10,000 יחידות/מ"ל פניצילין, 10,000 ומיקרו; גרם/מ"ל של סטרפטומיצין, ו-25 ומיקרו; גרם/מ"ל של אמפוטריצין B)</td></tr> <tr><td>פגוסטימולנט</td><td>תוצרת הבית</td><td></td><td>שנאסף מהזנות קרציות קודמות</td></tr><tr><td>צינור פוליקרבונט</td><td>מקמאסטר-קאר</td><td>8585K204&nbsp;</td><td>חתוך לאורך 45 מ"מ, קוטר חיצוני של 1.25 אינץ', קוטר פנימי של 1 אינץ'. חיתוך דורש גלגל שחיקה של מסור חיתוך.</td></tr><tr><td>טבעות O מגומי</td><td>מקמאסטר-קאר</td><td>9452K38&nbsp;</td><td>עובי 5 מ"מ, קוטר פנימי 1.25 אינץ'</td></tr><tr><td>מלקחיים רכים למגע</td><td>VWR</td><td>470315-238&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>דבק סופר ציאנואקרילט</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>נייר Unryu&nbsp;</td><td>Art Supply מאחסנת</td><td></td><td>סיבי תות 10 גרם/מ"<סופ>2</סאפ>. נרכש בחנות ציוד לאמנות צבע רטוב, סנט פול, מינסוטה, ארה"ב</td></tr></tbody></table>

קרציות האכלת קרום מלאכותי עבור ixodes scapularis

Tick Artificial Membrane Feeding for Ixodes scapularis

קרציות והמחלות הנלוות אליהן הן נושא מחקר חשוב בשל בריאות הציבור והנטל הווטרינרי שלהן. עם זאת, דרישות ההזנה של קרציות במהלך המחקר והגידול יכולות להגביל שאלות ניסוי או את יכולתן של מעבדות לחקור קרציות ואת הפתוגנים הקשורים אליהן. מערכת הזנה מלאכותית של ממברנות יכולה להפחית בעיות אלה ולפתוח כיווני מחקר חדשים שאולי לא היו אפשריים במערכות מסורתיות להאכלת בעלי חיים. מחקר זה מתאר מערכת הזנה מלאכותית של ממברנות ששוכללה להצלחת הזנה וגודש בכל שלבי החיים של Ixodes scapularis . יתר על כן, ניתן לשנות את מערכת הזנת הממברנות המלאכותית המתוארת במחקר זה לשימוש עם מיני קרציות אחרים באמצעות עידון פשוט של עובי הממברנה הרצוי. היתרונות של מערכת הזנה מלאכותית ממברנות מאוזנים על ידי אינטנסיביות העבודה של המערכת, הגורמים הסביבתיים הנוספים שעשויים להשפיע על הצלחת ההאכלה, והצורך לשכלל את הטכניקה עבור כל מין חדש ושלב החיים של הקרציות.

האכלה מוצלחת תלויה אם רוצים גודש חלקי או מלא. מוזן בהצלחה I. scapularis להפוך גוון של אפור מתכת עבור מבוגרים להתנתק בכוחות עצמם מן הממברנה. עם זאת, אם הם לפחות בגודל אפונה, הם עשויים להיות מנותקים מן הממברנה בעת סיום האכלה. בשלבים לא בוגרים של I. scapularis , הגודל של קרציות חרוטות לחלוטין משתנה, ומכיוון שבניגוד לבוגרים, הן אינן מציגות שינוי צבע, ניתוק הוא הדרך הטובה ביותר לקבוע אם הקרצייה מעורבת במלואה. ראו איור 3 דוגמה לאופן שבו נימפה I. scapularis עשויה להיראות ...

מוצגת כאן שיטה להאכלת קרציות במבחנה באמצעות מערכת ממברנות מלאכותית המאפשרת גודש חלקי או מלא של מגוון שלבי חיים של הקרציות.

קרציות האכלת קרום מלאכותי עבור Ixodes scapularis

Ticks and their associated diseases are an important topic of study due to their public health and veterinary burden. However, the feeding requirements of ...

בעוד שהאכלת קרום מלאכותי נעשתה בעבר, הפרוטוקול שלנו פשוט יותר להתקנה וניתן להתאמה למיני קרציות אחרים עם כמה שינויים. היתרון העיקרי של הזנת ממברנות מלאכותיות הוא שהיא מאפשרת חשיפה לפתוגנים ולטיפולים שאולי לא יהיו אפשריים באמצעות הזנת בעלי חיים. מערכת הזנה מלאכותית זו של ממברנות יכולה להיות מיושמת על מיני פרוקי רגליים אחרים עם בדיקות מסוימות עבור phagostimulants אידיאלי ושינויים על עובי הממברנה האידיאלי.הפקת עובי הממברנה הנכון דורשת תרגול מסוים. הקפד להשתמש במיקרומטר כדי למדוד את העובי במספר מקומות על הממברנה. בנג'מין קול, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלנו יעזור לי להדגים את ההליך.כדי להתחיל, נגב משטח שטוח ולא נקבובי כגון זכוכית או בסיס מתכת מצופה קרמיקה של מעמד זרוע עם 70% אתנול ולאחר מכן כסה אותו בשכבה אחת של ניילון נצמד. ודאו שהניילון הנצמד שטוח וללא בועות או קמטים. הדביקו נייר ניקוי של 100% קרני אור למשטח המוכן.ודא שהוא שטוח ומתוח מעט באמצעות סרט דבק לכל ארבעת צידי הנייר. הכינו את תערובת הסיליקון בדרגת קשיות 0010 על ידי מדידת חמישה מיליליטר מכל חלק של ערכת הסיליקון לתוך מיכל חד פעמי. מערבבים קלות את שני הנוזלים ומוסיפים 1.5 מיליליטר הקסאן.ממשיכים לערבב עד שהתערובת הומוגנית ומעורבבת היטב. השתמשו בלחיצת גומי קטנה כדי לפזר את תערובת הסיליקון על נייר העדשה ואפשרו לה לעמוד דקה אחת כדי לוודא שהסיליקון נספג בנייר העדשה. ביציבות, מגרדים את עודפי הסיליקון הצידה עם הסחיטה תוך שימוש בכמות קטנה של לחץ כלפי מטה.בצעו מעבר שני עם הסחיטה מבלי להפעיל את הלחץ כלפי מטה כדי להסיר קווי סיליקון וליצור שכבה חלקה. עבור זחלים בלבד, טבלו את החלק העליון של תא ההזנה בשרף פלואורופולימר פלואון מספר פעמים, ואפשרו לו להתייבש בין יישומים כדי ליצור שכבה עקבית. השאירו את הממברנה לריפוי למשך 24 שעות לפחות בסביבה נטולת אבק כגון ארון כימי סגור או ארון בטיחות ביולוגית.לאחר מכן, ערבבו חלקים שווים של תערובת סיליקון A ו-B כדי להכין את תערובת הסיליקון בעלת 30 הקשיות לחיבור התאים לממברנה. טובלים את תאי הפוליקרבונט כרבע סנטימטר בתערובת הסיליקון ואז מניחים אותם על יריעת הממברנה, תוך הקפדה שלא לחפוף אף אחד מהסרטים. אפשרו לסיליקון המתחבר להחלים למשך 24 שעות לפחות.בעזרת אזמל, חותכים בזהירות את הקרום סביב כל אחד מהתאים המחוברים, חותכים את הקצוות כך שהוא יכול להתאים בצורה חלקה לתוך באר של צלחת שש באר ללא הרבה גירוד בצדדים. אפשר מספיק חומר מחוץ לתא כדי למקסם את תוספת הממברנה. חותכים חתיכה קטנה משאריות הקרום מכל פינה וממרכז יריעת הממברנה.הסר את הניילון הנצמד מכל חתיכה ומדד את החתיכות עם מיקרומטר כדי לקבוע את עובי הממברנה הממוצע. הניחו את תאי ההאכלה יחד עם טבעת O אחת בכל תא לתוך זכוכית כדי להיות autoclaved ב 121 מעלות צלזיוס במשך לפחות 20 דקות כדי לעקר. הניחו לתאים להתקרר לפני השימוש בהם.לאחר הוצאת תאי הממברנה האוטוקלאביים שהוכנו מראש והנחת טבעת ה-O סביבם, מלאו כל תא בכמות מספקת של 70% אתנול כדי לכסות את הממברנה. תן לו לשבת בצלחת שש באר במשך חמש דקות ולאחר מכן לחפש כל דליפות בין החדר לבין הממברנה ואת הממברנה עצמה. רוקנו את האתנול מהתאים ואז תנו לו להתייבש באוויר בתוך ארון בטיחות ביולוגית או מכסה מנוע זרימה למינרית.כדי לחמם ולהפעיל את המשלים בדם, לחמם אותו ב 56 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות ולהשלים דם בקר דפיברילציה מכנית עם שני גרם לליטר גלוקוז. ברגע שהקרום יבש, מרחו כ-20 מיקרוליטר של פאגוססטימולנט על החלק הפנימי של התא והטו את החדר כדי לפזר אותו על פני השטח. כאשר phagostimulant יבש, במהירות להוסיף את הקרציות לחדר עם מברשת או מלקחיים.אטמו את החלק העליון עם פרפילם מכיוון שהחום מאמבט המים עלול לגרום לו להיקרע. לאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של החום ודם פעיל לכל באר או חדר לתוך צינור חרוטי ומניחים אותו באמבט המים להגדיר ב 36 מעלות צלזיוס. הוסף חמישה מיקרוליטרים של ATP שלושה מילימולרי ו 50 מיקרוליטר של מלאי 100X של פטריות סטרפטומיצין פניצילין לכל חמישה מיליליטר דם לצינור ולהעביר 4.5 מיליליטר של הדם לתוך באר של צלחת שש באר.מניחים בעדינות את החדר לתוך הבאר, התאמת גובה טבעת O על החדר כך שהקרום יושב בדם, אך רמת הדם סביב הצד אינה עולה על הבאר. לאחר מכן הניחו את הבאר לתוך הדם בזווית כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בין הדם לממברנה. מניחים את המכסה של צלחת שש בארות על גבי תאי ההאכלה.שים את צלחת שש באר עם תאים לתוך מוכן 34 מעלות צלזיוס אמבט מים ואת המכסה. הוסף חמישה מיקרוליטרים של שלושה מילימולרים ATP ו 50 מיקרוליטר של מלאי 100X של פטריות סטרפטומיצין פניצילין לכל באר לצינור הדם ולהעביר 4.5 מיליליטר של דם לתוך באר של צלחת שש בארות טרי כפי שהוצג קודם לכן. הוציאו את צלחת שש הבארות עם תא הקרציות מאמבט המים והוציאו את החדר מהבאר.שטפו את החלק החיצוני של החדר והקרום עם 10 מיליליטר של PBS 1X מעוקר כדי להסיר את הדם. בעזרת נייר סינון אוטומטי, יבשו בעדינות את הממברנה ואת התא כדי להסיר את עודפי PBS. אם יש הרבה עיבוי בתוך החדר, לטפוח לייבש את הכתמים הרטובים עם נייר מסנן autoclaved לפני אטימתו עם parafilm טרי.לאחר מכן החלף את הפרפילם בחלק העליון של החדר. הכניסו את תא הקרציות לצלחת שש הבארות החדשה עם דם טרי, והתאימו את גובה טבעת ה-O במידת הצורך. חזור על שלבים אלה עבור כל תא בצלחת.לבסוף, הניחו את המכסה של צלחת שש הבארות מעל החלק העליון של החדרים והחזירו את צלחת שש הבארות החדשה לאמבט המים של 34 מעלות צלזיוס. כאן מוצגת הזנה מתמשכת עם נימפות ixodes scapularis חרוטות חלקית. הנקודות השחורות או החומות סביב אתרי ההתקשרות הן הכפור שניתן לאסוף במהלך ואחרי ההזנה כדי להפוך את phagostimulant.נימפות ixodes scapularis חרוטות חלקית נראות מחוברות לממברנה. ניתן לראות כאן גם קליפה של עובש הזחלים החרוטים. מספרי גודש הקרציות ומשקלי מסת הביצים מוצגים בטבלה זו.בתנאי ניסוי של גודש זחל ונימפה נוסף איבר צבי לדם בנוסף לתוספים המשמשים בטכניקה זו. כאן, גודש מוצלח הוגדר כקרציות חרוטות שנמסו בהצלחה לשלב החי הבא או נקבות חרוטות שהטילו ביצים בהצלחה. נדרש תרגול כדי לקבל עובי מקובל בעת מריחת סיליקון על נייר העדשה ולכן חשוב תמיד למדוד את עובי הממברנה לפני השימוש.הזנת ממברנות עלולה לחשוף את הקרציות לפתוגנים או לאנטיביוטיקה. ההשפעות של אלה על היבטים של ביולוגיה של קרציות כגון הצלחת ההתכה, הטלת ביצים והישרדות ניתן להעריך לאחר ההזנה.

tick-artificial-membrane-feeding-for-ixodes-scapularis

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אוסף של hemolymph לתקתק נגוע, בלוטות הרוק, ורוק חשוב ללמוד איך לתקתק נישאים פתוגנים לגרום למחלה. בפרוטוקול זה אנו מדגימים כיצד לאסוף את בלוטות הרוק hemolymph ו מ...

רוק, בלוטות הרוק, וכן אוסף Hemolymph מ קרציות קרצית Scapularis

מחלת ליים היא המחלה וקטור הנישא ביותר המדווח בדרך כלל בצפון אמריקה. הסוכן סיבתי, Borrelia burgdorferi הוא חיידק החיידק מועבר על ידי קרציות Ixodid. הילוכים וזיהוי של זיהום במודלים של בעלי חיים מותאם על ידי השימוש בהאכלה לתקתק, שאנו מתארים כאן.

האכלה של קרציות בבעלי חיים להילוכים וXenodiagnosis במחקר מחלת ליים

ההפקה של קרציות מעבדה-שגדל בריאה חיונית מחקרים על ביולוגית קרציה, וסמן-הפתוגן אינטראקציות. כאן אנו מדגימים פרוטוקול פשוט עבור האכלה לתקתק בשלה כי היא חסכונית ופחות מלחיץ לעכברים.

Rearing<em&gt; Scapularis קרצית,</em&gt; את הטיק השחור רגליים: האכלת שלבי Immature על עכברים

במחקר זה, מערכת האכלה עבור שלבי נימפה וזחל של קרצייה קשה פותחה באמצעות כמוסה המחוברת לעכבר מעבדה. קפסולת ההאכלה עשויה מחומרים גמישים ונשארת מחוברת היטב לעכבר למשך שבוע אחד לפחות ומאפשרת ניטור נוח של הזנת קרציות.

מודל מבוסס קפסולה לשריצה בשלבי קרציות קשות לא בוגרים בעכברי מעבדה

מטרת פרוטוקול זה היא לספק ארוחות דם שמקורן בבעלי חיים ומלאכותיות ליתושים Aedes aegypti באמצעות מאכיל קרום מלאכותי ולכמת במדויק את נפח הארוחה שנבלעה.

האכלה וכימות של דם שמקורו בבעלי חיים וארוחות מלאכותיות יתושים Aedes aegypti

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד של מיקרו-רנ"א מבלוטות הרוק של קרציות ושלפוחיות חוץ-תאיות מטוהרות. זהו הליך אוניברסלי המשלב ריאגנטים ואספקה נפוצים. השיטה גם מאפשרת שימוש במספר קטן של קרציות, וכתוצאה מכך מיקרו-רנ"א איכותיים שניתן לרצף בקלות.

בידוד של מיקרו-רנ"א מתרביות בלוטת הרוק של Tick Ex Vivo ושלפוחיות חוץ-תאיות

מאמר זה מציג את המתודולוגיה לחשיפת בני אדם לזחל Ixodes scapularis לצורך מחקר קליני. הטכניקה פשוטה יחסית, נסבלת על ידי מתנדבי המחקר, וניתנת לשינוי בהתאם לצרכי הניסוי. מחקר כזה בבני אדם חייב להתבצע תחת פרוטוקולי מחקר קליני שאושרו על ידי הרשויות הרגולטוריות המתאימות.

מודל לחשיפה ניסיונית של בני אדם לקרציות זחל Ixodes scapularis

שיטה זו מתארת את פיתוח מערכת הזנת דם מקרציות במבחנה , המשלבת תא מודפס בתלת-ממד וממברנת סיליקון מעבדתית. המערכת מאפשרת האכלה מלאכותית של קרציות, ומאפשרת דגימה קלה בשלבים שונים של האכלה ושימוש בכמויות דם נמוכות, ומספקת כלי יקר ערך לחקר קרציות איקסודיד.

דם קרציות המזין דרך ממברנה מלאכותית בתא מודפס בתלת-ממד במחקר קרציות איקסודיד

בסרטון זה assay הוא הוכיח כי הבדיקות סובלנות של ניקוטין שני סוגים של כנימות אחד פושט צמחי טבק בתחום ואחד לא.

בדיקת סובלנות ניקוטין ב כנימות באמצעות ניסוי דיאט מלאכותית

Bilayers השומנים מישורי, הנקרא גם bilayers השומנים מלאכותית, מאפשרים לך ללמוד ניצוח יון ערוצי בסביבה מוגדרת היטב. הנה, אנחנו מדגימים את השלבים הפרט צריך להכין את החדר bilayer, האלקטרודות וכיצד הבדיקה bilayer מתאים ערוץ בודד במדידות.

הכנת Bilayers מלאכותית לניסויים Electrophysiology

למד שיטה פשוטה להאכלה מלאכותית של קרציות Ixodes scapularis באמצעות מערכת קרום סיליקון. שיטה זו מאפשרת חקר אינטראקציות קרציה-פתוגן ללא שימוש בבעלי חיים.

קרציות האכלת קרום מלאכותי עבור Ixodes scapularis

גלה סרטונים נוספים