קרציות האכלת קרום מלאכותי עבור Ixodes scapularis

בעוד שהאכלת קרום מלאכותי נעשתה בעבר, הפרוטוקול שלנו פשוט יותר להתקנה וניתן להתאמה למיני קרציות אחרים עם כמה שינויים. היתרון העיקרי של הזנת ממברנות מלאכותיות הוא שהיא מאפשרת חשיפה לפתוגנים ולטיפולים שאולי לא יהיו אפשריים באמצעות הזנת בעלי חיים. מערכת הזנה מלאכותית זו של ממברנות יכולה להיות מיושמת על מיני פרוקי רגליים אחרים עם בדיקות מסוימות עבור phagostimulants אידיאלי ושינויים על עובי הממברנה האידיאלי.

הפקת עובי הממברנה הנכון דורשת תרגול מסוים. הקפד להשתמש במיקרומטר כדי למדוד את העובי במספר מקומות על הממברנה. בנג'מין קול, פוסט-דוקטורנט במעבדה שלנו יעזור לי להדגים את ההליך.

כדי להתחיל, נגב משטח שטוח ולא נקבובי כגון זכוכית או בסיס מתכת מצופה קרמיקה של מעמד זרוע עם 70% אתנול ולאחר מכן כסה אותו בשכבה אחת של ניילון נצמד. ודאו שהניילון הנצמד שטוח וללא בועות או קמטים. הדביקו נייר ניקוי של 100% קרני אור למשטח המוכן.

ודא שהוא שטוח ומתוח מעט באמצעות סרט דבק לכל ארבעת צידי הנייר. הכינו את תערובת הסיליקון בדרגת קשיות 0010 על ידי מדידת חמישה מיליליטר מכל חלק של ערכת הסיליקון לתוך מיכל חד פעמי. מערבבים קלות את שני הנוזלים ומוסיפים 1.5 מיליליטר הקסאן.

ממשיכים לערבב עד שהתערובת הומוגנית ומעורבבת היטב. השתמשו בלחיצת גומי קטנה כדי לפזר את תערובת הסיליקון על נייר העדשה ואפשרו לה לעמוד דקה אחת כדי לוודא שהסיליקון נספג בנייר העדשה. ביציבות, מגרדים את עודפי הסיליקון הצידה עם הסחיטה תוך שימוש בכמות קטנה של לחץ כלפי מטה.

בצעו מעבר שני עם הסחיטה מבלי להפעיל את הלחץ כלפי מטה כדי להסיר קווי סיליקון וליצור שכבה חלקה. עבור זחלים בלבד, טבלו את החלק העליון של תא ההזנה בשרף פלואורופולימר פלואון מספר פעמים, ואפשרו לו להתייבש בין יישומים כדי ליצור שכבה עקבית. השאירו את הממברנה לריפוי למשך 24 שעות לפחות בסביבה נטולת אבק כגון ארון כימי סגור או ארון בטיחות ביולוגית.

לאחר מכן, ערבבו חלקים שווים של תערובת סיליקון A ו-B כדי להכין את תערובת הסיליקון בעלת 30 הקשיות לחיבור התאים לממברנה. טובלים את תאי הפוליקרבונט כרבע סנטימטר בתערובת הסיליקון ואז מניחים אותם על יריעת הממברנה, תוך הקפדה שלא לחפוף אף אחד מהסרטים. אפשרו לסיליקון המתחבר להחלים למשך 24 שעות לפחות.

בעזרת אזמל, חותכים בזהירות את הקרום סביב כל אחד מהתאים המחוברים, חותכים את הקצוות כך שהוא יכול להתאים בצורה חלקה לתוך באר של צלחת שש באר ללא הרבה גירוד בצדדים. אפשר מספיק חומר מחוץ לתא כדי למקסם את תוספת הממברנה. חותכים חתיכה קטנה משאריות הקרום מכל פינה וממרכז יריעת הממברנה.

הסר את הניילון הנצמד מכל חתיכה ומדד את החתיכות עם מיקרומטר כדי לקבוע את עובי הממברנה הממוצע. הניחו את תאי ההאכלה יחד עם טבעת O אחת בכל תא לתוך זכוכית כדי להיות autoclaved ב 121 מעלות צלזיוס במשך לפחות 20 דקות כדי לעקר. הניחו לתאים להתקרר לפני השימוש בהם.

לאחר הוצאת תאי הממברנה האוטוקלאביים שהוכנו מראש והנחת טבעת ה-O סביבם, מלאו כל תא בכמות מספקת של 70% אתנול כדי לכסות את הממברנה. תן לו לשבת בצלחת שש באר במשך חמש דקות ולאחר מכן לחפש כל דליפות בין החדר לבין הממברנה ואת הממברנה עצמה. רוקנו את האתנול מהתאים ואז תנו לו להתייבש באוויר בתוך ארון בטיחות ביולוגית או מכסה מנוע זרימה למינרית.

כדי לחמם ולהפעיל את המשלים בדם, לחמם אותו ב 56 מעלות צלזיוס במשך 40 דקות ולהשלים דם בקר דפיברילציה מכנית עם שני גרם לליטר גלוקוז. ברגע שהקרום יבש, מרחו כ-20 מיקרוליטר של פאגוססטימולנט על החלק הפנימי של התא והטו את החדר כדי לפזר אותו על פני השטח. כאשר phagostimulant יבש, במהירות להוסיף את הקרציות לחדר עם מברשת או מלקחיים.

אטמו את החלק העליון עם פרפילם מכיוון שהחום מאמבט המים עלול לגרום לו להיקרע. לאחר מכן להוסיף חמישה מיליליטר של החום ודם פעיל לכל באר או חדר לתוך צינור חרוטי ומניחים אותו באמבט המים להגדיר ב 36 מעלות צלזיוס. הוסף חמישה מיקרוליטרים של ATP שלושה מילימולרי ו 50 מיקרוליטר של מלאי 100X של פטריות סטרפטומיצין פניצילין לכל חמישה מיליליטר דם לצינור ולהעביר 4.5 מיליליטר של הדם לתוך באר של צלחת שש באר.

מניחים בעדינות את החדר לתוך הבאר, התאמת גובה טבעת O על החדר כך שהקרום יושב בדם, אך רמת הדם סביב הצד אינה עולה על הבאר. לאחר מכן הניחו את הבאר לתוך הדם בזווית כדי למנוע היווצרות בועות אוויר בין הדם לממברנה. מניחים את המכסה של צלחת שש בארות על גבי תאי ההאכלה.

שים את צלחת שש באר עם תאים לתוך מוכן 34 מעלות צלזיוס אמבט מים ואת המכסה. הוסף חמישה מיקרוליטרים של שלושה מילימולרים ATP ו 50 מיקרוליטר של מלאי 100X של פטריות סטרפטומיצין פניצילין לכל באר לצינור הדם ולהעביר 4.5 מיליליטר של דם לתוך באר של צלחת שש בארות טרי כפי שהוצג קודם לכן. הוציאו את צלחת שש הבארות עם תא הקרציות מאמבט המים והוציאו את החדר מהבאר.

שטפו את החלק החיצוני של החדר והקרום עם 10 מיליליטר של PBS 1X מעוקר כדי להסיר את הדם. בעזרת נייר סינון אוטומטי, יבשו בעדינות את הממברנה ואת התא כדי להסיר את עודפי PBS. אם יש הרבה עיבוי בתוך החדר, לטפוח לייבש את הכתמים הרטובים עם נייר מסנן autoclaved לפני אטימתו עם parafilm טרי.

לאחר מכן החלף את הפרפילם בחלק העליון של החדר. הכניסו את תא הקרציות לצלחת שש הבארות החדשה עם דם טרי, והתאימו את גובה טבעת ה-O במידת הצורך. חזור על שלבים אלה עבור כל תא בצלחת.

לבסוף, הניחו את המכסה של צלחת שש הבארות מעל החלק העליון של החדרים והחזירו את צלחת שש הבארות החדשה לאמבט המים של 34 מעלות צלזיוס. כאן מוצגת הזנה מתמשכת עם נימפות ixodes scapularis חרוטות חלקית. הנקודות השחורות או החומות סביב אתרי ההתקשרות הן הכפור שניתן לאסוף במהלך ואחרי ההזנה כדי להפוך את phagostimulant.

נימפות ixodes scapularis חרוטות חלקית נראות מחוברות לממברנה. ניתן לראות כאן גם קליפה של עובש הזחלים החרוטים. מספרי גודש הקרציות ומשקלי מסת הביצים מוצגים בטבלה זו.

בתנאי ניסוי של גודש זחל ונימפה נוסף איבר צבי לדם בנוסף לתוספים המשמשים בטכניקה זו. כאן, גודש מוצלח הוגדר כקרציות חרוטות שנמסו בהצלחה לשלב החי הבא או נקבות חרוטות שהטילו ביצים בהצלחה. נדרש תרגול כדי לקבל עובי מקובל בעת מריחת סיליקון על נייר העדשה ולכן חשוב תמיד למדוד את עובי הממברנה לפני השימוש.

הזנת ממברנות עלולה לחשוף את הקרציות לפתוגנים או לאנטיביוטיקה. ההשפעות של אלה על היבטים של ביולוגיה של קרציות כגון הצלחת ההתכה, הטלת ביצים והישרדות ניתן להעריך לאחר ההזנה.