Name: בידוד אוכלוסיות תאי גזע שקטים משרירי שלד בודדים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-09T13:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 35 s
Description: למדו לבודד אוכלוסיות תאי גזע שקטים ותאי מקור פיברו-שומניים משרירי שלד בודדים בעכברים. שיטה זו מאפשרת חקר פונקציות תאי גזע בהומאוסטזיס, התחדשות ומחלות שריר.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מיון התאים בוצע במתקן הליבה FACS, אוניברסיטת ארהוס, דנמרק. הדמויות נוצרו באמצעות Biorender.com. אנו מודים לד"ר ג'יי פארופ על שיתוף נוגדן הארנב נגד PDGFRa. עבודה זו נתמכה על ידי מענק התחלתי של AUFF ל- E.P. ו- Start Package מ- NovoNordiskFonden ל- E.P. (0071113) ול- A.D.M. (0071116).

<ol><li>Mauro, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cell+of+skeletal+muscle+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biophysical+and+Biochemical+Cytology%22%5BJournal%5D)">Satellite cell of skeletal muscle fibers.</a> The Journal of Biophysical and Biochemical Cytology. 9 (2), 493-495 (1961).</li>
<li>Relaix, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+on+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Perspectives on skeletal muscle stem cells.</a> Nature Communications. 12 (1), 692(2021).</li>
<li>Cheung, T. H., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+regulation+of+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews.+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Molecular regulation of stem cell quiescence.</a> Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 14 (6), 329-340 (2013).</li>
<li>Kann, A. P., Hung, M., Krauss, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-cell+contact+and+signaling+in+the+muscle+stem+cell+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell-cell contact and signaling in the muscle stem cell niche.</a> Current Opinion in Cell Biology. 73, 78-83 (2021).</li>
<li>Tedesco, F. S., Dellavalle, A., Diaz-Manera, J., Messina, G., Cossu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Repairing+skeletal+muscle%3A+regenerative+potential+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">Repairing skeletal muscle: regenerative potential of skeletal muscle stem cells.</a> Journal of Clinical Investigation. 120 (1), 11-19 (2010).</li>
<li>Murphy, M. M., Lawson, J. A., Mathew, S. J., Hutcheson, D. A., Kardon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Satellite+cells%2C+connective+tissue+fibroblasts+and+their+interactions+are+crucial+for+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Satellite cells, connective tissue fibroblasts and their interactions are crucial for muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3625-3637 (2011).</li>
<li>Lepper, C., Partridge, T. A., Fan, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+absolute+requirement+for+Pax7-positive+satellite+cells+in+acute+injury-induced+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">An absolute requirement for Pax7-positive satellite cells in acute injury-induced skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3639-3646 (2011).</li>
<li>Sambasivan, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7-expressing+satellite+cells+are+indispensable+for+adult+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Pax7-expressing satellite cells are indispensable for adult skeletal muscle regeneration.</a> Development. 138 (17), 3647-3656 (2011).</li>
<li>Sacco, A., Doyonnas, R., Kraft, P., Vitorovic, S., Blau, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-renewal+and+expansion+of+single+transplanted+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-renewal and expansion of single transplanted muscle stem cells.</a> Nature. 456 (7221), 502-506 (2008).</li>
<li>Joe, A. W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Muscle+injury+activates+resident+fibro%2Fadipogenic+progenitors+that+facilitate+myogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).</li>
<li>Wosczyna, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+stromal+cells+are+required+for+regeneration+and+homeostatic+maintenance+of+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal stromal cells are required for regeneration and homeostatic maintenance of skeletal muscle.</a> Cell Reports. 27 (7), 2029-2035 (2019).</li>
<li>Uezumi, A., Fukada, S. -I., Yamamoto, N., Takeda, S., Tsuchida, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenchymal+progenitors+distinct+from+satellite+cells+contribute+to+ectopic+fat+cell+formation+in+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Mesenchymal progenitors distinct from satellite cells contribute to ectopic fat cell formation in skeletal muscle.</a> Nature Cell Biology. 12 (2), 143-152 (2010).</li>
<li>Seale, P., Sabourin, L. A., Girgis-Gabardo, A., Mansouri, A., Gruss, P., Rudnicki, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pax7+Is+Required+for+the+Specification+of+Myogenic+Satellite+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Pax7 Is Required for the Specification of Myogenic Satellite Cells.</a> Cell. 102 (6), 777-786 (2000).</li>
<li>Shea, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sprouty1+regulates+reversible+quiescence+of+a+self-renewing+adult+muscle+stem+cell+pool+during+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Sprouty1 regulates reversible quiescence of a self-renewing adult muscle stem cell pool during regeneration.</a> Cell Stem Cell. 6 (2), 117-129 (2010).</li>
<li>Fukada, S. -I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+signature+of+quiescent+satellite+cells+in+adult+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Molecular signature of quiescent satellite cells in adult skeletal muscle.</a> Stem Cells. 25 (10), 2448-2459 (2007).</li>
<li>Liu, L., Cheung, T. H., Charville, G. W., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+skeletal+muscle+stem+cells+by+fluorescence-activated+cell+sorting%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Isolation of skeletal muscle stem cells by fluorescence-activated cell sorting.</a> Nature Protocols. 10 (10), 1612-1624 (2015).</li>
<li>Joe, A., Wang, J., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prospective+isolation+of+adipogenic+progenitors+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Investigative+Medicine%22%5BJournal%5D)">Prospective isolation of adipogenic progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Investigative Medicine. 55 (1), 124(2007).</li>
<li>Yi, L., Rossi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+progenitors+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Purification of progenitors from skeletal muscle.</a> Journal of Visualized Experiments. (49), e2476(2011).</li>
<li>Sherwood, R. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+adult+mouse+myogenic+progenitors%3A+functional+heterogeneity+of+cells+within+and+engrafting+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Isolation of adult mouse myogenic progenitors: functional heterogeneity of cells within and engrafting skeletal muscle.</a> Cell. 119 (4), 543-554 (2004).</li>
<li>Montarras, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+isolation+of+satellite+cells+for+skeletal+muscle+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Direct isolation of satellite cells for skeletal muscle regeneration.</a> Science. 309 (5743), 2064-2067 (2005).</li>
<li>Conboy, M. J., Cerletti, M., Wagers, A. J., Conboy, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-analysis+and+FACS+sorting+of+adult+muscle+fiber-associated+stem%2Fprecursor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+In+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Immuno-analysis and FACS sorting of adult muscle fiber-associated stem/precursor cells.</a> Methods In Molecular Biology. 621, 165-173 (2010).</li>
<li>de Morree, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+polyadenylation+of+Pax3+controls+muscle+stem+cell+fate+and+muscle+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alternative polyadenylation of Pax3 controls muscle stem cell fate and muscle function.</a> Science. 366 (6466), 734-738 (2019).</li>
<li>Stuelsatz, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraocular+muscle+satellite+cells+are+high+performance+myo-engines+retaining+efficient+regenerative+capacity+in+dystrophin+deficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Biology%22%5BJournal%5D)">Extraocular muscle satellite cells are high performance myo-engines retaining efficient regenerative capacity in dystrophin deficiency.</a> Developmental Biology. 397 (1), 31-44 (2015).</li>
<li>Mookhtiar, K., Randall Steinbrink, D., Van Wart, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mode+of+hydrolysis+of+collagen-like+peptides+by+class+I+and+class+II+Clostridium+histolyticum+collagenases%3A+evidence+for+both+endopeptidase+and+tripeptidylcarboxypeptidase+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mode of hydrolysis of collagen-like peptides by class I and class II Clostridium histolyticum collagenases: evidence for both endopeptidase and tripeptidylcarboxypeptidase activities.</a> Biochemistry. 24 (23), 6527-6533 (1985).</li>
<li>Stenn, K. S., Link, R., Moellmann, G., Madri, J., Kuklinska, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dispase%2C+a+neutral+protease+from+Bacillus+polymyxa%2C+is+a+powerful+fibronectinase+and+type+IV+collagenase%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Investigative+Dermatology%22%5BJournal%5D)">Dispase, a neutral protease from Bacillus polymyxa, is a powerful fibronectinase and type IV collagenase.</a> The Journal of Investigative Dermatology. 93 (2), 287-290 (1989).</li>
<li>Baghdadi, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reciprocal+signalling+by+Notch-Collagen+V-CALCR+retains+muscle+stem+cells+in+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Reciprocal signalling by Notch-Collagen V-CALCR retains muscle stem cells in their niche.</a> Nature. 557 (7707), 714-718 (2018).</li>
<li>van Velthoven, C. T. J., de Morree, A., Egner, I. M., Brett, J. O., Rando, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+profiling+of+quiescent+muscle+stem+cells+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Transcriptional profiling of quiescent muscle stem cells in vivo.</a> Cell Reports. 21 (7), 1994-2004 (2017).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+fixation+redefines+quiescence+and+early+activation+of+skeletal+muscle+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">In situ fixation redefines quiescence and early activation of skeletal muscle stem cells.</a> Cell Reports. 21 (7), 1982-1993 (2017).</li>
<li>Machado, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+damage+induces+a+conserved+stress+response+that+initiates+quiescent+muscle+stem+cell+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Tissue damage induces a conserved stress response that initiates quiescent muscle stem cell activation.</a> Cell Stem Cell. 28 (6), 1125-1135 (2021).</li>
<li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Moore, D. K., Motaung, B., du Plessis, N., Shabangu, A. N., Loxton, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SU-IRG+consortium+isolation+of+B-cells+using+Miltenyi+MACS+bead+isolation+kits%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">SU-IRG consortium isolation of B-cells using Miltenyi MACS bead isolation kits.</a> PloS One. 14 (3), 0213832(2019).</li>
<li>Liou, Y. -R., Wang, Y. -H., Lee, C. -Y., Li, P. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Buoyancy-activated+cell+sorting+using+targeted+biotinylated+albumin+microbubbles%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Buoyancy-activated cell sorting using targeted biotinylated albumin microbubbles.</a> PloS One. 10 (5), 0125036(2015).</li>
<li>Brett, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exercise+rejuvenates+quiescent+skeletal+muscle+stem+cells+in+old+mice+through+restoration+of+Cyclin+D1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Exercise rejuvenates quiescent skeletal muscle stem cells in old mice through restoration of Cyclin D1.</a> Nature Metabolism. 2 (4), 307-317 (2020).</li>
<li>Tabula Muris Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+atlas+characterizes+ageing+tissues+in+the+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic atlas characterizes ageing tissues in the mouse.</a> Nature. 583 (7817), 590-595 (2020).</li>
<li>de Morrée, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staufen1+inhibits+MyoD+translation+to+actively+maintain+muscle+stem+cell+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Staufen1 inhibits MyoD translation to actively maintain muscle stem cell quiescence.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (43), 8996-9005 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין אינטרסים כלכליים מתחרים ואין ניגודי עניינים.

מספר שלבים הם המפתח בביצוע פרוטוקול זה כדי להשיג תשואות טובות. לשרירים הבודדים יש נפח קטן בהשוואה לכמות השריר המשמשת בפרוטוקולי בידוד בתפזורת. התוצאה היא סיכון שהשריר יתייבש במהלך הדיסקציה, מה שמקטין את התפוקה. כדי למנוע זאת, חשוב להוסיף מדיום לשרירים מיד לאחר הדיסקציה. בנוסף, אם הדיסקציה נמשכת זמן רב יותר, ניתן להסיר את העור מגפה אחת בכל פעם כדי להפחית את זמן החשיפה של השרירים לאוויר. הנפח הקטן יותר גורם גם לסיכון מוגבר לעיכול יתר. כדי להתמודד עם זה, השיטה הנוכחית דורשת כמויות נמוכות יותר של אנזים collagenase II וזמני ע...

שרירי השלד הם בעלי יכולת התחדשות גבוהה בשל נוכחות תאי גזע שריריים (MuSCs). MuSCs ממוקמים על myofibers, מתחת למינה הבסיסית, ומתגוררים במצב שקט של מחזור תאים ממושך והפיך יציאה 1,2,3,4. עם פציעה, MuSCs מופעלים ונכנסים למחזור התא כדי ליצור אבות מגבירים שיכולים להתמיין ולהתמזג ליצירתמיופייבר 2,5 חדשים. עבודות קודמות הראו כי MuSCs חיוניים לחלוטין להתחדשות שרירים 6,7,8. יתר על כן, MuSC יחיד יכול להשתיל וליצור גם תאי גזע חדשים וגם מיוסיבים חדשים9. שרירי השלד מכילים גם אוכלוסייה של תאי סטרומה מזנכימליים הנקראים אבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs), אשר ממלאים תפקיד מכריע בתמיכה בתפקוד MuSC במהלך התחדשות שרירים 6,10,11,12.
בשל הפוטנציאל שלהם לתאם התחדשות שרירים, היה עניין עצום בהבנת האופן שבו MuSCs ו- FAPs עובדים. MuSCs שקטים מסומנים על ידי ביטוי של גורמי השעתוק Pax7 ו- Sprouty1, וקולטן הקלציטונין של חלבון פני השטח של התא, בעוד ש- FAPs שקטים מסומנים על ידי קולטן גורם גדילה הנגזר מטסיות הדם של פני התא אלפא (PDGFRa)10,12,13,14,15 . מחקרים קודמים הראו כי MuSCs ו- FAPs יכולים להיות מטוהרים משרירי השלד באמצעות סמנים של פני השטח של התא ומיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) 9,15,16,17,18,19,20,21. בעוד פרוטוקולים אלה קידמו מאוד את היכולת לחקור MuSCs ו- FAPs, חסרון אחד הוא שרוב הפרוטוקולים הללו דורשים בידוד של MuSCs ממאגר של רקמות שריר שונות. עבודות אחרונות שלנו ושל אחרים חשפו הבדלים בפנוטיפ התא וברמות ביטוי הגנים בין MuSCs שבודדו מרקמות שונות22,23. MuSCs מהסרעפת, התלת ראשי והגרציליס מראים הפעלה מהירה יותר מאשר MuSCs משרירי הגפיים האחוריות התחתונות22, בעוד MuSCs משריר חוץ-עיני מראים התמיינות מהירה יותר מאשר MuSCs מהסרעפת ומשרירי הגפיים האחוריות התחתונות23.
פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של MuSCs ו-FAPs משרירי שלד בודדים (איור 1). זה כולל את הדיסקציה של הסרעפת, triceps, gracilis, tibialis anterior (TA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), gastrocnemius (GA), ואת שרירי masseter. שרירים מנותחים מנותקים לאחר מכן על ידי עיכול אנזימטי באמצעות collagenase II (פרוטאז המכוון באופן ספציפי לרצף האמינו Pro-X-Gly-Pro בקולגן, המאפשר פירוק של דיסוציאציה של רקמת חיבור ורקמות24) ו dispase (פרוטאז המבקע פיברונקטין וקולגן IV, המאפשר דיסוציאציה נוספת של תאים25). MuSCs ו- FAPs מבודדים מתרחיפים של תא יחיד על ידי FACS. כדוגמאות לבדיקות במורד הזרם לניתוח תאים, הפעלת תאי גזע נקבעת על ידי שילוב 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), בעוד טוהר התא נקבע על ידי צביעת immunofluorescence עבור סמנים ספציפיים מסוג התא Pax7 ו- PDGFRa.

<table><tbody><tr><td>צינור 1.5 מ"ל (ביצועי PCR נבדקו, PP, 30,000 xg, ללא DNA/DNase-/RNase, קשירת DNA נמוכה, סטרילי)</td> <td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>72.706.700</td><td>צינור 1.5 מ"ל 15</td></tr><tr><td>מ"ל שפופרת (PP/HD-PE, 20,000 xg, IVD/CE, IATA, DNA/DNase-/RNase-free, לא ציטוטוקסי, ללא פירוגן, סטרילי)</td> <td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>62.554.502</td><td>צינור</td></tr> <tr><td>15 מ"לצינור פוליסטירן תחתון עגול 5 מ"ל</td><td>פלקון, פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>352054</td><td>צינור FACS ללא מכסה מסננת</td></tr><tr><td>5 מ"ל פוליסטירן צינור תחתון עגול עם מכסה מסננת תאים</td><td>פלקון, פישר סיינטיפיק&nbsp; &nbsp;</td><td>352235</td><td>צינור FACS עם מכסה מסננת</td></tr><tr><td>צינור 5 מ"ל (PP, לא סטרילי ניתן לחיטוי)</td> <td>אוסף VWR</td><td>525.0946</td><td>צינור 5 מ"ל</td></tr><tr><td>50 מ"ל (PP / HD-PE, 20,000 xg, IVD / CE, ADR, DNA / DNase-/RNase ללא נאז, לא ציטוטוקסי, ללא פירוגן, סטרילי)</td> <td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>62.547.254</td><td>צינור 50 מ"ל</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 555 חמור נגד ארנב IgG (H + L)</td> <td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lot: 2387458 (Cat # A31572)</td><td></td></tr> <tr><td>Alexa Fluor 647 חמור-אנטי עכבר IgG (H + L)</td> <td>Invitrogen, Thermo Fisher</td><td>Lot: 2420713 (Cat # A31571)</td><td></td></tr> <tr><td>ARIA 3</td><td>BD</td><td></td><td>FACS, מתקן ליבה</td></tr><tr><td>צנטריפוגה אוניברסיטת ארהוס 5810</td><td>eppendorf</td><td>EP022628188</td><td></td></tr><tr><td>ערכת התפשטות תאים Click-iT EdU להדמיה, Alexa Fluor 488 צבע</td><td>Invitrogenתרמו פישר</td><td>לוט: 2387287 (Cat# C10337)</td> <td>ערכת התפשטות תאים</td></tr><tr><td>קולגן מעור עגל&nbsp;,</td><td>ביו-ריאגנט, סיגמא אולדריץ'&nbsp;</td><td>מקור: SLCK6209 (Cat# C8919)</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג II</td><td>וורת'ינגטון, פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>פריט: 40H20248 (cat# L5004177 )</td><td>קולגנאז</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Gibco, פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>מגרש: 2309415 (cat# 17105-041)</td><td>סרום חמור Dispase</td></tr><tr><td>(לא סטרילי)</td><td>Sigma Aldrich, Merck</td><td>מגרש: 2826455 (Cat# S30-100mL)</td><td></td></tr><tr><td>Dumont nr. 5, 110 מ"מ</td><td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1606.327</td><td>מלקחיים ישרים עם קצוות עדינים</td></tr><tr><td>Dumont nr. 7, 115 מ"מ</td><td>Dumont, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1606.335</td><td>מלקחיים</td></tr> <tr><td>מעוקליםתערובת נוטריאנטים F-10 (בשר חזיר) (1x), +L-גלוטמין</td><td>גיבקו, פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>Lot. 2453614 (cat# 31550-023)</td><td></td></tr><tr><td>FITC נגד עכבר CD31</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>MEC13.3 (Cat # 102506)FITC</td><td></td></tr> <tr><td>נגד עכבר CD45</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>30-F11 (Cat# 103108)</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אצטית קרחונית (100%)</td><td>EMSURE, Merck&nbsp; &nbsp;</td><td>K44104563 9Cat # 1000631000)</td><td></td></tr><tr><td>מסובב מיני צינור ראש מעל הראש&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>15534080 (דגם מס' 88861052)</td><td>ראש מעל הראש מיני צינור מסובב</td></tr><tr><td>סרום סוסים</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>לוט 2482639 (cat# 10368902 )</td><td></td></tr><tr><td>Isotemp SWB 15</td><td>FisherBrand, Fisher Scientific</td><td>15325887</td> אמבט <td>מים רועדים</td></tr><tr><td>MS2 מיני-שייקר&nbsp;</td><td>איקה&nbsp;</td><td></td><td>מחט יחידת מערבולת</td></tr><tr><td>20 גרם (0.9 מ"מ x 25 מ"מ)</td> <td>מיקרולנס BD, פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>304827</td><td>מחט 20 גרם&nbsp;</td></tr><tr><td>מאגר פורמלין ניטרלי 10%</td> <td>CellPath, Hounisen Laboratorieudstyr A/</td><td>S Lot: 03822014 (Cat # HOU/1000.1002)</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים לא פירוגנית (40 ומיקרו; M)</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>83.3945.040</td><td>מסננת תאים&nbsp;</td></tr><tr><td>פסיפיק כחול נגד עכבר Ly-6A/E (Sca-1)</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>D7 (Cat# 108120)</td><td></td></tr><tr><td>Pax7 נוגדן ראשוני</td><td>DSHB</td><td>לוט: 2/3/22-282ug/mL (Cat# AB 528428)</td><td></td></tr><tr><td>PBS 10x תרכיז אבקה</td><td>Fisher BioReagents, Fisher Scientific</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7 נגד עכבר CD106 (VCAM1)</td><td>BioLegend, NordicBioSite</td><td>429 (MVCAM. A) (Cat # 105720)</td><td></td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוס</td><td>Gibco, Fisher Scientific&nbsp;</td><td>לוט 163589 (cat# 11548876</td><td></td></tr>) <tr><td>קצות פיפטה p10</td><td>טיפים לאמנות, מחסום איטום עצמי, Thermo Scientific</td><td>2140-05</td><td>שימור נמוך, מעוקר מראש, טיפים לפילטר</td></tr><tr><td>קצות פיפטה p1000</td><td>טיפים לאמנות, מחסום איטום עצמי, Thermo Scientific</td><td>2279-05</td><td>שימור נמוך, מעוקר מראש, טיפים לפילטר</td></tr><tr><td>קצות פיפטה p20</td><td>טיפים לאמנות, מחסום איטום עצמי, Thermo Scientific</td><td>2149P-05</td><td>שימור נמוך, מעוקר מראש, קצות סינון</td></tr><tr><td>קצות פיפטה p200</td><td>טיפים אמנותיים, מחסום איטום עצמי, Thermo Scientific</td><td>2069-05</td><td>שימור נמוך, מעוקר מראש, קצות מסנן</td></tr><tr><td>כרית תחתונה מגן</td><td>Abena&nbsp;</td><td>ACTC-7712</td><td>&nbsp; 60X40 ס"מ, 8 שכבות</td></tr><tr><td>Rainin, פיפט-לייט XLS</td><td>מטלר טולדו, Thermo Scientific&nbsp;</td><td>2140-05, 2149P-05, 2279-05, 2069-05</td><td>פיפטות (P10, P20, P200, P1000)</td></tr><tr><td>רקומביננטי אנטי-PDGFR-alpha</td><td>RabMAb, אזמל AB134123</td><td></td><td></td>אבקאם</tr><tr><td>(פיר מס' 3)</td><td>Hounisen, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>1902.502</td><td>להב</td></tr><tr><td>אזמל אזמל מס' 11</td><td>היינץ הרנץ, מעבדת הוניסן A/S</td><td>1902.0911</td><td>אזמל</td></tr><tr><td>סקנלף מארס</td><td>לבוגן</td><td>ארון מחלקה 2:</td><td>ספסל זרימה</td>של מאדים</tr><tr><td>ScanR</td><td>מיקרוסקופ אולימפוס</td><td></td><td>, מתקן ליבה מספריים של אוניברסיטת ארהוס</td></tr><tr><td></td><td>FST</td><td>14568-09</td><td></td></tr><tr><td>סדרה 8000 DH</td><td>Thermo Scientific</td><td>3540-MAR</td><td>חממה</td></tr><tr><td>פיפטה סרולוגית 10 מ"ל</td><td>VWR</td><td>612-3700</td> פיפטה <td>סרולוגית סטרילית, לא פירוגנית</td></tr><tr><td>5 מ"ל</td><td>VWR, אוונטור מסופק על ידי VWR</td><td>612-3702</td> מזרק <td>סטרילי, לא פירוגני</td></tr><tr><td>5 מ"ל, קצה לואר (6%), סטרילי&nbsp;</td><td>BD Emerald, Fisher Scientific</td><td>307731</td><td>מזרק</td></tr><tr><td>TC Dish 100, תקן</td><td>Sarstedt AG & Co. KG, Hounisen Laboratorieudstyr A/S</td><td>83.3902</td><td>צלחת פטרי&nbsp;</td></tr><tr><td>משטח מטופל בתרבית רקמות (TC), פוליסטירן שחור, תחתית שטוחה, סטרילי, מכסה, חבילה של 20</td><td>קורנינג, סיגמא אולדריץ'</td><td>3764</td><td>96 בארות חצי צלחת תחתונה</td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>סיגמא אולדריץ', מרק</td><td>מקור: SLCJ6163 (Cat # T8787)</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד אוכלוסיות תאי גזע שקטים משרירי שלד בודדים

Isolation of Quiescent Stem Cell Populations from Individual Skeletal Muscles

שרירי השלד מכילים אוכלוסיות שונות של תאי גזע בוגרים התורמים להומאוסטזיס ולתיקון הרקמה. לתאי גזע של שרירי השלד (MuSCs) יש את היכולת לייצר שריר חדש, בעוד שאבות פיברו-אדיפוגניים (FAPs) תורמים לרקמות תומכות סטרומה ויש להם את היכולת לייצר פיברובלסטים ואדיפוציטים. גם MuSCs וגם FAPs חיים במצב של יציאה הפיכה ממושכת של מחזור התא, הנקרא שקט. המצב השקט הוא המפתח לתפקודם. תאי גזע שקטים מטוהרים בדרך כלל מרקמות שריר מרובות המאוגדות יחד בדגימה אחת. עם זאת, מחקרים אחרונים גילו הבדלים ברורים בפרופילים המולקולריים ובעומק השקט של MuSCs שבודדו משרירים שונים. הפרוטוקול הנוכחי מתאר את הבידוד והמחקר של MuSCs ו- FAPs משרירי שלד בודדים ומציג אסטרטגיות לביצוע ניתוח מולקולרי של הפעלת תאי גזע. הוא מפרט כיצד לבודד ולעכל שרירים ממוצא התפתחותי שונה, עוביים ותפקודים, כגון הסרעפת, תלת ראשי, gracilis, tibialis anterior (TA), gastrocnemius (GA), soleus, extensor digitorum longus (EDL), ואת שרירי Masseter. MuSCs ו- FAPs מטוהרים על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) ומנותחים על ידי צביעת immunofluorescence ובדיקת שילוב 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU).

בעקבות הפרוטוקול לבידוד שרירי שלד בודדים (איור 2), שרירי gracilis, TA, EDL, GA, soleus, triceps, Masseter ו-Diaphragm בודדו משלושה עכברים זכרים שוויצרים שהופסקו מתוכנית רבייה מקומית (איור 2). בעקבות דיסוציאציה של רקמות והכתמת נוגדנים, MuSCs ו-FAPs מהשרירים הבודדים טוהרו על-ידי FACS (איור 3). החיתוך הראשוני התקבל עם דגימה לא מוכתמת כדי לזהות את התאים ולהפריד את הסינגלטים מכפילים (איור 3A). השערים הבאים נ...

פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאי גזע שריריים ואבות פיברו-אדיפוגניים משרירי שלד בודדים בעכברים. הפרוטוקול כולל דיסקציה של שריר יחיד, בידוד תאי גזע על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי, הערכת טוהר על ידי צביעה אימונופלואורסצנטית, ומדידה כמותית של כניסה לשלב S על ידי בדיקת שילוב 5-ethynyl-2'-deoxyuridine.

Skeletal muscle harbors distinct populations of adult stem cells that contribute to the homeostasis and repair of the tissue. Skeletal muscle stem cells ...

פרוטוקול זה משמעותי מכיוון שהוא מאפשר לחקור את תפקוד תאי הגזע על פני שרירי שלד שונים, ולהעמיק את הבנתנו כיצד הם תורמים להומאוסטזיס, התחדשות והתקדמות המחלה. באמצעות פרוטוקול זה, אנו יכולים לבודד שתי אוכלוסיות של תאי גזע חיים משרירים ספציפיים ולחקור כיצד הם פועלים. כדי להתחיל בבידוד שרירים, רססו את העכבר שעבר המתת חסד באתנול והניחו אותו כשהבטן פונה כלפי מעלה.באמצעות מספריים, לבצע חתך אופקי באורך 0.5 ס"מ לתוך עור הבטן. בעזרת שתי הידיים, משוך את העור כדי לחשוף את פלג הגוף העליון, כמו גם את הגפיים התחתונות עד הגפיים האחוריות. אתרו את שריר הגרציליס או שריר הירך הפנימי ובעזרת זוג מלקחיים מעוקלים אחזו בו והרימו מעט את השריר.באמצעות מספריים, לבצע חתך 0.5 ס"מ לחתוך את שריר gracilis. חזור על ההליך ברגל השנייה. בעזרת אזמל, חותכים את הפאשיה על ידי ביצוע חתך של 0.5 ס"מ לאורך הצד הצידי של השוקה.לאחר מכן תפסו את הפאשיה באמצעות מלקחיים מעוקלים והוציאו אותה על ידי משיכה, תוך חשיפת הגידים בקצה הדיסטלי של הגפה האחורית. לאחר מכן, הכניסו זוג מלקחיים ישרים עם קצוות דקים במיוחד בין הגיד הדיסטלי של שריר TA לשריר EDL. הפרידו את השרירים על ידי החלקת המלקחיים לכיוון הקצה הפרוקסימלי של השרירים.מחזירים את המלקחיים לקצה הדיסטלי וחותכים את הגיד הדיסטלי. תפסו בעדינות את הגיד הדיסטלי של ה-TA בעזרת מלקחיים מעוקלים והרימו את השריר מעלה ומעל החיבור הפרוקסימלי שלו. כדי לחתוך בזהירות את הגיד הפרוקסימלי, חותכים את הקצה השני הכי קרוב שאפשר לחיבור שלו ומעבירים את ה- TA לצלחת פטרי.לאחר מכן השתמשו במלקחיים הישרים עם קצוות עדינים במיוחד כדי להיכנס מתחת לגיד הדיסטלי של ה-EDL ולהחליק את המלקחיים לכיוון הקצה הפרוקסימלי של השריר כדי להפריד את השרירים זה מזה. מחזירים את המלקחיים לקצה הדיסטלי וחותכים את הגיד הדיסטלי מבלי לפגוע בשריר. על ידי אחיזה עדינה בגיד הדיסטלי של EDL עם מלקחיים מעוקלים, הרימו את השריר למעלה ומעל החיבור הפרוקסימלי שלו כדי לחתוך בזהירות את הגיד הפרוקסימלי קרוב ככל האפשר לחיבור שלו.חותכים את הקצה השני ומעבירים את שריר ה-EDL לצלחת פטרי. חזור על ההליך עבור הגפה האחורית השנייה. השתמש במלקחיים ישרים עם קצוות עדינים במיוחד כדי להגיע בין גיד אכילס לבין עצמות הגפיים האחוריות התחתונות.החליקו את המלקחיים לכיוון הקצה הפרוקסימלי של השריר כדי להפריד את השריר מהעצמות. מחזירים את המלקחיים לקצה הדיסטלי וחותכים את הגיד הדיסטלי. משוך את שריר הגסטרוקנמיוס או GA למעלה ומעל הפיבולה.כדי לאתר את גיד הסולאוס הפרוקסימלי. הכנס את המלקחיים הישרים בין שרירי הסולאוס לשרירי GA והזז את המלקחיים לכיוון הקצה הדיסטלי של השרירים כדי להפריד את הסולאוס מה- GA. עכשיו לחתוך את גיד הסולאוס הפרוקסימלי. תפסו אותו במלקחיים מעוקלות והרימו בזהירות את הסו כדי לגשת לגיד הדיסטלי שלו.חותכים את הגיד הדיסטלי כדי לבודד את הסולאוס מה-GA ומניחים את הסולאוס בצלחת פטרי המכילה את מדיום השטיפה. לאחר מכן חותכים את GA ומניחים אותו בצלחת פטרי. כדי לבודד את שריר התלת ראשי, השתמשו במלקחיים ישרים בעלי קצוות דקים במיוחד כדי להגיע בין התלת ראשי לעצם ההומרוס והחליקו את המלקחיים לכיוון הקצה הפרוקסימלי של השריר כדי להפריד את השריר מהעצם.לאחר מכן, חתכו את הקצה הדיסטלי של שריר התלת ראשי ובעזרת מלקחיים מעוקלים משכו אותו למעלה ומעל המרפק כדי לגשת לגיד הפרוקסימלי. חותכים את הגיד הפרוקסימלי של התלת ראשי ומעבירים את השריר לצלחת פטרי. חזור על ההליך עבור ארבעת הגפיים האחרות.כדי להסיר את הפרווה ואת העור מן הלסת, להשתמש מספריים לעשות חתך 0.5 ס"מ מתחת לעין, חיתוך בכיוון קאודלי. לאחר מכן באמצעות האגודלים והאצבעות המורות של שתי הידיים, צבטו בכל צד של החתך והסירו את העור על ידי משיכתו כלפי מעלה ומטה. אתר את הגיד העיקרי של המעסה בצד הקאודלי מתחת לעין והכנס את להב האזמל השטוח בין העצם לשריר כדי לחתוך את הגיד.תפוס את גיד המסה העיקרי עם מלקחיים מעוקלים וחתך אותו עם להב אזמל או מספריים בכיוון הרוסטרלי כדי להפריד את שריר המסה מעצם הלסת. מניחים את שריר המסה המבודד בצלחת הפטרי וחוזרים על ההליך עבור שריר המסה השני. השתמש מספריים לעשות thoracotomy באמצע עצם החזה לחתוך דרך עצם החזה.חשוף את הסרעפת על ידי חיתוך 360 מעלות דרך כלוב הצלעות. לאחר מכן כדי להפריד את פלג הגוף העליון מהבטן השתמש במספריים כדי לחתוך דרך קנה הנשימה, הוושט, הווריד הנבוב ואבי העורקים הבטן. לאחר מכן, באמצעות מספריים, לבצע laparotomy סנטימטר אחד מתחת עצם החזה ולעשות לחתוך סביב 360 מעלות.מניחים את המספריים הסגורים בין כלוב הצלעות לאיברי הבטן ולוחצים כלפי מטה. משכו בעדינות את כלוב הצלעות כדי להפריד אותו מאיברי הבטן. כדי להפריד את הסרעפת מכלוב הצלעות, החזיקו את הסרעפת באופן רופף בין שתי אצבעות וחתכו דרך כלוב הצלעות במספריים.חותכים את הסרעפת קרוב ככל האפשר לצלעות סביב 360 מעלות ומניחים את הסרעפת המבודדת בצלחת פטרי. טחנו את השרירים המבודדים בזה אחר זה על ידי חיתוך שלהם לחתיכות של כמילימטר. מעבירים את השרירים הטחונים לצינור חרוטי של 15 ליטר המכיל חמישה ליטרים של חיץ דיסוציאציה, ודגרים על הצינור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 35 דקות באמבט מים רועד במהירות של 60 סיבובים לדקה.לאחר עיכול אנזימטי של השרירים הטחונים, להעביר את ההשעיה מצינור 15 מיליליטר לצינור 50 מיליליטר. באמצעות מזרק 10 מיליליטר מצויד מחט 20 מד, להשהות מחדש את הדגימה על ידי משיכת אותו למעלה ולמטה דרך המחט חמש פעמים. משכו את תרחיף התא לתוך המזרק וסננו את הדגימה לתוך צינור חרוטי חדש של 50 מיליליטר המצויד במסננת תאים מלמעלה.כדי לאחזר את כל התאים מונו גרעין, לשטוף את הצינור החרוטי ריק עם 20 מיליליטר של מדיה לשטוף ויוצקים אותו דרך המסננת כדי לשלב עם הדגימה מתוח. אחזר את הנפח הנותר מתחת למסננת התא עם פיפטה P1000. בעקבות דיסוציאציה של רקמות וצביעת נוגדנים, תאי גזע של שרירי השלד או MuSCs ואבות אדיפוגניים פיברו או FAPs משרירים בודדים טוהרו על ידי מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות.לאחר גיוט ראשוני לזיהוי התאים ולהפרדת הסינגלים מכפילים, נקבעו שערים עוקבים באמצעות פקדי FMO לזיהוי ספי צביעה. דגימת הכתם הייתה מגודרת ואוכלוסיית ה- CD31 החיובית ל- SCA1 והאוכלוסייה השלילית CD45 המתאימה ל- FAPs מויינה לשפופרת איסוף נפרדת. האוכלוסייה השלילית הכפולה גודרה עוד יותר כדי למיין את האוכלוסייה החיובית VCA המתאימה ל- MuSCs.המתלים החד-תאיים של שריר הסרעפת והתלת ראשי, בניגוד לאחרים, היו בעלי שכיחות יחסית גבוהה יותר של MuSCs מאשר FAPs. צביעת EDU, למרות שהיא חזקה, הצביעה על הבדל בשברים של תאים חיוביים ל-EDU עבור שני סוגי תאי הגזע ועל פני השרירים השונים. עם זאת, עבור כל הרקמות, החלק הממוצע של MuSCs חיוביים ל-EDU היה גבוה יותר מזה של FAPs חיוביים ל-EDU.MuSCs שבודדו מ-EDL ו-GA הראו שילוב EDU נמוך משמעותית בהשוואה לאלו של TA, דיאפרגמה, gracilis או תלת-ראשי. באופן דומה, שונות משמעותית בשילוב EDU נצפתה גם ב- FAPs שבודדו משרירים שונים. לבסוף, טוהר התאים אושר עם צביעה immunofluorescent, המציין את הספציפיות של פרוטוקול בידוד תאי גזע.השלב הקריטי ביותר הוא העיכול המכני של הרקמה. כאשר חותכים את הרקמה יותר מדי, הכדאיות יורדת. כאשר הרקמה נחתכת מעט מדי, הצלופח יורד.ניתן לשלב את הפרוטוקול עם בדיקות המודדות את התנהגות התא, כגון השתלה לאחר השתלה כדי להבין טוב יותר את תפקודי תאי הגזע in vivo. טכניקה זו עשויה לענות על השאלה האם הבדלים בהתנהגות תאי גזע בתוך שרירים בודדים יכולים לתרום לפנוטיפים של מחלות ולמחלות המאופיינות בדפוסים ייחודיים של שרירים מושפעים.

isolation-quiescent-stem-cell-populations-from-individual-skeletal

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

בידוד גזע בוגרים תאים ברקמות הרכות השלד מבוסס על מהירות הדבקות של התא בקבוק.

בידוד בתאי גזע רקמות השלד והשרירים Soft

מיקרו גזור טכניקה explants היא שיטה חזקה ואמינה לבידוד שגשוג התאים שריר השלד מן, השרירים נוער למבוגרים או עובריים כמקור לתאי גזע שרירי השלד. באופן ייחודי, התאים האלה כבר נגזר clonally לייצר גזע שריר השלד שורות תאים המשמשים in vivo השתלה.

למבוגרים עובריים שרירי השלד Microexplant התרבות בידוד בתאי גזע שרירי השלד

בידוד והתרבות של myofibers הוא תקן...

בידוד ותרבות של Myofibers פרט ותאי הלווין שלהם משרירי שלד למבוגרים

הבידוד והתרבות של אוכלוסייה טהורה של תאי לווין שקטים, אוכלוסיית תאי גזע שריר, הוא חיוני להבנה של ביולוגיה שרירים תאי גזע והתחדשות, כמו גם בתאי גזע להשתלה עבור טיפולים בניוון שרירים ומחלות ניווניות אחרות.

בידוד, תרבות והשתלה של תאי לווין שריר

כלי דם בתוך אוכלוסיות אנושיות נמל שריר שלד כמה רבת שושלת המבשרת כי הם אידיאליים עבור יישומי משובי. שיטת בידוד זה מאפשרת טיהור בו זמני של שלוש אוכלוסיות תאי מבשר multipotent בהתאמה משלוש שכבות מבניות של כלי דם: תאי myogenic אנדותל מאינטימה, pericytes מתקשורת, ותאי adventitial מadventitia.

בידוד של דם המופק מכולים multipotent מבשרים משרירי שלד אדם

סוגי התאים הדבקים העיקריים שמקורם בשריר אנושי הם תאים מיוגניים ופיברובלסטים. כאן, אוכלוסיות התאים מועשרות באמצעות מיון תאים מופעל מגנטי המבוסס על אנטיגן CD56. תיוג חיסוני לאחר מכן עם נוגדנים ספציפיים ושימוש בטכניקות ניתוח תמונה מאפשר כימות של מאפיינים ציטופלזמיים וגרעיניים בתאים בודדים.

בידוד וכמוני Immunocytochemical אפיון של תאים ראשוניים myogenic וFibroblasts משרירי שלד אדם

אנו מציגים טכניקות עבור בידוד, culturing, אפיון, וההבחנה תאים האדם העיקרי שריר השריר (hMPCs) המתקבל רקמת שריר השלד ביופסיה.  hmpcs התקבל ומאופיין באמצעות שיטות אלה ניתן להשתמש לאחר מכן לכתובת מחקר שאלות הקשורות מיוגנזה האדם התחדשות השלד שריר.

בידוד, תרבות, אפיון, והבידול של תאים האדם שריר ביופסיה של השלד שרירי השגרה נוהל

כאן, אנו מציעים שיטה ביעילות להשיג סיבי שריר בודד בשלב מוקדם לאחר לידה התפתחותית מ homozygous מוטציה Lamin δ 8-11 מודל העכבר, מודל חמור מאוד עבור השרירים נייל-דרייפוס ניוון שרירים (edmd).

בידוד ותרבות בודדים מודל מורנה של קבצי נייל-דרייפוס ניוון שרירים בתחילת לאחר לידה פיתוח

בפרוטוקול זה מתוארת שיטת ניתוח מבחנה וניתוח תפקודי לתאי גזע שריריים, המשמרת את רוב האינטראקציות שלהם עם הנישה האנדוגנית שלהם.

תפילת מיופיבר יחיד לבדיקה להערכת פונקציונליות תאי גזע שריר למבוגרים Ex Vivo

שרירי השלד מורכבים ממספר סוגי תאים, כולל תאי גזע תושבים, שלכל אחד מהם תרומה מיוחדת להומאוסטזיס והתחדשות שרירים. כאן מתוארת התרבית הדו-ממדית של תאי גזע שריריים ונישת תאי השריר בסביבה ex vivo המשמרת רבים מהמאפיינים הפיזיולוגיים, in vivo וסביבתיים.

תרבית בתפזורת בלתי מופרעת של שרירי שלד עכבר כדי לשחזר נישה ושקט תאי גזע

פרוטוקול זה מספק שיטה סטנדרטית לבידוד והעשרת מיובלסטים ראשוניים משרירי השלד של עכברים בוגרים ויילודים באמצעות ניתוק רקמות, סינון רציף, ציפוי מוקדם ותנאי תרבית מוגדרים, המאפשר הקמה ותחזוקה של תרביות מיובלסטים שמקורן בתאי לוויין ליישומים ניסיוניים במורד הזרם.

בידוד תאי לוויין שריר השלד למחקרי מיוגנזה במבחנה

למדו לבודד אוכלוסיות תאי גזע שקטים ותאי מקור פיברו-שומניים משרירי שלד בודדים בעכברים. שיטה זו מאפשרת חקר פונקציות תאי גזע בהומאוסטזיס, התחדשות ומחלות שריר.

בידוד אוכלוסיות תאי גזע שקטים משרירי שלד בודדים

גלה סרטונים נוספים