שיטת אלקטרופורציה להפיכת ריקטסיה spp. עם וקטור מעבורת המבטא חלבון פלואורסצנטי בקווי תאי קרציות

מחקרים פונקציונליים של גנים של ריקטסיה חיוניים להבנת תפקידם בפתוגנזה, ולכן אנו זקוקים לשיטות מהימנות לשינוי הגנים באופן מבוקר. הפרוטוקול שלנו משתמש באלקטרופורציה כדי להחדיר דנ"א אקסוגני לחיידקים תוך-תאיים מהסוג Rickettsia, ובכך מאפשר לנו לחקור את ההשפעות של הדנ"א שהוכנס. מי שתדגים את ההליך יחד איתי היום תהיה ליסה פרייס, חוקרת מהמעבדה של ד"ר מונדרלו וד"ר קורטי.

כדי להתחיל, הכינו תרבית תאי ISE6 נגועה ב-90% עד 100% ריקטסיה פרקרי כפי שמתואר בטקסט. לאחר מכן, כדי לקבוע את שיעור ההדבקה על ידי צביעת Giemsa, לדלל את תרחיף התא ליחס של 1:5 עם מדיום שלם ולהפקיד 100 מיקרוליטר של תרחיף התא על מיקרוסקופ זכוכית להחליק על ידי צנטריפוגה ב 113 G במשך חמש דקות. לאחר שמניחים להחלקה להתייבש באוויר, מקבעים ממנה מתנול מוחלט למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר.

לאחר מכן, דגירה של המגלשה וכתם Giemsa במשך 30 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, שטפו את המגלשה במים ולאחר הייבוש, צפו בה תחת מיקרוסקופ אור עם מטרות שמן. קבע את אחוז התאים הנגועים על-ידי ספירת התאים הנגועים והלא-נגועים.

כדי להכין את Rickettsia parkeri ללא תאים, לשפוך כ 0.2 מיליליטר של סטרילי 60 עד 90 סיליקון קרביד חצץ לתוך שני צינורות microcentrifuge סטרילי שני מיליליטר ולהניח את הצינורות בצד. מתוך בקבוקון נגוע Rickettsia parkeri שחוסן בעבר המכיל חמישה מיליליטר של בינוני, להסיר שני מיליליטר של המדיום, נזהר לא להפריע את שכבת התא. לאחר מכן, להשעות את התאים עם שלושת מיליליטר הנותרים של המדיום.

מחלקים את המתלה הזה באופן שווה בין שני צינורות חצץ סיליקון קרביד מוכנים ומערבבים את הצינור במהירות גבוהה במשך 30 שניות. לאחר מכן, הניחו אותם על קרח. לאחר מכן, הכינו מזרק נעילה סטרילי של חמישה מיליליטר על ידי הארכת הבוכנה והכניסו את קצה הבוכנה לבסיס פוליסטירן המשמש להחזקת צינורות חרוטיים של 15 מיליליטר.

באמצעות מחסום שני מיליליטר פסטר פיפטה המופעל עם נורת גומי, להסיר בזהירות את supernatant של תאי מערבולת מבלי לשאוף כל חצץ. לאחר מכן, הכנס את קצה הפיפטה לפתח רכזת המזרק והוצא את התוכן לתוך המזרק בלחץ עדין. לאחר מכן, סנן את תרבית Rickettsia parkeri לצינורות סטריליים של 1.5 מיליליטר באמצעות מסנן סטרילי בגודל נקבוביות של שני מיקרומטר המותקן על רכזת המזרקים וצנטריפוגה של הצינורות ב-13, 600 G למשך חמש דקות בארבע מעלות צלזיוס.

לאחר הסרת supernatant, לשטוף את גלולת התא פעמיים עם 1.2 מיליליטר של 300-מילימולר תמיסת סוכרוז קר כקרח. צנטריפוגה של הדגימה ולהסיר את supernatant בין שטיפות. בסוף הצנטריפוגה, יש להשעות את גלולת התא המאוגדת עם 100 עד 150 מיקרוליטרים של תמיסת סוכרוז קר כקרח עבור שתיים עד שלוש דגימות טרנספורמציה, בהתאמה.

לאחר מכן, חלקו את הדגימה ל-50-microliter aliquots בצינורות מיקרוצנטריפוגה מקוררים מראש, סטריליים, 1.5 מיקרוליטר. לטרנספורמציה בשלושה מיקרוגרם של pRAM18sSFA DNA פלסמיד נטול אנדוטוקסין לכל צינור המכיל 50 מיקרוליטרים של ריקטסיה פארקרי על הקרח ולערבב בעדינות עם קצה פיפטה. מעבירים את התערובת לקוביית אלקטרופורציה סטרילית מקוררת מראש עם מרווח של 0.1 ס"מ.

מקישים בעדינות על הקובט כדי לפזר את התערובת באופן שווה ודוגרים על קרח במשך 10 עד 30 דקות. בינתיים, הסר את המדיום מבקבוק תרבית תאי ISE6 שעבר תרבית בתרבית מלאה ושלח מחדש את שכבת התא על ידי שטיפה עדינה של התאים עם 1.5 מיליליטר של מדיום טרי המכיל סודיום ביקרבונט וחיץ HEPES. לאחר יצירת השעיית תאים הומוגנית, מעבירים את כל הנפח לצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי אחד של שני מיליליטר.

לאחר מכן, אלקטרופורציה של תערובת הדנ"א של ריקטסיה פארקרי ופלסמיד באמצעות אלקטרופורטור. לאחר האלקטרופורציה, השתמש בפיפטה סטרילית בעלת קצה עדין מורחב כדי להעביר כמות קטנה של תרחיף תאי ISE6 לתוך הקובטה ופיפטה עדינה למעלה ולמטה כדי לשחזר את ה- Rickettsia parkeri האלקטרופואטי. לאחר מכן, העבר את תוכן הקובט לצינור של שני מיליליטר המכיל את שארית ההשעיה של תא ISE6.

לאחר מכן, צנטריפוגה של הדגימה בטמפרטורת החדר, תחילה ב 700 G במשך שתי דקות כדי למשוך למטה את תאי ISE6, ולאחר מכן ב 13, 600 G במשך דקה אחת כדי למשוך למטה את Rickettsia. לדגור את הצינור ב 34 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות עד שעה. לאחר הדגירה, מעבירים את התכולה המחודשת של טרנספורמציה אחת לבקבוקון תרבית תאים אחד בגודל 25 ס"מ מרובע המכיל 3.5 מיליליטר של מדיום טרי עם סודיום ביקרבונט וחיץ HEPES.

נדנדו את הבקבוקון כדי לפזר את התערובת באופן שווה ולדגירה בטמפרטורה של 34 מעלות צלזיוס. לאחר 16 עד 24 שעות, הוסיפו 10 מיקרוליטרים כל אחד של ספקטינומיצין וסטרפטומיצין לתוך בקבוק הדגירה. נדנדו את הבקבוקון כדי לערבב את האנטיביוטיקה באופן שווה לתוך המדיום לפני החזרת הבקבוקון לאינקובטור.

התפשטות מוצלחת של תאי ריקטסיה פארקרי ותאי ISE6 מסוג בר ניכרה על ידי צביעת גימסה. הגרעינים של תאי ISE6 מוכתמים בסגול כהה עם Giemsa בתוך-תאי, כמו גם ריקטסי חוץ-תאי, נראים לעין. טרנספורמציה של Rickettsia parkeri המבטאת את החלבון הפלואורסצנטי האדום בתאי ISE6 אושרה על ידי מיקרוסקופיה קונפוקלית לאחר שבעה ימי דגירה.

עלייה משמעותית בשיעור ההדבקה נצפתה לאחר 10 ימים. שמור על הכל סטרילי במהלך כל ההליך. שימו לב לפרטים הקטנים והיו סבלניים, שכן למינים מסוימים של ריקטסיה לוקח זמן רב להשתנות, במיוחד אנדוסימביונטים הגדלים לאט.

פרוטוקול זה אפשר לחקור היבטים רבים של הביולוגיה של ריקטסיה ואת יחסי הגומלין שלהם עם וקטורים של פרוקי רגליים ופונדקאים של יונקים. לדוגמה, ריקטסי המבטא חלבון פלואורסצנטי שימש למעקב אחר תנועתיות ואינטראקציות של תאי קרציות סימביוטיות.