Name: ב Silico זיהוי ואפיון של circRNAs במהלך אינטראקציות פונדקאי-פתוגן (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 27 s
Description: חקור זיהוי ואפיון של circRNAs במהלך אינטראקציות פונדקאי-פתוגן באמצעות צינור עיבוד נתונים in silico. פרוטוקול זה מסייע לחוקרים לזהות מועמדים קליניים בעלי ערך אבחנתי ופרוגנוסטי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחבר רוצה להודות לטאן קה אן ולד"ר קמרון בראקן על ביקורתם על כתב היד הזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענקים מתוכנית מענקי מחקר בסיסית (FRGS/1/2020/SKK0/UM/02/15) ומענק מחקר בעל השפעה גבוהה באוניברסיטת מלאיה (UM. ג/625/1/HIR/MOE/CHAN/02/07).

בפרוטוקול זה, מערכי נתונים של ספריית RNA-seq ריבוזומלית (rRNA)-מדולדלת RNA-seq שהוכנו מתאי מקרופאג אנושיים נגועים בנגיף שפעת A הורדו ושימשו ממסד הנתונים של אומניבוס ביטוי גנים (GEO). כל צינור הביואינפורמטיקה מהחיזוי ועד לאפיון הפונקציונלי של ה-circRNA מסוכם באיור 1. כל חלק של הצינור מוסבר בהרחבה בסעיפים הבאים.
1. הכנה, הורדה והגדרה לפני ניתוח נתונים
הערה: כל חבילות התוכנה המשמשות במחקר זה הן חופשיות וקוד פתוח.
<ol><li>הורדת הכלים הנדרשים לפלטפורמת לינוקס<ol><li>הורד והתקן את התוכנות והכלים הדרושים המפורטים בטבלת החומרים במחשב בעל ביצועים גבוהים של Linux באמצעות ההוראות שסופקו על-ידי המפתח. הערה: לרוב הכלים והתוכנות יש דפי GitHub מקוונים משלהם או תיעוד המכיל הוראות להתקנת הכלים שלהם ולשימוש בהם (עיין בטבלת החומרים).</li>
		<li>הורד את ערכות הנתונים הרצויות של RNA-seq לזיהוי וניתוח circRNA מאתרי ארכיון רצפים (לדוגמה, ארכיון הנוקלאוטידים האירופי ואומניבוס ביטוי גנים).</li>
		<li>הורד את גנום הייחוס (תבנית FASTA) ואת קובצי הביאור (תבנית GTF/GFF3), התואמים למחשב המארח שממנו הוכן מערך הנתונים RNA-seq. גנום ייחוס מארח וקבצי ביאור נמצאים בדרך כלל בדפדפני גנום מקוונים כגון המרכז הלאומי למידע ביוטכנולוגי (NCBI), אוניברסיטת קליפורניה סנטה קרוז (UCSC) ואתרי האינטרנט של אנסמבל.</li>
	</ol></li>
	<li>בדיקת איכות של RNA-seq<ol><li>הזן את קבצי FASTQ לתוכנית FASTQC כדי לקבוע את איכות רצפי הרנ"א. אם האיכות של קבצי FASTQ נמוכה (לדוגמה, <Q20) או שיש נוכחות של רצפי מתאמים, ייתכן שיהיה צורך בחיתוך נוסף באמצעות כלים כגון Trimmomatic29,30.</li>
	</ol></li>
</ol>2. חיזוי וניתוח ביטוי דיפרנציאלי של circRNA באמצעות CIRIquant
הערה: מדריך מפורט יותר להתקנה וביצוע של ניתוח ביטויים דיפרנציאליים ניתן למצוא בסעיף זמינות הקוד במאמר CIRIquant31. הנתונים המשלימים כוללים גם כמה מהפקודות הבסיסיות המשמשות בפרוטוקול זה.
<ol><li>תחזיות CircRNA<ol><li>צור אינדקס של גנום הייחוס של המארח תחילה באמצעות קשתיות יישור BWA ו- HISAT2. לאחר מכן, במסוף לינוקס, בצע את הפקודות bwa index 32 ו- hisat2-build33 בספרייה של גנום הייחוס של המארח כדי לאנדקס אותו.</li>
		<li>לאחר מכן, הכן קובץ תצורת YML המכיל את שם הקובץ, נתיב הכלים (BWA, HISAT2, stringtie34, samtools35), הנתיב לקובצי הייחוס שהורדו (קבצי FASTA של גנום הייחוס של המארח, קבצי ביאור) והנתיב לקבצי האינדקס משלב 2.1.1.</li>
		<li>הפעל את הכלי CIRIquant מהמסוף באמצעות ברירת המחדל או פרמטרים ידניים. המשתמש יכול לציין את סוג הספרייה (תקועה או לא תקועה) של נתוני RNA-seq בעת הפעלת הכלי CIRIquant. הערה: ניתן לקבוע את סוג הספרייה של נתוני RNA-seq על-ידי הכרת סוג ערכת הכנת הספרייה שבה נעשה שימוש. אם זהותה של ערכת הכנת הספרייה אינה ידועה, ניתן להשתמש בחבילה ביואינפורמטית של בקרת RNA-seq בשם RSeQC36 כדי לקבוע את גדילות נתוני RNA-seq.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח ביטוי דיפרנציאלי הערה: חבילת CIRIquant כוללת prep_CIRIquant, prepDE.py ו-CIRI_DE_replicate; לכן, אין צורך בהורדות נוספות עבור שלושת הכלים הללו.<ol><li>הכנת קובץ טקסט ( .lst) עם רשימת נתונים המכילה את הנתונים הבאים: עמודה 1st : מזהים של נתוני RNA-seq המשמשים בשלב 2.1.3 עמודהשנייה : נתיב לקבצי GTF שהופקו על ידי CIRIquant עמודהשלישית : קיבוץ של נתוני RNA-seq, בין אם מדובר בקבוצת ביקורת או בקבוצת טיפול.</li>
		<li>לדוגמה, עיין בטבלה 1 להלן. הערה: אין צורך לשים את הכותרות כפי שהם רק לעיון.</li>
		<li>במסוף Linux, הפעל prep_CIRIquant עם קובץ הטקסט ( .lst) שהוכן בשלב 2.2.1 כקלט. ההפעלה תיצור רשימה של קבצים: library_info.csv, circRNA_info.csv, circRNA_bsj.csv ו - circRNA_ratio.csv.</li>
		<li>הכן קובץ טקסט שני עם רשימת נתונים המכילה את מזהי RNA-seq ואת הנתיב לפלט StringTie המתאים שלהם. פריסת הקובץ חייבת להיות דומה לקובץ הטקסט בשלב 2.2.1 ללא עמודת הקיבוץ.</li>
		<li>הפעל prepDE.py עם קובץ הטקסט שהוכן בשלב 2.2.4 כקלט ליצירת קבצי מטריצת ספירת הגנים.</li>
		<li>הפעל CIRI_DE_replicate עם קבצי library_info.csv ו- circRNA_bsj.csv משלב 2.2.3 וקובץ gene_count_matrix.csv משלב 2.2.5 כקלט כדי להפיק את קובץ circRNA_de.tsv הסופי.</li>
	</ol></li>
	<li>סינון של DE circRNAs<ol><li>השתמש ב- R (במסוף המחשב או ב- RStudio) או בכל תוכנת גיליון אלקטרוני (לדוגמה, Microsoft Excel) כדי לפתוח את קובץ circRNA_de.tsv שנוצר משלב 2.2.6 כדי לסנן ולקבוע את מספר ה- circRNA המבוטאים באופן דיפרנציאלי (DE).</li>
		<li>סינון DE circRNAs על פי הקריטריונים LogFC > |2| ו- FDR < 0.05.</li>
		<li>צור קובץ בשם DE_circRNAs.txt לאחסון המידע של DE circRNAs.</li>
	</ol></li>
</ol>3. אפיון וביאור של DE circRNA חזוי
<ol><li>מצב ביאור של DE circRNAs<ol><li>טען את הקובץ בשם DE_circRNAs.txt ב- RStudio , המורכב מרשימת DE circRNA המסוננת משלב 2.3.3. כלול מידע נוסף כגון המיקומים הגנומיים (Chr, Start, End), כיווני גדיל (+ או -), שם הגן וסוג circRNA. לפני שתמשיך, המר את קואורדינטות ההתחלה הגנומית של circRNA מ- CIRIquant ל- 0-based על ידי חיסור זוג בסיס אחד. הערה: ניתן לקבל את המידע האחר המצוין לעיל מקבצי GTF שהופקו על ידי CIRIquant (קובץ משלים 1).</li>
		<li>קבע את מצב הביאור של ה- DE החזוי circRNAs על ידי הורדת ספרייה המכילה את המיקומים הגנומיים של מסד הנתונים circRNA (למשל, circBase) שהופקד circRNAs. הערה: ודא שגרסת הגנום המשמשת לחיזוי ה- circRNA זהה לספריית מסד הנתונים circRNA לפני ביצוע ההשוואה. קובץ הנתונים circBase המשמש כאן זמין באופן חופשי בתיקיית הכונן המסופקת ב- Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)37.</li>
		<li>לאחר הכנת שני הקבצים משלב 3.1.1 ושלב 3.1.2, הפעל את סקריפט R שניתן בקובץ משלים 1. מיקומים כרומוזומליים של DE circRNA נשאלים לספריה לפני הקצאת המצב מבואר או לא מבואר.</li>
	</ol></li>
	<li>אפיון DE circRNAs<ol><li>השתמש ב-R ובתוכנות גיליון אלקטרוני אחרות כדי לסכם את מספר ה-circRNAs לפי סוגי ה-circRNA (כלומר, אקסון, אינטרון, אינטרגני ואנטיסנס) ומספר הגנים שה-circRNA משתרעים על פני (1 או >1) (קובץ משלים 1).הערה: CIRIquant יכול לזהות רק ארבעה סוגים של circRNA (אקסון, אינטרון, אינטרגני ואנטיסנס). CirRNA אקסון-אינטרון, הידוע גם בשם ElciRNAs, אינו ניתן לזיהוי על ידי CIRIquant.</li>
	</ol></li>
</ol>4. חיזוי האינטראקציה circRNA-miRNA באמצעות Circr
הערה: מדריך מפורט יותר כיצד להתקין ולהשתמש ב- Circr לניתוח אינטראקציה circRNA-miRNA ניתן למצוא בכתובת: https://github.com/bicciatolab/Circr 37.
<ol><li>הכנת תיקים<ol><li>פתח וחלץ את התוכן של הקובץ Circr.zip לאחר הורדתו מדף Circr GitHub באמצעות התוכנה הרלוונטית כגון "WinRar" או "7-zip" לספרייה חדשה שבה יבוצע הניתוח.</li>
		<li>התקן את יישומי התוכנה הנדרשים מראש (miRanda, RNAhybrid, Pybedtools ו- samtools) לפני ביצוע ניתוח circRNA-miRNA.</li>
		<li>גנומי ייחוס וקובצי ביאור עבור מספר אורגניזמים בעלי עניין, קובץ קואורדינטות rRNA, קובץ אינטראקציה מאומת miRNA וקבצי circBase circRNA מסופקים על ידי מחבר Circr בדף Github (https://github.com/bicciatolab/Circr)37. לאחר לחיצה על קבצי התמיכה בתיקיית הכונן, בחר את התיקיה עבור האורגניזם המעניין, תיקיית miRNA וקובץ הטקסט circBase והורד אותו.</li>
		<li>לאחר הורדת הקבצים הדרושים בשלב 4.1.3, צור ספריה חדשה בשם support_files בספריה המוזכרת בשלב 4.1.1. לאחר מכן, חלץ וחלץ את התוכן לספריית support_files .</li>
		<li>אינדקס את קובץ גנום הייחוס של האורגניזם המעניין באמצעות הפקודה samtools faidx (קובץ משלים 1).</li>
		<li>הכן קובץ קלט המורכב מהקואורדינטות של DE circRNA המעניינות בקובץ BED מופרד באמצעות טאבים, כפי שמוצג בטבלה 2. הערה: מכיוון ש- circRNA שנחזה על ידי CIRIquant אינו מבוסס 0, יש צורך במינוס 1 bp בקואורדינטת ההתחלה (כפי שהוזכר בשלב 3.1.1) לפני המרתם לתבנית BED. הכותרות המוצגות בטבלה 2 מיועדות לעיון בלבד ואינן נחוצות בקבצי BED.</li>
		<li>בשלב זה, ודא שמבנה עץ התיקיות הצפוי עבור ניתוח Circr הוא כמו באיור 2.</li>
	</ol></li>
	<li>ריצה Circr.py<ol><li>בצע Circr.py באמצעות Python 3, וכארגומנטים, ציין את קובץ הקלט circRNA, את גנום FASTA של האורגניזם המעניין, את גרסת הגנום של האורגניזם שנבחר, את מספר החוטים ואת שם קובץ הפלט בשורת הפקודה.</li>
		<li>אם האורגניזם המעניין אינו מסופק בתיקיית הכונן המפורטת בשלב 4.1.3 או אם המשתמש מעדיף לקבל קבוצה מותאמת אישית של קבצים להפעלת הניתוח, פקודות נוספות המציינות את המיקום של קבצים אלה צריכות להיכלל בעת ביצוע Circr.py.</li>
		<li>לאחר השלמת ניתוח Circr, התוכנית מפיקה קובץ אינטראקציה circRNA-miRNA בפורמט csv.</li>
		<li>סנן את תוצאות האינטראקציה circRNA-miRNA בהתאם להעדפה הספציפית למשתמש. עבור מחקר זה, התחזיות מסוננות באמצעות Rstudio על פי הקריטריונים הבאים: -זוהה על ידי כל שלושת כלי התוכנה - שני אתרי כריכה או יותר שדווחו הן על ידי Targetscan והן על ידי miRanda -מזוהה בעמודות "AGO" או "מאומת" -לסנן ללא אינטראקציות באזור הזרעים</li>
		<li>כתוב את ה- circRNA שמעביר את התנאים המסוננים משלב 4.2.3 לקובץ טקסט חדש בשם circRNA_miRNA.txt. סינון כזה יכול להגביר את הביטחון של האינטראקציות החזויות.</li>
	</ol></li>
</ol>5. בניית רשת ceRNA
הערה: מדריך מפורט כיצד להשתמש ב-Cytoscape ניתן למצוא בכתובת: http://manual.cytoscape.org/en/stable/ ו-https://github.com/cytoscape/cytoscape-tutorials/wiki#introduction
<ol><li>הורדה והכנה<ol><li>הורידו את הגרסה האחרונה של Cytoscape38 מ: https://cytoscape.org/download.html.</li>
		<li>הפעל את אשף ההתקנה שהורדת בשלב 5.1.1 ובחר את מיקום הקובץ עבור תוכנת Cytoscape.</li>
		<li>הכינו קובץ מופרד בטאבים המכיל את ה-circRNA המעניינים ואת miRNA היעד שלהם. העמודה הראשונה מורכבת משם ה-circRNA; העמודה השנייה מציינת את סוג הרנ"א מהעמודה הראשונה; העמודה השלישית היא miRNA המטרה; והעמודה הרביעית מציינת את סוג הרנ"א מהעמודה השלישית. דוגמה של הקובץ מוצגת בטבלה 3.</li>
	</ol></li>
	<li>בניית מפת רשת ceRNA<ol><li>פתח את תוכנת Cytoscape המותקנת בשלב 5.1.2.</li>
		<li>ב- Cytoscape, נווט אל File > Import > Network from File. בחר את הקובץ שהוכן בשלב 5.1.3.</li>
		<li>בכרטיסייה החדשה, בחר את העמודה הראשונה והשנייה כ"צומת מקור" ו"תכונת צומת מקור" ואילו בחר את העמודה השלישית והרביעית כ"צומת יעד" ו"תכונת צומת יעד" בהתאמה. לחץ על אישור והרשת תופיע בפינה השמאלית העליונה של Cytoscape.</li>
		<li>כדי לשנות את הסגנון החזותי של הרשת, לחץ על הלחצן Style בצד שמאל של Cytoscape.</li>
		<li>לחצו על החץ בצד ימין של 'צבע מילוי'. בחר Type עבור העמודה ו - Disdisc Mapping עבור סוג המיפוי. לאחר מכן, בחר את הצבע הרצוי עבור כל אחד מסוגי RNA.</li>
		<li>לאחר שינוי הצבע, שנה את צורת הצמתים על-ידי ניווט אל צורה וביצוע שלב 5.2.5.</li>
	</ol></li>
</ol>6. ניתוח העשרה פונקציונלית
<ol><li>ניתוח אונטולוגיה גנטית (GO) ואנציקלופדיית קיוטו לגנים וגנומים (KEGG) עבור הגן ההורי של ה-circRNA<ol><li>ודא את clusterProfiler39,40 ו- org. Hs.eg.db41 חבילות הותקנו ב-Rstudio. הארגון. חבילת Hs.eg.db41 היא חבילת ביאור כלל גנומית לבני אדם בלבד. אם האורגניזם המעניין הוא מין אחר, עיין ב: https://bioconductor.org/packages/release/BiocViews.html#OrgDb</li>
		<li>יבא את המידע DE_circRNA משלב 2.3.1 לסביבת העבודה של Rstudio.</li>
		<li>השתמש בגן ההורים של circRNA שסופק בקובץ זה לניתוח העשרה בשלבים הקרובים. עם זאת, אם המשתמש מעוניין להמיר את סמל הגן לפורמטים אחרים, כגון מזהה Entrez, השתמש בפונקציה כגון "bitr".</li>
		<li>על ידי שימוש במזהה הגן כקלט, הפעל את ניתוח העשרת GO באמצעות הפונקציה enrichGO בתוך חבילת clusterProfiler39,40 באמצעות פרמטרי ברירת מחדל.</li>
		<li>על ידי שימוש במזהה הגן כקלט, הפעל את ניתוח העשרת KEGG באמצעות הפונקציה enrichKEGG בתוך חבילת clusterProfiler39,40 באמצעות פרמטרי ברירת המחדל.</li>
	</ol></li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

כדי להמחיש את התועלת של פרוטוקול זה, RNA-seq מתאי מקרופאג אנושיים נגועים בנגיף שפעת A שימש כדוגמה. נבדקו סירקרנ"א המתפקדים כספוגי miRNA פוטנציאליים באינטראקציות פונדקאי-פתוגן והעשרה תפקודית של GO ו-KEGG בתוך פונדקאי. למרות שיש מגוון רחב של כלי circRNA זמין באינטרנט, כל אחד מהם הוא חבילה עצמאית שאינה אינטראקציה אחד עם השני. כאן, ריכזנו כמה מהכלים הדרושים לחיזוי וכימות circRNA, העשרה תפקודית circRNA, חיזוי אינטראקציה circRNA-miRNA ובניית רשת ceRNA. פרוטוקול יעיל זה חוסך זמן וניתן ליישם אותו על דגימות קליניות כדי לזהות מועמ...

אינטראקציות מארח-פתוגן מייצגות יחסי גומלין מורכבים בין הפתוגנים לבין אורגניזמים מארחים, אשר מעוררים את התגובה החיסונית המולדת של המארחים שבסופו של דבר מביאה לסילוק פתוגנים פולשים 1,2. במהלך זיהומים פתוגניים, מספר רב של גנים חיסוניים המאכסן מווסתים כדי לעכב את השכפול והשחרור של פתוגנים. לדוגמה, גנים נפוצים המעוררים אינטרפרון (ISGs) המווסתים על זיהומים פתוגניים כוללים ADAR1, IFIT1, IFIT2, IFIT3, ISG20, RIG-I ו- OASL 3,4. מלבד גנים מקודדי חלבונים, מחקרים דיווחו גם כי RNA שאינו מקודד כגון RNA ארוך שאינו מקודד (lncRNAs), microRNA (miRNAs) ו- RNA מעגלי (circRNAs) גם לשחק תפקיד והם מווסתים בו זמנית במהלך זיהומים פתוגניים 5,6,7. בניגוד לגנים מקודדי חלבונים המקודדים בעיקר חלבונים כמולקולות פונקציונליות, RNA לא מקודד (ncRNAs) ידוע כמתפקד כמווסת של גנים ברמת השעתוק ואחרי השעתוק. עם זאת, מחקרים הכוללים השתתפות של RNA לא מקודד, במיוחד circRNAs, בוויסות הגנים החיסוניים של המארחים אינם מדווחים היטב בהשוואה לגנים מקודדי החלבון.
CircRNAs מאופיינים באופן נרחב על ידי מבנה לולאה רציפה סגורה קוולנטית, אשר נוצר באמצעות תהליך שחבור לא קנוני שנקרא שחבור אחורי8. תהליך השחבור האחורי, בניגוד לתהליך השחבור של רנ"א ליניארי קוגנטי, כולל קשירה של אתר התורם במורד הזרם לאתר המקבל במעלה הזרם, ויוצר מבנה בצורת מעגל. נכון לעכשיו, הוצעו שלושה מנגנוני שחבור אחוריים שונים עבור הביוגנזה של circRNAs. אלה הם RNA binding protein (RBP) mediated circularization9,10, intron-pairing-driven circularization 11, and lariat-driven circularization12,13,14. בהתחשב בכך ש-circRNA מחוברים מקצה לקצה במבנה מעגלי, הם נוטים להיות עמידים באופן טבעי לעיכול אקסונוקלאז רגיל, ולכן נחשבים יציבים יותר מעמיתיהם הליניאריים15. מאפיין נפוץ נוסף המוצג על ידי circRNA כולל ביטוי ספציפי לסוג התא או הרקמה במארחים16.
כפי שמשתמע מהמבנה הייחודי שלהם ומהביטוי הספציפי שלהם לתא או לרקמה, התגלו כבעלי תפקידים ביולוגיים חשובים בתאים. נכון להיום, אחד התפקידים הבולטים של סירק-רנ"א הוא תפקידם כספוגי מיקרו-רנ"א (miRNA)17,18. תפקיד רגולטורי זה של circRNAs מתרחש באמצעות קשירה משלימה של נוקלאוטידים circRNA עם אזור הזרעים של miRNAs. אינטראקציה כזו של circRNA-miRNA מעכבת את תפקודי הבקרה הרגילים של miRNA על mRNA מטרה, ובכך מווסתת את ביטוי הגנים19,20. בנוסף, CirRNAs ידועים גם לווסת ביטוי גנים על ידי אינטראקציה עם חלבונים קושרי RNA (RBPs) ויצירת קומפלקסים RNA-חלבון21. למרות ש-circRNA מסווגים כ-RNA שאינו מקודד, יש גם ראיות לכך ש-circRNA יכול לשמש כתבניות לתרגום חלבונים22,23,24.
לאחרונה הודגם כי CirRNAs ממלאים תפקיד מרכזי בוויסות יחסי הגומלין בין המאכסן לפתוגן, במיוחד בין המארחים לנגיפים. באופן כללי, מניחים כי הרנ"א של הפונדקאי מסייע בוויסות התגובה החיסונית של הפונדקאי כדי לחסל את הפתוגנים הפולשים. דוגמה ל-circRNA שמקדם תגובות חיסוניות של המארח היא circRNA_0082633, שדווחה על ידי Guo et al.25. CirRNA זה משפר את איתות אינטרפרון מסוג I (IFN) בתוך תאי A549, אשר מסייע לדכא שכפול וירוס שפעת25. יתר על כן, Qu et al. דיווחו גם על CirRNA אינטרוני אנושי, הנקרא circRNA AIVR, המקדם חסינות על ידי ויסות הביטוי של חלבון קושר CREB (CREBBP), מתמר אותות של IFN-β26,27. עם זאת, קיימים גם סירק-רנ"א הידועים כמקדמים את הפתוגנזה של מחלה בעת זיהום. לדוגמה, Yu et al. דיווחו לאחרונה על התפקיד שממלא CirRNA שחבור מתחום אצבע אבץ GATA המכיל את הגן 2A (circGATAD2A) בקידום שכפול נגיף H1N1 באמצעות עיכוב של אוטופגיה של התא המארח28.
כדי לחקור ביעילות circRNAs, מיושם בדרך כלל אלגוריתם חיזוי circRNA כלל-גנומי, ואחריו אפיון בסיליקו של המועמדים החזויים ל-circRNA לפני שניתן לבצע מחקרים פונקציונליים כלשהם. גישה ביואינפורמטית כזו לחיזוי ואפיון CirRNA היא פחות יקרה ויותר חסכונית בזמן. זה עוזר לחדד את מספר המועמדים להיחקר באופן פונקציונלי ועשוי להוביל לממצאים חדשים. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט מבוסס ביואינפורמטיקה לזיהוי, אפיון וביאור פונקציונלי של circRNA במהלך אינטראקציות פונדקאי-פתוגן. הפרוטוקול כולל זיהוי וכימות של circRNA ממערכי נתונים של ריצוף RNA, ביאור באמצעות circBase, ואפיון המועמדים ל-circRNA במונחים של סוגי circRNA, מספר גנים חופפים ואינטראקציות circRNA-miRNA חזויות. מחקר זה מספק גם את הביאור הפונקציונלי של הגנים ההוריים circRNA באמצעות אונטולוגיה גנטית (GO) ואנציקלופדיה קיוטו של גנים וגנומים (KEGG) ניתוח העשרה.

<table><tbody><tr><td>Bedtools</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/arq5x/bedtools2/</td> <td>מתייחס לסעיף 4.1.2. דרוש לסירקר.</td></tr><tr><td></td><td>BWA Burrows-Wheeler Aligner</td><td>http://bio-bwa.sourceforge.net/</td> <td>מתייחס לסעיף 2.1.1 ו-2.1.2. דרוש להריץ את CIRIquant, ולאנדקס את הגנום</td></tr><tr><td>Circr</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/bicciatolab/Circr</td><td>בהתייחס לסעיף 4. השתמש כדי לחזות את אתרי קשירת ה-miRNA</td></tr><tr><td>CIRIquant</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/bioinfo-biols/CIRIquant</td><td>בהתייחס לסעיף 2.1.3. כדי לחזות circRNAs</td></tr><tr><td>Clusterprofiler</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/YuLab-SMU/clusterProfiler</td><td>בהתייחס לסעיף 7. להעשרה פונקציונלית של GO ו-KEGG</td></tr><tr><td>מעבד</td><td>Intel</td><td>&nbsp; מעבד Intel(R) Xeon(R) E5-2620 v2 @ 2.10 GHz&nbsp; &nbsp; ליבות: מעבד 6 ליבות זיכרון: 65 ג'יגה-בייט כרטיס מסך: NVIDIA GK107GL (QUADRO K2000)&nbsp;</td><td>מפרטים המשמשים להפעלת פרוטוקול זה כולו.</td></tr><tr><td>Cytoscape</td><td>Cytoscape</td><td>https://cytoscape.org/download.html</td><td>בהתייחס לסעיף 5.2. דרוש כדי לשרטט רשת ceRNA</td></tr><tr><td>FastQC</td><td>Babraham Bioinformatics</td><td>https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/</td> <td>מתייחס לסעיף 1.2.1. בדיקת איכות בקבצי Fastq</td></tr><tr><td>HISAT2</td><td></td><td>http://daehwankimlab.github.io/hisat2/</td> <td>בהתייחס לסעיף 2.1.1 ו- 2.1.2. דרוש כדי להריץ את CIRIquant, וכדי להוסיף לאינדקס את הגנום</td></tr><tr><td>לינוקס</td><td>אובונטו 20.04.5 LTS (Focal Fossa)</td> <td>https://releases.ubuntu.com/focal/</td> <td>דרוש כדי להריץ את הפרוטוקול כולו. גרסאות אחרות של אובונטו עשויות עדיין להיות תקפות לביצוע הפרוטוקול.</td></tr><tr><td>miRanda</td><td></td><td>http://www.microrna.org/microrna/getDownloads.do</td><td>מתייחס לסעיף 4.1.2. דרוש עבור Circr</td></tr><tr><td>Pybedtools pybedtools</td><td>0.8.2</td><td>https://pypi.org/project/pybedtools/</td> <td>דרוש למניפולציה גנומית של קובץ BED</td></tr><tr><td>Python</td><td>Python 2.7 ו-3.6 או abover</td><td>https://www.python.org/downloads/</td> <td>להפעלת מודולי הספרייה הדרושים</td></tr><tr><td>R</td><td>רשת הארכיון המקיפה R https://cran.r-project.org/</td><td></td> <td>למניפולציה של מסגרות נתונים</td></tr><tr><td>RNAhybrid</td><td>BiBiServ</td><td>https://bibiserv.cebitec.uni-bielefeld.de/rnahybrid</td><td>מתייחס לסעיף 4.1.2. דרוש לסביבת עבודה של Circr</td></tr><tr><td>RStudio</td><td>RStudio</td><td>https://www.rstudio.com/</td> <td>A להפעלת R</td></tr><tr><td>samtools&nbsp;</td><td>SAMtools</td><td>http://www.htslib.org/</td> <td>מתייחס לסעיף 2.1.2. דרוש להפעלת CIRIquant</td></tr><tr><td>StringTie</td><td>אוניברסיטת ג'ונס הופקינס: המרכז לביולוגיה חישובית</td><td>http://ccb.jhu.edu/software/stringtie/index.shtml</td><td>בהתייחס לסעיף 2.1.2. דרוש כדי להפעיל את CIRIquant</td></tr><tr><td>TargetScan</td><td>GitHub</td><td>https://github.com/nsoranzo/targetscan</td><td>בהתייחס לסעיף 4.1.2. דרוש ל-Circr</td></tr></tbody></table>

ב silico זיהוי ואפיון של circrnas במהלך אינטראקציות פונדקאי-פתוגן

In Silico Identification and Characterization of circRNAs During Host-Pathogen Interactions

רנ"א מעגלי (circRNAs) הוא סוג של רנ"א לא מקודד שנוצר באמצעות שחבור אחורי. מעגלי רנ"א אלה נחקרים בעיקר בשל תפקידם כרגולטורים של תהליכים ביולוגיים שונים. יש לציין כי ראיות חדשות מוכיחות כי CirRNA מארח יכול לבוא לידי ביטוי באופן דיפרנציאלי (DE) בעת הדבקה בפתוגנים (למשל, שפעת ווירוסי קורונה), דבר המצביע על תפקיד של circRNA בוויסות תגובות החיסון המולד של המארח. עם זאת, חקירות על תפקידם של circRNAs במהלך זיהומים פתוגניים מוגבלות על ידי הידע והמיומנויות הדרושים לביצוע הניתוח הביואינפורמטי הדרוש לזיהוי DE circRNAs מנתוני ריצוף RNA (RNA-seq). חיזוי וזיהוי ביואינפורמטיקה של circRNA הוא חיוני לפני כל אימות, ומחקרים פונקציונליים המשתמשים בטכניקות מעבדה רטובות יקרות וגוזלות זמן. כדי לפתור בעיה זו, פרוטוקול שלב אחר שלב של חיזוי סיליקו ואפיון של circRNAs באמצעות נתוני RNA-seq מסופק בכתב יד זה. ניתן לחלק את הפרוטוקול לארבעה שלבים: 1) חיזוי וכימות של DE circRNA באמצעות צינור CIRIquant; 2) ביאור באמצעות circBase ואפיון של DE circRNAs; 3) חיזוי אינטראקציה CircRNA-miRNA דרך צינור Circr; 4) ניתוח העשרה פונקציונלית של גנים הוריים circRNA באמצעות אונטולוגיה גנטית (GO) ואנציקלופדיה קיוטו של גנים וגנומים (KEGG). צינור זה יהיה שימושי בהנעת מחקר עתידי במבחנה ו-in vivo כדי לפענח עוד יותר את התפקיד של circRNA באינטראקציות מארח-פתוגן.

הפרוטוקול שגויס בסעיף הקודם שונה והוגדר כך שיתאים למערכת ההפעלה לינוקס. הסיבה העיקרית היא שרוב ספריות המודולים והחבילות המעורבות בניתוח circRNAs יכולות לעבוד רק על פלטפורמת לינוקס. בניתוח זה, מערכי נתונים של ספריית RNA-seq ריבוזומלית (rRNA)-מדולדלת RNA-seq שהוכנו מתאי המקרופאגים האנושיים הנגועים בנגיף שפעת A הורדו ממסד הנתוניםGEO 42 ושימשו ליצירת התוצאות המייצגות.
חיזוי וכימות CircRNA בניתוח זה, מערכי נתונים של ספריית RNA-seq ריבוזומלית (rRNA) שהוכנו...

הפרוטוקול המוגש כאן מסביר את צנרת הסיליקו המלאה הדרושה לחיזוי ולאפיון פונקציונלי של CirRNAs מנתוני שעתוק ריצוף RNA החוקרים אינטראקציות מארח-פתוגן.

ב Silico זיהוי ואפיון של circRNAs במהלך אינטראקציות פונדקאי-פתוגן

Circular RNAs (circRNAs) are a class of non-coding RNAs that are formed via back-splicing. These circRNAs are predominantly studied for their roles as ...

רנ"א מעגלי ממלא תפקידי בקרה חשובים בתהליכים ביולוגיים שונים. פרוטוקול זה מתאים למתחילים לבצע ניתוח RNA מעגלי בתחום אינטראקציות מארח ופתוגן. כאן הרכבנו כמה מהכלים היוצרים פרוטוקול יעיל הנדרש לחיזוי וכימות RNA מאובטח, העשרה תפקודית מאובטחת של RNA, RNA מאובטח, חיזוי אינטראקציה של מיקרו-RNA ומבני רשת RNA CCE.פרוטוקול ייעול זה יכול להיות מיושם על דגימות קליניות כדי לזהות מועמדים מסוימים, ערכים אבחוניים ופרוגנוסטיים בסביבה של אינטראקציה מארחת ופתוגן. אני מצפה מאלה שאין להם ידע קודם בתכנות להתקשות בשלב הראשוני של טכניקה זו. לכן, הייתי ממליץ ללמוד את היסודות של שפות התכנות המשמשות בטכניקה זו.אני מאמין שבדרך כלל להסתכל על איך שפת התכנות מיושמת כדי להיות אינפורמטיבי יותר וקל יותר להבנה בהשוואה לקריאה בלבד. כדי להתחיל, פתח מסוף לינוקס ובספרייה של גנום הייחוס של המארח בצע את הפקודות bwa index ו- hisat2-build כדי לאנדקס את הגנום. הכן קובץ תצורת yml הכולל את שם הקובץ, נתיב הכלים, הנתיב לקובצי העזר שהורדו והנתיב לקובצי האינדקס.ציין את סוג הספרייה של נתוני רצף RNA והפעל את הכלי Ciriquant באמצעות ברירת המחדל או הפרמטרים הידניים. הכינו קובץ טקסט עם רשימת נתונים המכילה את המזהים של נתוני רצף הרנ"א, את הנתיב לקובצי GTF שהופקו על ידי Ciriquant ואת קיבוץ נתוני רצף הרנ"א בין אם מדובר בקבוצת ביקורת או בקבוצה מטופלת. במסוף Linux, הפעל prep_Ciriquant עם קובץ טקסט מוכן כקלט.הפעלה זו תיצור רשימה של קבצים. הכן קובץ טקסט שני עם רשימת נתונים המכילה את מזהי רצף הרנ"א ואת הנתיב לפלט קשר המחרוזת המתאים שלהם. פריסת הקובץ חייבת להיות דומה לקובץ הטקסט שהוכן קודם לכן ללא הפעלת עמודת הקיבוץ.הפעל הכנה. PY עם קובץ טקסט זה כקלט ליצירת קבצי מטריצת ספירת הגנים. בצע Ciri_DE_Replicate עם library_info.CSV, circRNA_BSJ. CSV ו- gene_count_matrix. קובצי CSV כקלט להפקת circRNA_DE הסופי.קובץ TSV. כדי לסנן ולקבוע את מספר ה- circRNA המבוטאים באופן דיפרנציאלי, או DE, פתח את circRNA_DE. קובץ tsv עם R או כל תוכנת גיליון אלקטרוני אחרת.חלץ וחלץ את התוכן של קובץ CircR לאחר הורדתו מדף CircR GitHub באמצעות התוכנה הרלוונטית, כגון WinRar או 7-Zip. לתוך ספרייה חדשה שבה הניתוח יתבצע. לאחר מכן התקן את יישומי התוכנה הנדרשים מראש כגון SAMTools, miRanda, RNAhybrid ו- Pybedtools לפני ביצוע ניתוח miRNA circRNA.אינדקס את קובץ גנום הייחוס של האורגניזם המעניין באמצעות הפקודה SAMtools FAIDX והכן קובץ קלט המורכב מהקואורדינטות של DE circRNA של עניין בקובץ מיטה מופרד בטאב. לאחר מכן, בצע Circr. py באמצעות Python3.וכאשר הארגומנטים מציינים את קובץ הקלט circRNA, את הגנום המהיר יותר של האורגניזם המעניין, את גרסת הגנום של האורגניזם שנבחר, את מספר החוטים ואת שם קובץ הפלט בשורת הפקודה. לאחר השלמת ניתוח Circr, התוכנית מפיקה קובץ אינטראקציה circRNA-miRNA בפורמט CSV. הכינו קובץ מופרד בטאבים המכיל את ה-circRNA המעניינים אותם ואת miRNA היעד שלהם.העמודה הראשונה מורכבת משם ה-circRNA. העמודה השנייה מציינת את סוג הרנ"א מהעמודה הראשונה. העמודה השלישית היא miRNA המטרה.והעמודה הרביעית מציינת את סוג הרנ"א מהעמודה השלישית. כדי לבנות את מפת הרשת ceRNA, פתח את תוכנת Cytoscape, נווט לקובץ, ייבא, רשת מקובץ, בחר את הקובץ המוכן והעלה אותו. לחץ על לחצן הסגנון כדי לשנות את הסגנון החזותי של הרשת.לאחר מכן לחץ על החץ בצד ימין של צבע המילוי, בחר סוג עבור העמודה, מיפוי בדיד עבור סוג המיפוי ובחר את הצבע הרצוי עבור כל סוג RNA. לאחר מכן, נווט אל צורה כדי לשנות את צורת הצמתים ובצע את השלבים שהוצגו קודם לכן. עבור אונטולוגיה גנטית וניתוח KEGG של הגן ההורי של circRNAs, ודא את פרופיל הצביר ואת הארגון. Hs.eg.חבילות DB הותקנו בסטודיו שלנו. ייבא את מידע DE circRNA לסביבת העבודה של סטודיו R. אם המשתמש מעוניין להמיר את שמות הגנים של ההורים לפורמטים אחרים, כגון entrezid, השתמש בפונקציה כגון bidder.השתמש במזהה הגן כקלט והפעל את האונטולוגיה הגנטית וניתוח ההעשרה באמצעות הפונקציה enrichGO בתוך פרופיל האשכול או החבילה באמצעות פרמטרי ברירת מחדל. לבסוף, הפעל את ניתוח העשרת KEGG באמצעות מזהה הגן כקלט והפונקציה enrichKEGG בתוך חבילת פרופילי האשכול. תרשים הבועה של ניתוח העשרה אונטולוגית גנטית של גנים הוריים מסוג DE circRNA מוצג באיור זה.יחס הגנים על ציר x הוא מספר הגנים באותה רשימת קלט המשויכים למונח אונטולוגי גנים נתון חלקי המספר הכולל של גנים באותו מונח. גודל הנקודה בתרשים מיוצג על ידי ערך הספירה שהוא מספר הגנים ברשימת הקלט המשויכים למונח אונטולוגי גנים נתון. ככל שהנקודות גדולות יותר, כך גדל מספר גני הקלט הקשורים למונח.הנקודות בתרשים מקודדות בצבע בהתבסס על הערך המחושב על ידי השוואת התדירות הנצפית של מונח ביאור לתדירות הצפויה במקרה. ההעשרה מובהקת סטטיסטית ומשורטט על חלקת הבועה רק אם הערך קטן מ-0.01. כאן, שלוש ההעשרה המובילות לתהליכים הביולוגיים כוללות את הביוגנזה של קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין, התגובה לנגיף וויסות התגובה לגירוי ביוטי.בעוד שעבור הפונקציות המולקולריות, רק הפעילות הקטליטית הפועלת על RNA וקשירת RNA חד-גדילי מועשרת סטטיסטית. עבור הרכיבים התאיים, רק קומפלקס הרטרומר מועשר סטטיסטית. תמונה מייצגת זו מציגה את ניתוח העשרת KEGG של הגנים ההוריים DE circRNA בתרשים בועה.רק שני מונחי KEGG הועשרו במקרה זה, שפעת A ומסלולי מחזור החיים הנגיפי. אחד הדברים החשובים ביותר בעת ניסיון הליך זה הוא לוודא את סוג התכונה הנכון של מערך הנתונים של מעגל RNA שבו אתה משתמש בעת פציעת ריצה אחת. הצינור הביו-פורמטי המסופק כאן מסייע בחיזוי הרנ"א החילוני הפוטנציאלי והביאורים הפונקציונליים.עם זאת, עדיין יהיה צורך באימות מובל היטב כדי לספק ראיות מוצקות. פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לגלות רנ"א מאובטח ואת תפקידיהם הפונקציונליים הפוטנציאליים בקודים השונים ובאינטראקציות הפתוגנים, שאותם יוכלו להמשיך לחקור.

in-silico-identification-characterization-circrnas-during-host

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

Source: Mateer, E., et al., Confocal Imaging of Double-Stranded RNA and Pattern Recognition Receptors in Negative-Sense RNA Virus Infection. J. Vis. Exp. (2019)This video demonstrates the confocal imaging of viral double-stranded RNA (dsRNA) and cytoplasmic pattern recognition receptors (PRRs) in virus-infected epithelial cells. It highlights how antibody-based fluorescent labeling reveals the interaction between viral replication intermediates and host immune sensors.

Visualization of Viral Double-Stranded RNA and Host Pattern Recognition Receptors in Infected Epithelial Cells

מאמר זה מתמקד בזיהוי של מערכי נתונים אינטראקציה גבוה בין המארח בטוח וחלבוני הפתוגן באמצעות שילוב של שתי שיטות מאונך: שמרים שני היברידיים ואחרי assay אינטראקציה תפוקה גבוהה בתאי יונקים הנקרא HT-GPCA.

גישה השוואתית כדי לאפיין את הנוף של אינטראקציות בין חלבונים מאכסן לפתוגן

פיתחנו פרוטוקול מהיר, רגיש וניתן לשחזור לפרופיל ביטוי גנים פתוגני במהלך זיהום.

פרופיל ביטוי גנים של חיידקים הדבקה באמצעות פלטפורמה דיגיטלית ברקוד

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים כדי לזהות immunomodulators 1) וירוס מקודד המקדמים arbovirus השכפול וגורמים מארח 2) האיקריוטים שמגבילות את שכפול arbovirus. שיטות אלה פלורסצנטיות הפריה חוץ גופית מבוססות מאפשרים להשיג במהירות את המפרט כמותית של שכפול arbovirus ב מבחני פשטני עם יחס אות לרעש נמוך.

זיהומים arbovirus כמו כלים ההקרנה לצורך זיהוי גורמים אנטי ויראלי Immunomodulators ומנחה

אנו מתארים שני מבחני במבחנה, ויוו זיהום זה יכול לשמש כדי לנתח את פעילותם של גורמי קידוד המארח.

שימוש פתוגן חיידקי כדי בדיקה עבור הסלולר והמארח אורגניזם ברמת התגובות

RNAs מעגלית (circRNAs) הם RNAs שאינם מצפינה לקידוד שעשויים להיות בעלי תפקידים ברגולציה ובניהול אינטראקציות מדיה בין חלבונים. בעקבות הערכה של פרמטרים שונים לבניית ספריות רצף circRNA, פרוטוקול הושלם באמצעות הכנה נטוש הכולל הספריה RNA עם RNase R טרום טיפול והוא מוצג כאן.

זיהוי של RNAs מעגלית באמצעות רצפי RNA

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לפרופיל יחסי הגומלין בין מארח לפתוגן במהלך זיהום על ידי פרוטאומיקה מבוססת ספקטרומטריה המונית. פרוטוקול זה משתמש כימות ללא תווית כדי למדוד שינויים בשפע החלבון של המארח (למשל, מקרופאגים) ופתוגן (למשל, Cryptococcus neoformans) בניסוי אחד.

זרימת עבודה פרוטאומית כמותית ללא תוויות עבור אינטראקציות מארח-פתוגן מונחות גילוי

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר צינור שלם לניתוח נתוני תמלול ריצוף RNA מקריאות גולמיות לניתוח פונקציונלי, כולל בקרת איכות וצעדי עיבוד מראש לגישות אנליטיות סטטיסטיות מתקדמות.

ניתוח תמלול תפוקה גבוהה לחקירת אינטראקציות בין מארח לפתוגן

זיהוי של אינטראקציות פתוגן מארח-חיידקי המבוסס על דבקות פנוטיפית באמצעות הדמיית תיוג פלואורסצנטית בעלת תפוקה גבוהה יחד עם שיטות ניתוח סטטיסטיות אוטומטיות מאפשר הערכה מהירה של אינטראקציות חיידקיות פוטנציאליות עם תאים מארחים.

זיהוי אוטומטי בעל תפוקה גבוהה של דבקות חיידקית בתאים מארחים

חיידקי מעיים, כולל חיידקים חוץ-תאיים ופתוגנים תוך-תאיים כמו נגיף אורסיי ומיקרוספורידיה (פטריות), קשורים לעתים קרובות לנמטודות פראיות של Caenorhabditis . מאמר זה מציג פרוטוקול לאיתור וכימות מיקרובים המאכלסים ו/או מדביקים נמטודות C. elegans , ולמדידת עומס פתוגנים לאחר זיהומים מבוקרים במעבדה.

RNA פלואורסצנטי באתרו הכלאה (FISH) כדי לדמיין התיישבות מיקרוביאלית וזיהום במעיים Caenorhabditis elegans

אנטרואידים מתגלים כמודל חדשני לחקר פיזיולוגיה ופתופיזיולוגיה של רקמות, פיתוח תרופות ורפואה רגנרטיבית. כאן, אנו מתארים מערכת תרבית דו-ממדית ממקור אנטרואידים של תאים ראשוניים בקר, המאפשרת תרבית משותפת עם סוגי תאי רקמה רלוונטיים. מודל זה מציע יתרון תרגומי למודלים של מחקר במערכת העיכול.

יצירת מערכת תרבית חד-שכבתית דו-ממדית ראשונית שמקורה באנטרואיד בקר ליישומים במחקר ביו-רפואי תרגומי

חקור זיהוי ואפיון של circRNAs במהלך אינטראקציות פונדקאי-פתוגן באמצעות צינור עיבוד נתונים in silico. פרוטוקול זה מסייע לחוקרים לזהות מועמדים קליניים בעלי ערך אבחנתי ופרוגנוסטי.

ב Silico זיהוי ואפיון של circRNAs במהלך אינטראקציות פונדקאי-פתוגן

גלה סרטונים נוספים