ב Silico זיהוי ואפיון של circRNAs במהלך אינטראקציות פונדקאי-פתוגן

רנ"א מעגלי ממלא תפקידי בקרה חשובים בתהליכים ביולוגיים שונים. פרוטוקול זה מתאים למתחילים לבצע ניתוח RNA מעגלי בתחום אינטראקציות מארח ופתוגן. כאן הרכבנו כמה מהכלים היוצרים פרוטוקול יעיל הנדרש לחיזוי וכימות RNA מאובטח, העשרה תפקודית מאובטחת של RNA, RNA מאובטח, חיזוי אינטראקציה של מיקרו-RNA ומבני רשת RNA CCE.

פרוטוקול ייעול זה יכול להיות מיושם על דגימות קליניות כדי לזהות מועמדים מסוימים, ערכים אבחוניים ופרוגנוסטיים בסביבה של אינטראקציה מארחת ופתוגן. אני מצפה מאלה שאין להם ידע קודם בתכנות להתקשות בשלב הראשוני של טכניקה זו. לכן, הייתי ממליץ ללמוד את היסודות של שפות התכנות המשמשות בטכניקה זו.

אני מאמין שבדרך כלל להסתכל על איך שפת התכנות מיושמת כדי להיות אינפורמטיבי יותר וקל יותר להבנה בהשוואה לקריאה בלבד. כדי להתחיל, פתח מסוף לינוקס ובספרייה של גנום הייחוס של המארח בצע את הפקודות bwa index ו- hisat2-build כדי לאנדקס את הגנום. הכן קובץ תצורת yml הכולל את שם הקובץ, נתיב הכלים, הנתיב לקובצי העזר שהורדו והנתיב לקובצי האינדקס.

ציין את סוג הספרייה של נתוני רצף RNA והפעל את הכלי Ciriquant באמצעות ברירת המחדל או הפרמטרים הידניים. הכינו קובץ טקסט עם רשימת נתונים המכילה את המזהים של נתוני רצף הרנ"א, את הנתיב לקובצי GTF שהופקו על ידי Ciriquant ואת קיבוץ נתוני רצף הרנ"א בין אם מדובר בקבוצת ביקורת או בקבוצה מטופלת. במסוף Linux, הפעל prep_Ciriquant עם קובץ טקסט מוכן כקלט.

הפעלה זו תיצור רשימה של קבצים. הכן קובץ טקסט שני עם רשימת נתונים המכילה את מזהי רצף הרנ"א ואת הנתיב לפלט קשר המחרוזת המתאים שלהם. פריסת הקובץ חייבת להיות דומה לקובץ הטקסט שהוכן קודם לכן ללא הפעלת עמודת הקיבוץ.

הפעל הכנה. PY עם קובץ טקסט זה כקלט ליצירת קבצי מטריצת ספירת הגנים. בצע Ciri_DE_Replicate עם library_info.

CSV, circRNA_BSJ. CSV ו- gene_count_matrix. קובצי CSV כקלט להפקת circRNA_DE הסופי.

קובץ TSV. כדי לסנן ולקבוע את מספר ה- circRNA המבוטאים באופן דיפרנציאלי, או DE, פתח את circRNA_DE. קובץ tsv עם R או כל תוכנת גיליון אלקטרוני אחרת.

חלץ וחלץ את התוכן של קובץ CircR לאחר הורדתו מדף CircR GitHub באמצעות התוכנה הרלוונטית, כגון WinRar או 7-Zip. לתוך ספרייה חדשה שבה הניתוח יתבצע. לאחר מכן התקן את יישומי התוכנה הנדרשים מראש כגון SAMTools, miRanda, RNAhybrid ו- Pybedtools לפני ביצוע ניתוח miRNA circRNA.

אינדקס את קובץ גנום הייחוס של האורגניזם המעניין באמצעות הפקודה SAMtools FAIDX והכן קובץ קלט המורכב מהקואורדינטות של DE circRNA של עניין בקובץ מיטה מופרד בטאב. לאחר מכן, בצע Circr. py באמצעות Python3.

וכאשר הארגומנטים מציינים את קובץ הקלט circRNA, את הגנום המהיר יותר של האורגניזם המעניין, את גרסת הגנום של האורגניזם שנבחר, את מספר החוטים ואת שם קובץ הפלט בשורת הפקודה. לאחר השלמת ניתוח Circr, התוכנית מפיקה קובץ אינטראקציה circRNA-miRNA בפורמט CSV. הכינו קובץ מופרד בטאבים המכיל את ה-circRNA המעניינים אותם ואת miRNA היעד שלהם.

העמודה הראשונה מורכבת משם ה-circRNA. העמודה השנייה מציינת את סוג הרנ"א מהעמודה הראשונה. העמודה השלישית היא miRNA המטרה.

והעמודה הרביעית מציינת את סוג הרנ"א מהעמודה השלישית. כדי לבנות את מפת הרשת ceRNA, פתח את תוכנת Cytoscape, נווט לקובץ, ייבא, רשת מקובץ, בחר את הקובץ המוכן והעלה אותו. לחץ על לחצן הסגנון כדי לשנות את הסגנון החזותי של הרשת.

לאחר מכן לחץ על החץ בצד ימין של צבע המילוי, בחר סוג עבור העמודה, מיפוי בדיד עבור סוג המיפוי ובחר את הצבע הרצוי עבור כל סוג RNA. לאחר מכן, נווט אל צורה כדי לשנות את צורת הצמתים ובצע את השלבים שהוצגו קודם לכן. עבור אונטולוגיה גנטית וניתוח KEGG של הגן ההורי של circRNAs, ודא את פרופיל הצביר ואת הארגון. Hs.eg.

חבילות DB הותקנו בסטודיו שלנו. ייבא את מידע DE circRNA לסביבת העבודה של סטודיו R. אם המשתמש מעוניין להמיר את שמות הגנים של ההורים לפורמטים אחרים, כגון entrezid, השתמש בפונקציה כגון bidder.

השתמש במזהה הגן כקלט והפעל את האונטולוגיה הגנטית וניתוח ההעשרה באמצעות הפונקציה enrichGO בתוך פרופיל האשכול או החבילה באמצעות פרמטרי ברירת מחדל. לבסוף, הפעל את ניתוח העשרת KEGG באמצעות מזהה הגן כקלט והפונקציה enrichKEGG בתוך חבילת פרופילי האשכול. תרשים הבועה של ניתוח העשרה אונטולוגית גנטית של גנים הוריים מסוג DE circRNA מוצג באיור זה.

יחס הגנים על ציר x הוא מספר הגנים באותה רשימת קלט המשויכים למונח אונטולוגי גנים נתון חלקי המספר הכולל של גנים באותו מונח. גודל הנקודה בתרשים מיוצג על ידי ערך הספירה שהוא מספר הגנים ברשימת הקלט המשויכים למונח אונטולוגי גנים נתון. ככל שהנקודות גדולות יותר, כך גדל מספר גני הקלט הקשורים למונח.

הנקודות בתרשים מקודדות בצבע בהתבסס על הערך המחושב על ידי השוואת התדירות הנצפית של מונח ביאור לתדירות הצפויה במקרה. ההעשרה מובהקת סטטיסטית ומשורטט על חלקת הבועה רק אם הערך קטן מ-0.01. כאן, שלוש ההעשרה המובילות לתהליכים הביולוגיים כוללות את הביוגנזה של קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין, התגובה לנגיף וויסות התגובה לגירוי ביוטי.

בעוד שעבור הפונקציות המולקולריות, רק הפעילות הקטליטית הפועלת על RNA וקשירת RNA חד-גדילי מועשרת סטטיסטית. עבור הרכיבים התאיים, רק קומפלקס הרטרומר מועשר סטטיסטית. תמונה מייצגת זו מציגה את ניתוח העשרת KEGG של הגנים ההוריים DE circRNA בתרשים בועה.

רק שני מונחי KEGG הועשרו במקרה זה, שפעת A ומסלולי מחזור החיים הנגיפי. אחד הדברים החשובים ביותר בעת ניסיון הליך זה הוא לוודא את סוג התכונה הנכון של מערך הנתונים של מעגל RNA שבו אתה משתמש בעת פציעת ריצה אחת. הצינור הביו-פורמטי המסופק כאן מסייע בחיזוי הרנ"א החילוני הפוטנציאלי והביאורים הפונקציונליים.

עם זאת, עדיין יהיה צורך באימות מובל היטב כדי לספק ראיות מוצקות. פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לגלות רנ"א מאובטח ואת תפקידיהם הפונקציונליים הפוטנציאליים בקודים השונים ובאינטראקציות הפתוגנים, שאותם יוכלו להמשיך לחקור.