ניתוח בזמן אמת של ביואנרגטיקה בתאי אפיתל פיגמנט רשתית ראשוניים בבני אדם באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה

המצב המטבולי של תאי אפיתל פיגמנט ברשתית האנושית (H-RPE) משקף את בריאותם ותפקודם. מוצג כאן פרוטוקול אופטימלי לבחינת שטף מטבולי בזמן אמת של H-RPE באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

חקירת פרופילים ביו-אנרגטיים בזמן אמת של אוקספוס וגליקוליזה מתגלה כגורם מפתח באפיון הבריאות והתפקוד של RPE. ספירומטריה ברזולוציה גבוהה מאפשרת דרך יעילה להשוות את המצב המטבולי של RPE תקין וחולה. לטכניקה זו יש את היתרון של חקירה בו זמנית של אוקספוס וגליקוליזה באמצעות מדידת קצב צריכת החמצן, OCR וקצב החמצה חוץ-תאית, ECAR.

תאי RPE הם תאים פעילים מאוד מבחינה מטבולית והם אחד התאים הראשונים שהתנוונו במהלך AMD. הבנת התפקוד המטבולי והמיטוכונדריאלי שלהם, מאפשרת לפתח תרופות חדשניות. כדי להתחיל, להוסיף 100 מיקרוליטר לכל באר של תרחיף התא בתווך RPE האנושי לריכוז סופי של 20, 000 תאים לכל 100 מיקרוליטר בכל באר.

והקפידו להשאיר את ארבע הבארות הפינתיות ריקות. פיפטה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח תרחיף תאים הומוגני, באמצעות פיפטה רב ערוצית לקלות ועקביות. הוסף 100 מיקרוליטר של מדיה רק לארבע בארות פינתיות ריקות לתיקון רקע.

השאירו את צלחת תרבית התאים בטמפרטורת החדר למשך שעה כדי לסייע במזעור השפעות הקצה. לאחר מכן הכניסו אותו לאינקובטור עם 5% פחמן דו חמצני 37 מעלות צלזיוס ולח. לאחר הדגירה הלילית, בדקו את התאים תחת המיקרוסקופ כדי לבדוק את המורפולוגיה שלהם ואת רמת הפיגמנטציה שלהם לפני שינוי המדיה.

בימי הבדיקה הבאים, יש לוודא שהתאים נמצאים במפגש עם מורפולוגיה אופיינית דמוית אבן מרוצפת ולרכוש פיגמנטציה לאורך זמן. כדי להבטיח את ההידרציה של מחסנית החיישן יום לפני הבדיקה, מלא כל באר של צלחת השירות עם 200 מיקרוליטר של מים deionized והנח את מחסנית החיישן, שקוע במים על צלחת השירות. יש לשמור כ-20 מיליליטר של תמיסת הכיול למשך הלילה בתנור לח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ללא פחמן דו-חמצני.

הפעל את מכשיר הספירומטריה ברזולוציה גבוהה והפעל את התוכנה כדי לאפשר למכשיר להתייצב על 37 מעלות צלזיוס בן לילה. ביום הבדיקה, החלף את המים בלוחית השירות בנפח שווה של תמיסה מחוממת לפחות 45 דקות לפני הפעלת הבדיקה. חממו 25 מיליליטר של מדיית בדיקת המאמץ המוכנה של מיטו ללא פנול אדום עד 37 מעלות צלזיוס וסננו ואקום את המדיה המותאמת pH 7.4, באמצעות יחידת סינון עליונה של הצינור.

הסר את מדיית RPE האנושית מצלחת תרבית התאים והוסף 100 מיקרוליטר של מדיית בדיקה טרייה. לאחר מכן מניחים את צלחת תרבית התאים בתנור לחות של 37 מעלות צלזיוס ללא פחמן דו חמצני למשך שעה לפני תחילת הבדיקה. לכל מחסנית חיישן יש ארבע יציאות משלוח ריאגנטים לכל באר להזרקת תרכובות הבדיקה לבארות לוחות תרבית תאים במהלך הבדיקה.

הכינו שלושה מיליליטר של תמיסות התרופות Tenex כל אחת, על ידי דילול מלאי התרופות במדיית הבדיקה שלהם. לאחר מכן, פיפטה 20 מיקרוליטר של מלאי התרופות Tenex לתוך פורט A, 22 מיקרוליטר לתוך פורט B ו 25 מיקרוליטר לתוך פורט C כדי להשיג את ריכוז התרופה הסופי שצוין בכל באר. לאחר מכן בתוכנת הניתוח, פתח את הכרטיסייה תבניות, בחר מבחן מאמץ מיטו ומלא את הגדרות הקבוצה.

הזן פרטים על אסטרטגיית ההזרקה עבור תרופות מבחן המאמץ Mito. לאחר מכן הזן פרטים על קבוצות הניסוי השונות בבדיקה לצורך בקרה או טיפול. הזן פרטים על מדיית הבדיקה להוספת תוספים שונים והריכוזים הספציפיים שלהם למדיית הבדיקה הבסיסית.

ולבסוף, הוסף את סוג התא. לחץ על הכרטיסייה הבאה ולאחר מכן על מפת לוחות כדי להקצות קבוצות שונות תחת בדיקה למיקום הספציפי שלהם על צלחת באר 96. עם השלמת מפת הלוחות, לחץ על כרטיסיית הפרוטוקול כדי לסקור את פרוטוקול המכשיר עבור פרוטוקול בדיקת המאמץ של Mito המוגדר כברירת מחדל.

לאחר מכן לחץ על הפעל את הבדיקה והכנס את מחסנית החיישן, השקועה בתמיסת הכיול בלוח השירות לכיול. תהליך זה אורך כ-25 דקות וכל ביו-חיישן מכויל באופן עצמאי, בהתבסס על תפוקת החיישן הנמדדת בתמיסת הכיול של רמת החומציות וריכוז החמצן הידועים. עם השלמת הכיול, הסר את צלחת השירות והכנס את צלחת תרבית התא.

לאחר המדידה הבסיסית, המכשיר מזריק באופן אוטומטי את תמיסת התרופה Port A לכל באר אשר עוקבת אחר שלוש לולאות של ערבוב ומדידה, שלוש דקות כל אחת. אותו דפוס מתרחש לאחר כל הזרקת תרופה עוקבת ביציאות האחרות. לאחר השלמת ההפעלה, הסר את לוחית תרבית התאים ואת מחסנית החיישן.

למטרות בקרת איכות, ודא שכל יציאות התרופות ומחסנית החיישן הוזרקו על ידי בדיקת היציאות ללא שרידי תרופה. לאחר מכן, בחנו את התאים במיקרו-צלחת של תרבית התאים מתחת למיקרוסקופ כדי להבטיח את החד-שכבה האחידה של התאים. לאחר מכן השליכו את מדיית הבדיקה והחליפו אותה ב-60 מיקרוליטר של חיץ x ליזיס אחד בכל באר.

עטפו את שולי הצלחת בפרפילם כדי למנוע אידוי, והכניסו אותה למקפיא של מינוס 80 מעלות צלזיוס כדי לסייע בליזה התאית לילה לפני כימות תכולת החלבון, באמצעות בדיקת BCA. לפי ניתוח נתונים, נרמלו את כל הנתונים על ידי חלוקת קצב צריכת החמצן או OCR וקצב החמצה חוץ-תאי או ערכי ECAR במיקרוגרמים של חלבון בכל באר. לאחר מכן יצא את מחולל דוחות בדיקת המאמץ של Mito, המשתמש בפקודות מאקרו של Excel כדי לחשב באופן אוטומטי את פרמטרי בדיקת המאמץ של Mito באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים.

על ידי ביצוע אותם שלבים כפי שהודגם עבור מבחן המאמץ מיטו, ניתן לבצע את מבחן המאמץ הגליקוליטי, למעט תוספי המדיה של הבדיקה וזריקות התרופות השונות כפי שמוצג בטבלה הראשונה ובטבלה השנייה. המכשיר מודד בו זמנית גם OCR וגם ECAR עבור כל ריצה. עבור מבחן המאמץ מיטו, חישובי ההיקף מבוססים על קריאות OCAR, ואילו עבור מבחן המאמץ הגליקוליטי, חישובי הפרמטרים מבוססים על קריאות ECAR.

הנה עקומת OCR שנוצרה מביצוע מבחן המאמץ של מיטו על תאי RPE אנושיים ראשוניים. חישובים של פרמטרים של מבחן מאמץ Mito מוצגים כתרשימי עמודות. באופן דומה, זוהי עקומת ECAR, הנוצרת מביצוע מבחן המאמץ הגליקוליטי על תאי RPE אנושיים ראשוניים והחישובים מוצגים כגרפים עמודתיים.

כדי למטב את הזרקת התרופה פורט B עבור מבחן המאמץ מיטו, הושוותה היעילות של שני סוכני ניתוק צימוד בהגדלת OCR בתאי RPE אנושיים ראשוניים. BAM15 נמצא עדיף על FCCP בשיפור קיבולת הנשימה המיטוכונדריאלית, כפי שניתן לראות על ידי נשימה מקסימלית גבוהה משמעותית ויכולת נשימה רזרביות גבוהה יותר עם BAM15, בהשוואה ל- FCCP. חשוב לזכור לחלח את מחסנית החיישן יום לפני הפעלת הבדיקה.

טכניקה זו מאפשרת לחוקרים לאפיין טוב יותר את הפרופילים הביו-אנרגטיים של תאי RPE ולהבין כיצד תאי RPE מפגינים גמישות מטבולית בתגובה לגירויים פתוגניים שונים.