התפשטות וירוסים וכימות קולורימטרי מבוסס תאים

פרוטוקול זה מאפשר לזהות ולכמת את נגיף הזיקה מבלי להסתמך על אפקט ציטופתי. זה תלוי בזיהוי נוגדנים של מרכיב הנגיף. השימוש בנוגדנים ספציפיים לנגיף יכול לסייע בזיהוי סרוטיפים שונים של הנגיף באוכלוסיות מעורבות.

לשיטה זו יתרונות על פני מבחני יצירת פלאק קלאסיים. הוא מהיר יותר ומופעל עבור יישומים בעלי תפוקה גבוהה בעת הגשת בקשה עם מערכת הדמיה אוטומטית לספירת תאים מהירה. הפרוטוקול המוצע הוא בעל יכולת התאמה גבוהה.

עם שינויים מתאימים, הפרוטוקול המוצע יכול להיות מיושם על סוגי תאים שונים ומטרות ויראליות. התחילו בגידול תאי Vero בבקבוק תרבית תאים בגודל 75 ריבוע=סנטימטר המכיל 12 מיליליטר DMEM בתוספת 10% FBS ושני מילימולים של L-גלוטמין. מניחים את הבקבוק באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני.

כדי להדביק את חד-שכבתי התא, השתמש בפיפט סרולוגי של 10 מיליליטר כדי להסיר את מדיום הגידול מבקבוק תרבית התא. באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, שטפו את הבקבוק עם שלושה מיליליטר של DPBS פעמיים. לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר של DMEM ללא סרום ו -20 מיקרוליטר של חיסון נגיף זיקה לבקבוק תרבית התא.

תנו לבקבוק לדגור בטמפרטורת החדר במשך שעה עם נדנוד עדין כדי לעודד ספיחת וירוסים. בסוף הדגירה, באמצעות פיפטה סרולוגית של חמישה מיליליטר, להסיר בזהירות ולהשליך את החיסון וירוס מדולל מן בקבוק תרבית התא. שטפו את בקבוק תרבית התאים פעמיים עם שלושה מיליליטר של DPBS.

לאחר מכן, הוסיפו 12 מיליליטר של אמצעי תחזוקה לבקבוק תרבית התאים כדי לשמור על התאים הנגועים. לדגור על תאי Vero הנגועים במשך שלושה ימים באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו חמצני. לאחר שלושה ימי דגירה, השתמשו בפיפטה סרולוגית של 10 מיליליטר כדי לקצור את הסופרנאטנט של תרבית התאים המכיל את נגיף הזיקה לתוך צינור צנטריפוגה של 50 מיליליטר.

לצורך כימות הנגיף, זרעו תאי ורו בצלחות ייעודיות ואפשרו להם לגדול בן לילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם אטמוספירה של 5% פחמן דו חמצני. הכינו שישה צינורות מיקרו-צנטריפוגות סטריליים של 1.5 מיליליטר לכל צלחת כדי לבצע דילול סדרתי פי עשרה, כולל צינור נוסף לבקרה שלילית. להגדרת צלחת של 24 בארות, הוסף 450 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום לכל ששת צינורות המיקרוצנטריפוגה.

להתקנת צלחת של 96 בארות, יש להוציא 135 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום לשש שפופרות נוספות. כדי לבצע דילול סדרתי עבור ניסוי צלחת 24 בארות, להוסיף 50 מיקרוליטר של מלאי וירוס זיקה לתוך 10 עד מינוס צינור אחד המכיל 450 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום. עבור ניסוי צלחת 96 בארות, להוסיף 15 מיקרוליטר של מלאי וירוס זיקה לתוך 10 עד מינוס צינור אחד המכיל 135 מיקרוליטר של DMEM ללא סרום.

מערבלים כל צינור כדי לערבב היטב את הנגיף והמדיום, ומבטיחים פיזור אחיד של חלקיקי הנגיף בתוך הדילול. בעזרת קצה פיפטה טרי, השהה מחדש את הצינור 10 עד מינוס אחד והעבר 50 ו -15 מיקרוליטר של נגיף זיקה מדולל לתוך צינור 10 עד מינוס שניים כדילול שני פי עשרה עבור לוחות 24 ו -96 בארות, בהתאמה. מוציאים ומשליכים את אמצעי ההצבה לכל באר של הצלחת המתאימה.

שטפו היטב כל אחד מהם עם DPBS פעמיים כדי להסיר שאריות. מתחילים עם הדילול הגבוה ביותר, מוסיפים את החיסון נגד וירוסים בדילול סדרתי לבארות, ועובדים לקראת הדילול הנמוך ביותר. לאחר שעה של דגירה, להסיר ולהשליך את הנגיף ההשעיה מן הבארות, החל מהריכוז הנמוך ביותר לריכוז הגבוה ביותר.

לשטוף את התאים הנגועים עם DPBS פעמיים כדי להסיר עקבות של השעיית וירוס. לכסות את הבאר עם DMEM ו 1.5% צמיגות נמוכה carboxymethylcellulose. לדגור על הצלחת באינקובטור תרבית תאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני.

לאחר הדגירה, להסיר ולהשליך את המדיום כיסוי ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. עבור צלחת 96 באר, להשתמש פיפטה רב ערוצית כדי להסיר ולהשליך את המדיום כיסוי, ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם 60 מיקרוליטר של PBS לכל באר. מוסיפים 4% פאראפורמלדהיד כדי לקבע את התאים ולדגור על הצלחת בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות.

לאחר 20 דקות, להשליך את paraformaldehyde ולשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. לאחר מכן, מוסיפים 3, 3'diaminobenzidine peroxidase מצע לדגור את הצלחת במשך 30 דקות בחושך. לאחר 30 דקות, להפסיק את התגובה על ידי שטיפת הבארות עם מים.

ייבשו את הצלחות באוויר למשך הלילה והמשיכו לספירת מוקדים. ספרו את המוקדים עבור כל העתק של הדילול שנבחר וחשבו את מספר המוקדים הממוצע עבור כל אחד מהם. תאי ורו הנגועים תוקנו בנקודות זמן שונות לאחר ההדבקה.

עבור צלחת 2 בארות, ההופעה הראשונה של מוקדי הנגיף נצפתה 48 שעות לאחר ההדבקה, אם כי גודל המוקדים היה קטן מכדי לספור במדויק. לאחר 96 שעות לאחר ההדבקה, לא היו סימנים לניתוק תאים. לאחר 60 שעות לאחר ההדבקה, גודל המוקדים עלה לרמה אופטימלית לספירה.

בהמשך, ככל שהתקדם הזמן, המוקדים גדלו והחלו להתמזג או לחפוף זה עם זה בעוצמתם, ויצרו אשכולות שגדלו עם הזמן. לכן, מוקדים שנוצרו 60 שעות לאחר ההדבקה נבחרו כדי לקבוע את טיטר וירוס זיקה בצלחת 24 באר. עבור צלחת 96 בארות, התאים נותרו שלמים לאחר 72 שעות לאחר ההדבקה.

הופעת מוקדי הנגיף נצפתה לראשונה 24 שעות לאחר ההדבקה. עם זאת, עד 36 שעות לאחר ההדבקה, גודל המוקדים היה קטן מדי. גודל המוקדים האופטימלי הושג 48 שעות לאחר ההדבקה.

בנקודות הזמן האחרונות נצפו מוקדים חופפים או ממוזגים, ומספר המוקדים החופפים גדל עם הזמן. המוקדים נוצרו 48 שעות לאחר בחירת ההדבקה כדי לקבוע את טיטר הנגיף של נגיף זיקה מבודד. הוסיפו בעדינות DPBS בצד של כל באר ונענעו את הלוחות אחורה וקדימה פעם עד שלוש פעמים כדי להסיר פסולת תאית ועודפי מדיה.

טכניקה זו תועיל מאוד לחוקרים במחקר זיקה, וניתן גם להתאים אותה באופן נרחב לכימות וירוסים אחרים בעלי חשיבות קלינית, מה שהופך אותה לכלי רב ערך למעקב ואבחון וירוסים.