שימוש במיקרוסקופיה של קיטועי זמן ודלדול גרעיני ספציפי לשלב של חלבונים כדי לחקור מיוזה ב- S. cerevisiae

על ידי סנכרון תאים בפרופאזה 1 ולאחר מכן דלדול חלבון המטרה בשלב מסוים, שיטה זו יכולה לזהות פונקציות נפרדות באופן זמני של חלבונים ספציפיים. דלדול חלבונים בשלבים מסוימים של מיוזה מונע את ההשפעות השיוריות שיכולות להיות למוטציה מיוטית מסורתית בשלבים מאוחרים יותר. שיטה זו יכולה לשמש לחקר מיטוזה של שמרים ניצנים ואורגניזמים אחרים שאינם עוברים פירוק מעטפת גרעינית.

בנוסף, ניתן להשתמש בשיטה זו באורגניזמים אחרים כדי לחקור אירועי מחזור תאים לפני פירוק מעטפת הגרעין. כדי להתחיל, לעשות כרית אגר שישמש ליצירת monolayer של תאים להדמיה. חותכים ומשליכים את המכסה והתחתון שליש מצינור מיקרוצנטריפוגה של 1.5 מיליליטר כדי ליצור צילינדר שישמש כתבנית לכרית האגר.

הניחו את גליל צינור המיקרוצנטריפוגה החתוך על מגלשת זכוכית נקייה כשהחלק העליון של הצינור הפוך, כשהוא יושב על המגלשה. הכינו שישה מיליליטר מתמיסת 5% אגר בכוס של 50 מיליליטר. חותכים את קצה הפיפטה כדי ליצור פתח גדול יותר ומפטים כ-500 מיקרוליטרים של אגר מומס לתוך צינור המיקרוצנטריפוגה.

תנו לו לשבת בטמפרטורת החדר עד שהאגר יתמצק. כדי להכין תאי שמרים, סובבו 200 מיקרוליטרים של תרבית הספורולציה ב-800 גרם למשך שתי דקות בצינורות מיקרוצנטריפוגה של מיליליטר אחד. השליכו 180 מיקרוליטרים של הסופר-נטנט.

החזירו את הכדור לנוזל הנותר על ידי מערבולת והבהוב הצינור. פיפטה שישה מיקרוליטרים של התאים המרוכזים על הכיסוי מחליקים באמצע התא במקום עם ConA. החזיקו את הצילינדר עם כרית האגר והחליקו אותו בזהירות ממגלשת הזכוכית.

וודאו שהאגר שטוח לחלוטין בתחתית ובעזרת החלק התחתון של קצה הפיפטה, הפעילו לחץ קל על תבנית המיקרוצנטריפוגה כך שמשטח האגר נדחף מעט מעל גבול הצינור. לאחר מכן, הפוך את התבנית כך כרית אגר פונה כלפי מטה לכיוון החדר. השתמש במלקחיים כדי להניח בעדינות את כרית האגר על גבי התאים ואת קצה הפיפטה כדי להחליק בעדינות את כרית האגר סביב התא 10 עד 20 פעמים כדי ליצור מונו-שכבה של תאים על החלקת הכיסוי.

שמור את כרית האגר בתא למשך 12 עד 15 דקות. לאחר מכן, להעביר שני מיליליטר של תרבית sporulation לשני צינורות microcentrifuge ולהסתובב ב 15, 700 G במשך שתי דקות. לאחר העברת הסופרנטנט לצינורות מיקרוצנטריפוגה נקיים, הסתובבו שוב באותו מצב ואספו את הסופרנטנט לניקוי צינורות מיקרוצנטריפוגה.

הוסיפו שני מיליליטר של הסופר-נטנט טיפה לתא המכיל את כרית האגר. לאחר שהנוזל הגיע לחלק העליון של התא, כרית האגר ככל הנראה תצוף. יש להסיר את כרית האגר בעדינות בעזרת מלקחיים ולהשליך אותה.

הניחו כיסוי בגודל 24 על 50 מילימטר בחלק העליון של התא כדי למנוע אידוי במהלך ההדמיה. כדי למקם את הסרט במיקרוסקופ, הכנס את תלוש הכיסוי לתוך מחזיק השקופיות. הדביקו את חימר היציקה לצד הכיסוי כדי לשמור עליו מאובטח במחזיק ההחלקה.

פתח את התוכנה לרכישת תמונות. השתמש בידיות כוונון גסות ועדינות כדי למקד את התאים באמצעות DIC או שדה בהיר. בתפריט הראשי של תוכנת רכישת התמונות, לחץ על קובץ, בחר רכוש, וארבעה חלונות יופיעו.

בחלון בשם Resolve 3D, לחץ על סמל הבקבוקון של Erlenmeyer. פעולה זו תפתח חלון בשם Design Run Experiment, המכיל את הפקדים להגדרת ניסוי להגדרת סרט עם קיטועי זמן. תחת הכרטיסיה עיצוב, נווט אל הכרטיסיה שכותרתה מקטע.

בחר את התיבה לצד מקטעי Z והגדר את המרווח בין המקטעים האופטיים למיקרומטר אחד ואת מספר המקטעים האופטיים לחמישה. לאחר מכן, תחת הכרטיסייה ערוצים, לחץ על סמל הפלוס ובחר את הערוץ המתאים. לאחר מכן, בחר את התיבה שליד הפניה לתמונה והגדר את מיקום Z לאמצע הדגימה מהתפריט הנפתח.

בחר ערך של שידור וזמן חשיפה מהתפריט הנפתח. תחת הכרטיסיה קיטועי זמן, בחר את התיבה לצד קיטועי זמן והזן ערכים עבור דקות ושעות כדי לזהות את מרווח הזמן של רכישת תמונה. בחר את התיבה לצד שמור על מיקוד עם מיקוד אולטימטיבי כדי למנוע סחף שלב במהלך הסרט.

ותחת הכרטיסיה נקודות, בחר את התיבה לצד בקר ברשימת נקודות. בתפריט הראשי, לחץ על תצוגה ובחר רשימת נקודות. הזז את הבמה לאזור של החדר המציג מונולאייר של תאים.

לחץ על סמן פוינט בחלון רשימת נקודות. הזז את השלב כדי לבחור 25 עד 30 נקודות ללא כל חפיפה כדי למנוע חשיפת יתר של התאים והתמונה של כל שדה במהלך כל קורס זמן. בחלון רשימת נקודות, בחר כייל הכל כדי להגדיר את המיקוד האולטימטיבי עבור כל נקודה.

תחת הכרטיסיה הפעלה, שמור את הקובץ ביעד המתאים במחשב. בחלון הפעל ניסוי, בחר בלחצן הפעל כדי להתחיל את הסרט. פתח את תוכנת פיג'י.

פתח את ערוצי DIC ו- mCherry. השג הקרנה אחת בעוצמה מקסימלית של ערוץ mCherry על ידי לחיצה על תמונה, ואחריה Stacks ו- Z Project ובחר עוצמה מקסימלית מהתפריט הנפתח. כדי למזג את ערוצי DIC ו- mCherry בתמונה אחת, לחץ על תמונה, צבע ובחר מיזוג ערוצים.

עקוב אחר תא בודד באמצעות מיוזה. לאחר השלמת מיוזה II, רשום את מספר מסות הדנ"א. בתאים מסוג בר עם רקע העוגן, יש בדרך כלל ארבע מסות דנ"א בסוף המיוזה II, המייצגות את ארבעת התוצרים של מיוזה.

בחלק קטן מהתאים, רק שלוש מסות נראות לאחר מיוזה II.כאשר Ctf19-FRB מעוגן בזמן שחרור הפרופאזה I, כ-47% מהתאים מציגים יותר מארבע מסות דנ"א עם השלמת המיוזה, מה שמרמז על פגם בחיבור של קינטוכורס ומיקרוטובולים. עם עיגון של Ctf19-FRB, או לאחר הרכבת קינטוצ'ור אך לפני מיוזה I, או לאחר מיוזה II, כ -16% מהתאים מציגים מסות DNA נוספות. אחד החלקים החשובים ביותר בפרוטוקול זה הוא להוסיף את ה-supernatant dropwise לתא שלך כדי למנוע הפרעה למונולייר שלך.

בנוסף, שים לב לזמן הדרוש להכנה להדמיה כדי לשקול זאת בניתוח שלך. על ידי שינוי חלבונים ארוזים פלואורסצנטיים, ניתן להשתמש בהליך זה כדי לענות על השאלות הנוגעות למשך מחזור התא, הפרדת כרומוזומים, שפע חלבונים ולוקליזציה של חלבונים.