Name: הזרקה תוך לבבית של תאי סרטן ערמונית אנושיים ליצירת גרורות עצם מודל עכבר Xenograft (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-11-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 32 s
Description: חקור הזרקה תוך לבבית של תאי PC3 ליצירת מודל עכבר Xenograft לגרורות עצם בסרטן הערמונית. שיטה זו מאפשרת חקירת מנגנונים מולקולריים ובדיקת טיפולים in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי מענקים מתוכנית המו"פ הלאומית של סין (2018YFC1704300 ו- 2020YFE0201600), הקרן הלאומית למדעי הטבע (81973877 ו- 82174408), פרויקטי המחקר במסגרת התקציב של אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית (2021LK047), ומרכז החדשנות השיתופית בשנחאי של טרנספורמציה תעשייתית של הכנת TCM בבית החולים.

עכברי BALB/c אתימיים זכרים בני שישה עד שמונה שבועות (n = 10) שוכנו בכלובי עכברים מאווררים בנפרד (5 עכברים / כלוב) בחדר בעלי חיים ספציפי ללא פתוגן (SPF) בתנאים של מחזור אור / חושך של 12 שעות, עם גישה חופשית להזנת SPF ומים סטריליים. עכברים הוזנו באופן אדפטיבי במשך שבוע לפני הניסויים. כל הניסויים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה לרווחת בעלי חיים של אוניברסיטת שנגחאי לרפואה סינית מסורתית.
1. הכנת תאים
<ol><li>ביום הזרקת תאי סרטן הערמונית, יש לשטוף 80%-90% לוציפראז קונפלואנטי המסומן בתאי PC-3 (PC-3-luciferase) בתרבית תאים בקוטר 10 ס"מ עם PBS סטרילי טרום קר (pH 7.4) פעמיים. טריפסין במשך 3 דקות עם 1.5 מ"ל של 0.25% טריפסין, ולאסוף את התאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מ"ל לאחר הרוות את טריפסין עם 6 מ"ל של מדיום F-12 המכיל 10% סרום. הערה: קו התאים PC-3-luciferase נגזר מקו התאים PC-3 לאחר שהודבק בווקטור pLV-luciferase15.</li>
	<li>השתמש במונה תאים אוטומטי וחשב את ריכוז התא על-ידי העברת 20 μL מתרחיף התא ללוח ספירת התאים (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים ב 800 x גרם בטמפרטורת החדר (RT) במשך 5 דקות.</li>
	<li>השתמש פיפטה כדי להשליך את supernatant ולהשהות מחדש את גלולת התא בתווך F-12 (ראה טבלת חומרים) לצפיפות תא סופית של 1 x 107 תאים/מ"ל.</li>
	<li>שמור את התאים על קרח בכל עת עד ההזרקה.</li>
	<li>הביאו את התאים לחדר הניתוח וסיימו את הזרקת התאים תוך שעתיים. הערה: הכינו מתלי תאים נוספים (בדרך כלל נפחים כפולים לפי הצורך) כדי להבטיח מנות הזרקה מדויקות (לדוגמה, כדי למנוע את החללים המתים בתוך המזרקים).</li>
</ol>2. ניתוח להזרקה תוך לבבית של תאי סרטן הערמונית האנושית
הערה: המנגנון הכירורגי המשמש להזרקה תוך לבבית הוא מזרק 1 מ"ל (איור 1). לספק תמיכה תרמית לאורך כל ההליך עד להחלמה של בעל החיים מההרדמה.
<ol><li>שמור את העכבר בחדר בעלי החיים SPF. בצע את כל ההליכים עם מנגנונים מעוקרים בתוך ארון אספטי.</li>
	<li>מרדימים את העכבר באמצעות איזופלורן 2% עם 98% חמצן תחת קצב זרימת חמצן של 2 ליטר/דקה. הערה: יש למרוח כמות קטנה של משחת עיניים על עיני העכבר כדי למנוע יובש במהלך ההרדמה. בצע את כל הניתוח באזור מאוורר היטב. ודא שהעכבר מורדם עמוקות על ידי צביטת אצבעות רגלי העכבר לפני הזרקת התא. אם התגובות (למשל, אידיוט או עווית) נשארות, המתן זמן נוסף עד שההרדמה תיכנס לתוקף.</li>
	<li>הניחו את העכבר בתנוחת שכיבה ושתקו את שתי הגפיים העליונות בניצב הרחק מקו האמצע (איור 2A).</li>
	<li>לשתק את העכבר מהבטן ומטה עם סרט הדבקה כירורגי. הימנעו מללחוץ חזק ולהזיז את האיברים הפנימיים (איור 2B). הערה: שמירה על האנטומיה הטופוגרפית (כלומר, קיבוע עם סרט הדבקה) היא חיונית מכיוון שההזרקה תוך לבבית היא עיוורת (כלומר, אתר ההזרקה המדויק בלב אינו נראה לעין בלתי).</li>
	<li>לחטא את עור בית החזה עם מקלון אתנול 70%.</li>
	<li>זהה את תהליך הקסיפואיד של העכבר בשקע בקצה התחתון של אמצע עצם החזה על ידי מישוש באמצע דופן החזה הקדמית. זהה את החריץ הצווארי של העכבר בשקע המרכזי בגבול העליון של המנובריום על ידי מישוש מאמצע דופן החזה הקדמית.</li>
	<li>תייגו את הנקודה הנחותה ביותר בתהליך הקסיפואיד ואת החריץ הג'וגולרי בעזרת עט סמן (איור 2A). סמנו סימן שלישי באמצע שני ציוני הדרך הללו ומעט ימינה (משמאל החיה) קצת מעל הלב בחלל הבין-קוסטלי השלישי. הערה: מקום ההזרקה נמצא 1-2 מ"מ משמאל לקו האמצע, ונקודת ההזרקה נמצאת בין הצלע השלישית והרביעית של העכבר (איור 2A).</li>
	<li>טען 200 μL של תרחיף התא לתוך מזרק 1 מ"ל. הערה: שמרו על בועת אוויר במזרק, כפי שמוצג באיור 2C, כדי לוודא שהדם פועם. יש לערבב היטב את מתלה התא לפני הטעינה.</li>
	<li>הכניסו אנכית מחט 26G דרך אתר ההזרקה (איור 2D).</li>
	<li>שמור על היד המחזיקה את המזרק יציב על השולחן, או השתמש ביד השנייה כדי להחזיק אותו יציב. יש לוודא שהציר הארוך של המזרק ניצב לאתר ההזרקה, ולהכניס את המזרק כ-2 מ"מ תת עורית.</li>
	<li>פעימת דם אדומה בהירה נראית במרכז המחט ו / או תרחיף התא כאשר קצה המחט מוכנס כראוי לחדר השמאלי. אם פעימת הדם אינה נראית, קצה המחט אינו בלב. יש לשלוף ולהחליף את המחט (במקרה שקרישת הדם בתוך המחט עוצרת את פעימות הדם). הכנס שוב את המחט.</li>
	<li>להזריק את התאים. הזריקו את מתלה התא (100 מיקרוליטר) לאט מאוד מעל 40-60 שניות ושמרו על היד האוחזת במזרק יציבה כל הזמן. הערה: יש להשגיח מקרוב על תרחיף התאים במזרק, ואין להזריק את בועת האוויר בתוך המזרק לתוך הלב.</li>
	<li>הפעל לחץ על אתר ההזרקה עם צמר גפן יבש במשך 15 שניות כדי להבטיח המוסטאזיס כאשר המחט נשלפת.</li>
	<li>החזירו את העכבר לכלוב הנקי ועקבו אחר בעל החיים עד שיתאושש לחלוטין מההרדמה.</li>
	<li>דמיינו את העכבר עם מערכת ביולומינסנציה in vivo תוך 24 שעות לאחר ההזרקה כדי להבטיח שהתאים הסרטניים נכנסו למחזור הדם. הערה: תאי סרטן המוזרקים כראוי נכנסים למחזור הדם העורקי דרך חדר הלב השמאלי, אשר נראה על-ידי איתות ביולומינסנציה הנראה בכל הגוף (לדוגמה, ראו איור 3A).</li>
	<li>בצע הדמיה ביולומינסנציה in vivo .<ol><li>הפעל את המכשיר ואת המחשב. פתח את התוכנה כאשר מחוון ההפעלה במכשיר ובמחשב מתבהר, ולאחר מכן פתח את החלון Image Acquisition .</li>
		<li>זהה את מערכת ההדמיה in vivo המחוברת למחשב בחלונית ההתקן. מקם את העכבר לצילום בתא ההדמיה במצב שכיבה. לאחר מכן סגור את דלת תא ההדמיה.</li>
		<li>הגדר את הפרמטרים בחלונית ההגדרה המסופקת בחלון רכישת תמונה .<ol><li>הגדר את הפרמטרים עם Lens > Zoom > 1x, Lens > Focus > 108 ו - Lens > Iris > F 2.8 כדי להבהיר את התמונות.</li>
			<li>הגדר את ערוץ הצילום ב- Filter&Light: Filter&Light > Filter > Luminescence, Filter&Light > Light > OFF ו - Filter&Light > עוצמת אור > באמצע.</li>
			<li>הגדר את סוג התמונה שיש לצלם: סוג > הדמיה > מסגרת יחידה, זמן חשיפה > הדמיה > 500 אלפיות השנייה, מצב הדמיה > HDR > מצב רווח נמוך. לחץ על כפתור לרכוש כדי לרכוש את התמונה.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>דמיינו את צמיחת הסרטן הגרורתי עם ביולומינסנציה in vivo . הערה: בכל נקודת זמן של ההדמיה, תוך צפקית להזריק 200 μL של מצע luciferin לתוך עכבר 20 גרם (150 מ"ג / ק"ג) ולחכות 15 דקות לפני ההרדמה (2% isoflurane מעורבב עם 98% חמצן בתא אינדוקציה). הנח את העכבר על פלטפורמת מערכת ההדמיה של ביולומינסנציה. יש לשמור על הרדמה באמצעות מסכת אף עם 2% איזופלורן.</li>
</ol>3. חקירה פתולוגית
<ol><li>ארבעה שבועות לאחר הזרקת התא, להקריב את העכבר על ידי שאיפת CO2 ולאחר מכן נקע צוואר הרחם.</li>
	<li>לשתק את העכבר במצב שכיבה. ביצוע חתך אנכי (כ-6 ס"מ) מהבטן לבית החזה בעזרת מספריים כירורגיים כדי לחשוף ולבדוק באופן גס את כל איברי הבטן ובית החזה לאיתור נגעים סרטניים ו/או שינויים פתולוגיים. הערה: במחקר הזרקת תאי סרטן תוך לבביים, נגעים סרטניים במדיאסטינום הסמוך ללב מצביעים על תאים סרטניים שהוזרקו שלא כהלכה (תאים שלא הוזרקו לחדר הלב השמאלי); לכן, עכברים אלה אינם נכללים באיסוף הנתונים הסופי.</li>
	<li>הבלו את הגידולים גרורתיים עם מספריים. למדוד את הקטרים הארוכים (a) והקצרים (b) של הגידול באמצעות קליפרים כדי לחשב את נפח הגידול (V) באמצעות הנוסחה V = 1/2 × a × b2, ולשקול את הגידול באמצעות סולם אלקטרוני.</li>
	<li>תקן את רקמות הגידול בתמיסת פורמלין 10% ואחריה הטבעה בפרפין. לחלופין, הקפיאו את הגידולים בחנקן נוזלי.</li>
	<li>הבלו על העצמות (גפיים אחוריות, חוליות ו/או צלעות) עם נגעים גרורתיים. תקן את הדגימה של כל עכבר בצינור 50 מ"ל המכיל 20 מ"ל של תמיסת פורמלין 10% למשך 24 שעות לאחר הסרת העור והשרירים, ולאחר מכן הסתיידות למשך 14 יום בתמיסת EDTA 10% עם שינוי חיץ תכוף (כל 3 ימים).</li>
	<li>הטמע את הדגימה בפרפין וחתך את הדגימות לבדיקה היסטולוגית שגרתית16.</li>
</ol>

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+Cancerstatistics%2C+2021%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Cancer Cancerstatistics, 2021.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (1), 7-33 (2021).</li>
<li>Sung, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2020%3A+GLOBOCAN+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA%3A+A+Cancer+Journal+for+Clinicians%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2020: GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA: A Cancer Journal for Clinicians. 71 (3), 209-249 (2021).</li>
<li>Coleman, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skeletal+complications+of+malignancy%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Skeletal complications of malignancy.</a> Cancer. 80, 1588-1594 (1997).</li>
<li>Macedo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+metastases%3A+An+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Oncology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bone metastases: An overview.</a> Oncology Reviews. 11 (1), 321(2017).</li>
<li>Rea, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+in+prostate+cancer+translational+research%3A+From+xenograft+to+PDX%5BTitle%5D)+AND+%22BioMed+Research+International%22%5BJournal%5D)">Mouse models in prostate cancer translational research: From xenograft to PDX.</a> BioMed Research International. 2016, 9750795(2016).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+GFP+intravital+imaging+of+the+differences+in+cellular+and+angiogenic+behavior+of+subcutaneous+and+orthotopic+nude-mouse+models+of+human+PC-3+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cellular+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Real-time GFP intravital imaging of the differences in cellular and angiogenic behavior of subcutaneous and orthotopic nude-mouse models of human PC-3 prostate cancer.</a> Journal of Cellular Biochemistry. 117 (11), 2546-2551 (2016).</li>
<li>Stephenson, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metastatic+model+for+human+prostate+cancer+using+orthotopic+implantation+in+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+National+Cancer+Institute%22%5BJournal%5D)">Metastatic model for human prostate cancer using orthotopic implantation in nude mice.</a> Journal of the National Cancer Institute. 84 (12), 951-957 (1992).</li>
<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Animal+models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Veterinary+Pathology%22%5BJournal%5D)">Animal models of bone metastasis.</a> Veterinary Pathology. 52 (5), 827-841 (2015).</li>
<li>Jenkins, D. E., Hornig, Y. S., Oei, Y., Dusich, J., Purchio, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescent+human+breast+cancer+cell+lines+that+permit+rapid+and+sensitive+in+vivo+detection+of+mammary+tumors+and+multiple+metastases+in+immune+deficient+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research%3A+BCR%22%5BJournal%5D)">Bioluminescent human breast cancer cell lines that permit rapid and sensitive in vivo detection of mammary tumors and multiple metastases in immune deficient mice.</a> Breast Cancer Research: BCR. 7 (4), 444-454 (2005).</li>
<li>Corey, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+osseous+prostate+cancer+models%3A+intra-tibial+injection+of+human+prostate+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of osseous prostate cancer models: intra-tibial injection of human prostate cancer cells.</a> The Prostate. 52 (1), 20-33 (2002).</li>
<li>Andersen, C., Bagi, C. M., Adams, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intra-tibial+injection+of+human+prostate+cancer+cell+line+CWR22+elicits+osteoblastic+response+in+immunodeficient+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Musculoskeletal+%26+Neuronal+Interactions%22%5BJournal%5D)">Intra-tibial injection of human prostate cancer cell line CWR22 elicits osteoblastic response in immunodeficient rats.</a> Journal of Musculoskeletal & Neuronal Interactions. 3 (2), 148-155 (2003).</li>
<li>Sudhan, D. R., Pampo, C., Rice, L., Siemann, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cathepsin+L+inactivation+leads+to+multimodal+inhibition+of+prostate+cancer+cell+dissemination+in+a+preclinical+bone+metastasis+model%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Cathepsin L inactivation leads to multimodal inhibition of prostate cancer cell dissemination in a preclinical bone metastasis model.</a> International Journal of Cancer. 138 (11), 2665-2677 (2016).</li>
<li>Jinnah, A. H., Zacks, B. C., Gwam, C. U., Kerr, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+and+established+models+of+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Emerging and established models of bone metastasis.</a> Cancers. 10 (6), 176(2018).</li>
<li>Simmons, J. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Canine+prostate+cancer+cell+line+%28Probasco%29+produces+osteoblastic+metastases+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22The+Prostate%22%5BJournal%5D)">Canine prostate cancer cell line (Probasco) produces osteoblastic metastases in vivo.</a> The Prostate. 74 (13), 1251-1265 (2014).</li>
<li>Lamar, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRC+tyrosine+kinase+activates+the+YAP%2FTAZ+axis+and+thereby+drives+tumor+growth+and+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">SRC tyrosine kinase activates the YAP/TAZ axis and thereby drives tumor growth and metastasis.</a> The Journal of Biological Chemistry. 294 (7), 2302-2317 (2019).</li>
<li>Chang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Matrine+inhibits+prostate+cancer+via+activation+of+the+unfolded+protein+response%2Fendoplasmic+reticulum+stress+signaling+and+reversal+of+epithelial+to+mesenchymal+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Medicine+Reports%22%5BJournal%5D)">Matrine inhibits prostate cancer via activation of the unfolded protein response/endoplasmic reticulum stress signaling and reversal of epithelial to mesenchymal transition.</a> Molecular Medicine Reports. 18 (1), 945-957 (2018).</li>
<li>Arguello, F., Baggs, R. B., Frantz, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+murine+model+of+experimental+metastasis+to+bone+and+bone+marrow%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">A murine model of experimental metastasis to bone and bone marrow.</a> Cancer Research. 48 (23), 6876-6881 (1988).</li>
<li>Brylka, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spine+Metastases+in+immunocompromised+mice+after+intracardiac+injection+of+MDA-MB-231-SCP2+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Spine Metastases in immunocompromised mice after intracardiac injection of MDA-MB-231-SCP2 breast cancer cells.</a> Cancers. 14 (3), 556(2022).</li>
<li>Rahman, M. M., Veigas, J. M., Williams, P. J., Fernandes, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DHA+is+a+more+potent+inhibitor+of+breast+cancer+metastasis+to+bone+and+related+osteolysis+than+EPA%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Research+and+Treatment%22%5BJournal%5D)">DHA is a more potent inhibitor of breast cancer metastasis to bone and related osteolysis than EPA.</a> Breast Cancer Research and Treatment. 141 (3), 341-352 (2013).</li>
<li>Park, S. I., Kim, S. J., McCauley, L. K., Gallick, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pre-clinical+mouse+models+of+human+prostate+cancer+and+their+utility+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Pre-clinical mouse models of human prostate cancer and their utility in drug discovery.</a> Current Protocols in Pharmacology. , Chapter 14, Unit 14.15 (2010).</li>
<li>Wright, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Murine+models+of+breast+cancer+bone+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22BoneKEy+Reports%22%5BJournal%5D)">Murine models of breast cancer bone metastasis.</a> BoneKEy Reports. 5, 804(2016).</li>
<li>Fearon, K. C., Glass, D. J., Guttridge, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cachexia%3A+mediators%2C+signaling%2C+and+metabolic+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Cancer cachexia: mediators, signaling, and metabolic pathways.</a> Cell Metabolism. 16 (2), 153-166 (2012).</li>
<li>Waning, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Excess+TGF-%CE%B2+mediates+muscle+weakness+associated+with+bone+metastases+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Medicine%22%5BJournal%5D)">Excess TGF-β mediates muscle weakness associated with bone metastases in mice.</a> Nature Medicine. 21 (11), 1262-1271 (2015).</li>
<li>Talbot, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+body-weight+reduction+as+a+humane+endpoint%3A+a+critical+appraisal%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Animals%22%5BJournal%5D)">Defining body-weight reduction as a humane endpoint: a critical appraisal.</a> Laboratory Animals. 54 (1), 99-110 (2020).</li>
<li>Paget, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+distribution+of+secondary+growths+in+cancer+of+the+breast%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Metastasis+Reviews%22%5BJournal%5D)">The distribution of secondary growths in cancer of the breast.</a> Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).</li>
<li>Yin, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TGF-beta+signaling+blockade+inhibits+PTHrP+secretion+by+breast+cancer+cells+and+bone+metastases+development%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">TGF-beta signaling blockade inhibits PTHrP secretion by breast cancer cells and bone metastases development.</a> The Journal of Clinical Investigation. 103 (2), 197-206 (1999).</li>
<li>Schneider, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((turnover+mediates+preferential+localization+of+prostate+cancer+in+the+skeleton%5BTitle%5D)+AND+%22Endocrinology%22%5BJournal%5D)">turnover mediates preferential localization of prostate cancer in the skeleton.</a> Endocrinology. 146 (4), 1727-1736 (2005).</li>
<li>Padalecki, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+18+suppresses+prostate+cancer+metastases%5BTitle%5D)+AND+%22Urologic+Oncology%22%5BJournal%5D)">Chromosome 18 suppresses prostate cancer metastases.</a> Urologic Oncology. 21 (5), 366-373 (2003).</li>
</ol>

כל המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

הזרקה תוך לבבית של תאי סרטן ערמונית אנושיים ליצירת גרורות בעצמות היא מודל עכבר אידיאלי לחקר הפונקציות והמנגנונים של גרורות עצם של סרטן הערמונית והערכת היעילות הטיפולית. מחקרים הראו כי נזק לעצם מתרחש ככל הנראה בשוקה הפרוקסימלית ובעצם הירך הדיסטלית17, אשר עשויה לנבוע מכלי הדם הגבוהים והפעילות המטבולית שלהם.
מכיוון שגרורות בעצמות הן נגע גרורתי שכיח בחולות סרטן השד, מודל גרורות העצם המיוצר על ידי הזרקה תוך לבבית של תאי סרטן השד נפוץ גם במחקרים על סרטן השד1...

סרטן הערמונית הוא הסרטן השכיח ביותר בקרב גברים ב -112 מדינות ומדורג במקום השני בתמותה במדינות מדד התפתחות אנושי גבוה יותר 1,2. רוב מקרי המוות בחולי סרטן הערמונית נגרמים מגרורות, וכ-65%-75% מהמקרים יפתחו גרורות בעצמות 3,4. לכן, יש צורך דחוף במניעה וטיפול בגרורות עצם של סרטן הערמונית כדי לשפר את התוצאה הקלינית של חולי סרטן הערמונית. המודל החייתי של גרורות עצם הוא כלי חיוני לחקר התהליך הרב-שלבי והמנגנונים המולקולריים המעורבים בכל שלב של גרורות עצם של סרטן הערמונית, ובכך לזהות מטרות טיפוליות ולפתח טיפולים חדשניים5.
השיטות הנפוצות ביותר ליצירת מודלים ניסיוניים של בעלי חיים של גרורות בעצמות סרטן הערמונית כוללות את האורתוטופיה, תוך דיאפיזה (כגון תוך טיביאלית) והזרקה תוך לבבית של תאי סרטן הערמונית. מודל גרורות העצם עם הזרקה אורתוטופית נוצר על ידי הזרקה ישירה של תאי סרטן הערמונית לתוך הערמונית של עכבר 6,7. למודל ניסיוני זה של בעלי חיים יש מאפיינים קליניים דומים מאוד לגרורות בעצמות סרטן הערמונית. עם זאת, הגרורות מתרחשות בעיקר בבלוטת הלימפה בבית השחי ובריאה ולא בעצם 8,9. מודל ההזרקה התוך טיביאלית לסרטן הערמונית מזריק ישירות תאי סרטן ערמונית לעצם השוקה עם שיעור היווצרות גידול גבוה בעצם (טיביה)10,11; עם זאת, קליפת העצם וחלל מח העצם ניזוקים בקלות. בנוסף, שיטת ההזרקה הטיביאלית אינה יכולה לעורר את התהליך הפתולוגי של גרורות עצם סרטן הערמונית שבו התאים הסרטניים מאכלסים את העצם דרך מחזור הדם. כדי לחקור את מחזור הדם, אקסטרווסציה וסקולרית וגרורות מרוחקות עם שיעור גרורות עצם גבוה יותר של תאים סרטניים, פותחה טכניקת הזרקה תוך לבבית על ידי הזרקה ישירה של תאי סרטן הערמונית לחדר השמאלי של העכבר 8,12,13. זה הופך אותו למודל בעל ערך בבעלי חיים לחקר גרורות בעצמות8. בשיטת ההזרקה התוך-לבבית שיעור גרורות בעצמות עומד על כ-75%9,14, גבוה בהרבה משיטת ההזרקה האורתוטופית. לכן, הזרקה תוך לבבית היא שיטה אידיאלית ליצור מודל בעלי חיים עם גרורות עצם סרטן הערמונית.
עבודה זו נועדה לתאר את תהליך הקמת מודל העכבר של גרורות עצם סרטן הערמונית, המאפשר לקוראים לדמיין את הקמת המודל. העבודה הנוכחית מספקת תהליכים מפורטים, אמצעי זהירות ותמונות להמחשה ליצירת מודל xenograft גרורות עצם באמצעות הזרקה תוך לבבית של תאי סרטן ערמונית אנושיים בעכברים אתימיים. שיטה זו מספקת כלי יעיל לחקירה נוספת של המנגנונים המולקולריים וההשפעות הטיפוליות in vivo של גרורות בעצמות סרטן הערמונית.

<table><tbody><tr><td>1 מ"ל מזרקים ומחטים</td><td>שאנדונג Weigao קבוצה פולימר רפואי ושות', בע"מ</td><td>20200411</td><td>התאים הוזרקו לחדרים של עכברים</td></tr><tr><td>מכונת הרדמה</td><td>שנזן RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>R500IP</td><td>ציוד להרדמת עכברים</td></tr><tr><td>דלפק תאים אוטומטי</td><td>שנחאי Simo Biological Technology Co., Ltd</td><td>IC1000</td><td>&nbsp; לספירת תאים</td></tr><tr><td>BALB / c עכברים אתימיים</td><td>שנחאי SLAC מעבדה בעלי חיים ושות', בע"מ</td><td>זכר</td><td>בן 6-8 שבועות, עכברים זכרים</td></tr><tr><td>מערכת הדמיה ביולומינסנציה</td><td>שנחאי Baitai Technology Co., Ltd</td><td>Vieworks</td><td>למעקב אחר צמיחת הגידול והגרורות הריאתיות אם התאים המוזרקים מסומנים על ידי</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה לוציפראז (15 מ"ל, 50 מ"ל)</td><td>שנחאי YueNian ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>&nbsp; 430790, קורנינג</td><td></td></tr><tr><td>EDTA פתרון</td><td>ווהאן חאווייר ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>G1105</td><td>&nbsp; להסרת אבדן של עצם העצם</td></tr><tr><td>F-12 מדיום</td><td>שנחאי YueNian ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>21700075, GIBCO</td><td>מדיום תרבית תאים</td></tr><tr><td>פורמלין פתרון</td><td>שנחאי YueNian ביוטכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>BL539A</td><td>לתיקון הדגימה של כל עכבר</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Shenzhen RWD Life Technology Co., Ltd</td><td>VETEASY</td><td>להרדמה&nbsp;</td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>11668027, Thermo fisher</td><td>מגיב טרנספקציה פלסמיד</td></tr><tr><td>PC-3 קו תאים</td><td>בנק התאים של האקדמיה הסינית למדעים</td><td>TCHu 158</td><td>קו תאים לסרטן הערמונית</td></tr><tr><td>מי מלח חוצץ פוספט</td><td>Beyotime Biotechnology</td><td>ST447</td><td>שטפו את תאי האוסטאוסרקומה האנושיים</td></tr><tr><td>טריפסין (0.25%)</td> <td>שנחאי YueNian Biotechnology Co. בע"מ</td><td>25200056, Gibco</td><td>לניתוק התאים</td></tr><tr><td>וקטור (pLV-luciferase)</td><td>Shanghai YueNian Biotechnology Co., Ltd</td><td>VL3613</td><td>פלסמיד למערכת</td></tr><tr><td>הדמיית רנטגן</td> טרנספקציה <td>ברוק (בייג'ינג) טכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>FX PRO</td><td>להשגת תמונות רנטגן לאיתור צמיחת גידול</td></tr> <tr><td>&mu; CT80</td><td>Shenzhen Fraun Technology Service Co., Ltd</td><td>Scanco Medical AG, שוויץ</td><td>לאיתור הרס עצם. ה-mico-CT מצויד ב-3DCalc, שחזור חרוט,&nbsp; ו-&mu; תוכנת הדמיה של דגם CT Ray V3.4A.</td></tr></tbody></table>

הזרקה תוך לבבית של תאי סרטן ערמונית אנושיים ליצירת גרורות עצם מודל עכבר xenograft

Intra-Cardiac Injection of Human Prostate Cancer Cells to Create a Bone Metastasis Xenograft Mouse Model

כממאירות הגברית הנפוצה ביותר, סרטן הערמונית (PC) מדורג במקום השני בתמותה, בעיקר בשל שיעור גרורות בעצמות של 65%-75%. לכן, חיוני להבין את התהליך ואת המנגנונים הקשורים של גרורות עצם סרטן הערמונית לפיתוח טיפולים חדשים. לשם כך, מודל בעלי חיים של גרורות עצם הוא כלי חיוני. כאן, אנו מדווחים על הליכים מפורטים ליצירת מודל עכבר גרורות עצם באמצעות הזרקה תוך לבבית של תאי סרטן הערמונית. מערכת הדמיה ביולומינסנטית יכולה לקבוע אם תאי סרטן הערמונית הוזרקו במדויק ללב ולנטר גרורות של תאים סרטניים, שכן יש לה יתרונות גדולים במעקב אחר התפתחות נגעים גרורתיים. מודל זה משכפל את ההתפתחות הטבעית של תאי סרטן מופצים ליצירת מיקרו-גרורות בעצם ומחקה את התהליך הפתולוגי של גרורות בעצמות סרטן הערמונית. הוא מספק כלי יעיל לחקירה נוספת של המנגנונים המולקולריים ואת ההשפעות הטיפוליות in vivo של מחלה זו.

להדמיית ביולומינסנציה יתרונות עצומים במעקב אחר התפתחות הנגע הגרורתי במודל הזרקה תוך לבבי. זמן קצר לאחר הזרקת התאים הסרטניים (תוך 24 שעות), נעשה שימוש בדימות ביולומינסנציה כדי לדמיין את התאים הסרטניים נכנסים למחזור הדם הכללי (איור 3A). איתות ביולומינסנציה ברור בכל הגוף ייראה כאשר התאים הסרטניים מוזרקים למחזור הדם העורקי כראוי. נתונים מעכברים המראים אותות ביולומינסנציה רק באתר ההזרקה (לב) צריכים להיכלל באיסוף הנתונים הסופי. נגעים גרורתיים בגפיים האחוריות נצפו (איור</strong...

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להזרקה תוך לבבית של תאי סרטן ערמונית אנושיים כדי ליצור מודל עכבר עם נגעים גרורות בעצמות.

הזרקה תוך לבבית של תאי סרטן ערמונית אנושיים ליצירת גרורות עצם מודל עכבר Xenograft

As the most common male malignancy, prostate cancer (PC) ranks second in mortality, primarily due to a 65%-75% bone metastasis rate. Therefore, it is ...

שיטה זו יכולה לסייע ביצירת מודל אידיאלי המחקה באופן הדוק את ההתקדמות הטבעית של גרורות עצם של תאי סרטן הערמונית in vivo. לטכניקה זו יש את היתרון של גרורות עצם ומייצגת את תהליך גרורות העצם הטבעיות של תאי סרטן הערמונית in vivo. טכניקה זו מועילה לחקר המנגנונים המולקולריים וחקירת ההשפעות הטיפוליות in vivo עבור גרורות עצם סרטן הערמונית.ביום ההזרקה, יש ליטול 80% עד 90% תאי PC3 עם תווית לוציפראז בתרבית בתרבית תאים בקוטר 10 ס"מ ולהתחיל להכין את התאים להזרקה על ידי שטיפתם פעמיים עם PBS סטרילי קר. טריפסין את התאים שטופים עם 1.5 מיליליטר של 0.25% טריפסין במשך שלוש דקות, ולאחר מכן להרוות את טריפסין על ידי הוספת שישה מיליליטר של מדיום F12 המכיל 10% סרום ולאסוף את התאים לתוך צינור צנטריפוגה 15 מיליליטר. העבירו 20 מיקרוליטר מתרחיף התא שנאסף לצלחת ספירת תאים וחשבו את ריכוז התא באמצעות מונה תאים אוטומטי.לאחר מכן, צנטריפוגו את התאים בטמפרטורת החדר למשך חמש דקות בטמפרטורה של 800 גרם.השליכו את הסופרנאטנט באמצעות פיפטה והשהו מחדש את כדורית התא בתווך F12 כדי להשיג את צפיפות התאים הסופית הרצויה. כעת יש להעביר את התאים לחדר הניתוח ולבצע את הזרקת התאים תוך שעתיים. שמור את התאים על קרח עד ההזרקה.כדי להתחיל את הניתוח, הניחו את העכבר המרדים במצב שכיבה ושתקו את שתי הגפיים העליונות על ידי מתיחה אנכית שלהן מקו האמצע. באמצעות סרט הדבקה כירורגי, לשתק את העכבר מהבטן למטה מבלי ללחוץ חזק ולהזיז את האיברים הפנימיים. יש לחטא את עור בית החזה באמצעות מקלון אתנול 70%.לאחר מכן, מישוש באמצע דופן החזה הקדמית כדי לאתר את תהליך הקסיפואיד של העכבר בשקע בקצה התחתון של עצם החזה האמצעית. תייגו את הנקודה הנחותה ביותר בתהליך הקסיפואיד. לאחר מכן על ידי מישוש מאמצע דופן החזה הקדמית, אתר את החריץ הג'וגולרי של העכבר בשקע המרכזי בגבול העליון של המנובריום וסמן את הנקודה הנחותה ביותר של החריץ הג'וגולרי.כעת אתרו וסמנו את נקודת האמצע בין שני הסימנים הקודמים, מעט ימינה וקצת מעל הלב בחלל הבין-קוסטלי השלישי. זוהי נקודת ההזרקה. ערבבו היטב את מתלה התא לפני העמסת 200 מיקרוליטר של התרחיף לתוך מזרק של מיליליטר אחד המורכב עם מחט 26 מד.השאירו מעט אוויר במזרק שבין הבוכנה למתלה כדי לאפשר כניסת דם פועם במהלך ההזרקה. כדי לבצע את ההזרקה, הכנס אנכית את המחט דרך אתר ההזרקה. אם קצה המחט מוכנס כראוי לחדר השמאלי, דם פועם אדום בוהק יהיה גלוי במרכז המחט.נסה שוב להזריק אם פעימת הדם אינה נראית לעין או קרישת הדם. לאחר החדרת המחט כראוי, הזריקו 100 מיקרוליטר של תרחיף התא לאט מאוד במשך 40 עד 60 שניות ביד יציבה. לאחר השלמת ההזרקה, משוך את המחט תוך הפעלת לחץ על אתר ההזרקה עם צמר גפן יבש למשך 15 שניות כדי להבטיח המוסטאזיס.החזירו את העכבר לכלוב הנקי ועקבו אחר בעל החיים עד שיתאושש לחלוטין מההרדמה. הדמיית ביולומינסנציה שבוצעה 24 שעות לאחר הזרקת תאי PC3 המסומנים בלוציפראז לעכבר הראתה אותות מכל גוף החיה המעידים על נוכחות תאים סרטניים במחזור הדם. נגעים גרורתיים הופיעו בגפיים האחוריות של העכבר שבועיים לאחר ההזרקה.הנגעים הגרורתיים הלכו וגדלו ככל שהתקדם הזמן והחלו להופיע באתרים אחרים. הנגעים גרורתיים הנגרמים על ידי תאי סרטן הערמונית בעצמות זוהו עוד יותר באמצעות הדמיית רנטגן שהראתה הרס עצם בשוקה הפרוקסימלית של החיה. כך גם אושר על ידי סריקת מיקרו CT.הנגעים הגרורתיים אושרו עוד יותר ברקמות משובצות פרפין על ידי הכתמת המטין ואוזין. אתר הזרקה מדויק חשוב מאוד כדי להבטיח את שיעור ההצלחה של מודל זה. ניתן להשיג זאת על ידי תרגול.

intra-cardiac-injection-human-prostate-cancer-cells-to-create-bone

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

מודלים של בעלי חיים לעתים קרובות מנוצלים כדי ללמוד גרורות סרטן העצם. בפרוטוקול זה יתאר שתי שיטות נפוצות של חיסון ללימודי גידול גרור בעצמות ומתארים בקצרה כמה מהניתוחים מנוצלים כדי לעקוב ולכמת דגמים אלה.

מודלים של גרורות עצם

הסרטון מדגים את טכניקת החיסון האורתוטופית לסרטן השד במודל עכבר. טכניקה זו מייצרת שיעור גידול גבוה עם פחות שונות בגודל הגידול וצורתו בהשוואה להזרקה תת עורית או לא ניתוחית.

הזרקה אורתוטופית: השתלת תאים סרטניים ספציפיים לרקמה בעכבר בוגר

בסרטון זה אנו מדגימים את ההליך למתן הזרקה תוך ערמונית של תאי סרטן הערמונית למודל עכבר. מודלים אורתוטופיים של מורין יכולים לשמש לחקר מקור המחלה והתגובה לטיפולים בסביבה לא פולשנית ורלוונטית קלינית.

הזרקה תוך-ערמונית של תאים סרטניים: טכניקה להעברת תאים סרטניים לביסוס מודל עכבר אורתוטופי לסרטן הערמונית

מודל orthotopic זה של סרטן הערמונית אנושי מאפשר כימות של גודל גידול, תאים סרטניים במחזור, והיווצרות של גרורות שונות לריאות. ככל שתאים חייבים לברוח האיבר העיקרי, להזין את זרם הדם, ולהשתיל לאתר משניים, מודל זה ביעילות משחזר את התרחיש בבני אדם.

מודל Murine orthotopic של אדם סרטן ערמונית גרורה

הטכניקה המבוססת לחסן xenografts orthotopic פולשנית העיקרית לסרטן שלפוחית ​​השתן דורשת laparotomy והתגייסות של שלפוחית ​​השתן. הליך זה גורם תחלואה משמעותית בעכברים, הוא מאתגר מבחינה טכנית ודורש זמן רב. לפיכך, אנו פיתחנו דיוק גבוה, בגישה מלעורית ניצול הנחיית אולטרסאונד.

פולשנית הקמת Murine Orthotopic שלפוחית ​​השתן xenografts

הסרטן הוא מחלה מורכבת שמושפעת מהרקמות המקיפות את הגידול, כמו גם המתווכים פרו מקומיים ואנטי דלקתיים. לכן, דגמי הזרקת orthotropic, ולא מודלים תת עורי עשויים להיות שימושיים ללמוד התקדמות הסרטן באופן שהפתולוגיה אנושית מחקה טוב יותר.

הזרקת orthotopic של תאי סרטן השד לחלב שומן Pad של עכברים לחקר התפתחות גידול.

כתב יד זה מפרט שיטה המשמשת ליצירת קסנוגרפלים שמקורם בחולי סרטן הערמונית (PDX) מתאי גידול במחזור (CTCs). יצירת מודלים PDX מ-CTCs מספקת מודל ניסיוני חלופי לחקר סרטן הערמונית; הגידול המאובחן השכיח ביותר וסיבת מוות שכיחה מסרטן אצל גברים.

דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

סרטן הערמונית הוא הגורם השני בשכיחותו למקרי מוות הקשורים לסרטן בארצות הברית. מודל סרטן אורתוטופי מספק גישה שימושית להבנת הביולוגיה של סרטן הערמונית ולהערכת היעילות של משטרי טיפול. פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים הדרושים להקמת מודל עכבר אורתוטופי לסרטן הערמונית.

דגם Murine Orthotopic פרה-קליני של סרטן ערמונית האדם

המטרה של פרוטוקול זה היא להפגין אינטרה-הערמונית הזרקה של תאי סרטן הערמונית, עם סירוס עוקבות. Orthotopic מודלים קליניים של סירוס עמידים ו אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית הם קריטיים כדי לחקור את המחלה בהקשר של microenvironment של הגידול הרלוונטית קלינית, מארח immunocompetent.

דגם Syngeneic Orthotopic זוהרים, פלורסנט מאתר של סירוס עמידים ו אנדרוגן תלויי סרטן הערמונית

גרורות במערכת העצבים המרכזית מודלים PDX מייצגים את המאפיינים הפנוטיפיים והמולקולריים של גרורות אנושיות, מה שהופך אותם למודלים מצוינים למחקרים פרה-קליניים. מתואר כאן כיצד לבסס מודלים PDX ואת מסלולי החיסון המשמשים בצורה הטובה ביותר למחקרים פרה-קליניים.

הקמה וניצול של מודלים Xenograft נגזר המטופל של גרורות במערכת העצבים המרכזית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הזרקת תאי intratibia osteosarcoma כדי ליצור מודלים עכבר הנושאים אוסטאוסרקומה אורתוטופית ונגעים גרורות ריאתיות.

הזרקת תאי אוסטאוסרקומה אינטראטיביאלית להפקת אוסטאוסרקומה אורתוטופית ומודלים של עכבר גרורות ריאות

חקור הזרקה תוך לבבית של תאי PC3 ליצירת מודל עכבר Xenograft לגרורות עצם בסרטן הערמונית. שיטה זו מאפשרת חקירת מנגנונים מולקולריים ובדיקת טיפולים in vivo.

הזרקה תוך לבבית של תאי סרטן ערמונית אנושיים ליצירת גרורות עצם מודל עכבר Xenograft

גלה סרטונים נוספים