יישום של ורמימטריית זרימה לכימות וניתוח של מיקרוביום המעי Caenorhabditis elegans

מיקרוביום המעי ממלא תפקידים חשובים בעיצוב הפיזיולוגיה של הפונדקאי. פרוטוקול זה, בפרט, מאפשר הערכה בתפוקה גבוהה של רמות התיישבות חיידקי מעיים פלואורסצנטיים בבעלי חיים תאיים בודדים בקנה מידה גדול. אחד היתרונות העיקריים של שיטה זו הוא היכולת לנטר את מיקרוביום המעי של בעלי חיים בזמן אמת, מה שמאפשר זיהוי והתאמה של כל שינוי עם הפיזיולוגיה של הפונדקאי.

מי שתדגים את ההליך תהיה דנה בלקבורן, עמיתת מחקר מהמעבדה שלי. התחילו בשטיפת התולעים מהדשא החיידקי עם מיליליטר אחד עד שניים של M9-TX. מעבירים את התולעים לצלחת מעוקרת של שני מיליליטר 96 עמוק היטב.

גלולה אותם ב 300 גרם במשך דקה אחת ולהסיר את הנוזל באמצעות סעפת שאיפה. באמצעות פיפטה רב-ערוצית של 1.2 מיליליטר, הוסף 1.8 מיליליטר של M9-TX לכל באר של צלחת הבאר העמוקה מעורבבת על ידי פיפטינג כמה פעמים וצנטריפוגה ב 300 גרם למשך דקה אחת. לאחר השטיפה הסופית, להביא את נפח כל באר ל 100 מיקרוליטר, באמצעות סעפת שאיפה.

הוסיפו 100 מיקרוליטר של 10 מילימולר levamisole ו-M9-T לכל באר, ואפשרו לתולעים לשתק למשך חמש דקות. לאחר מכן הוסיפו תמיסת אקונומיקה 4% לכל באר למשך שתי דקות כדי להפחית את גושי החיידקים. לאחר הטיפול באקונומיקה, הוסיפו M9-TX לכל באר של הצלחת כדי לשטוף את התולעים.

צנטריפוגו את הצלחת ושאפו לנפח סופי של 100 מיקרוליטר לאחר השטיפה השנייה. מעבירים את התולעים לצלחת באר 96 תחתונה שטוחה, המכילה 150 מיקרוליטר של 10 מילימול של levamisole ו- M9-TX. שמרו על צפיפות התולעים על 50 עד 100 תולעים לבאר ופצלו את התולעים למספר בארות אם האוכלוסייה צפופה מדי.

הפעל את מדחס האוויר, המחשב ומכשיר LPS. בדוק ורוקן את מיכל האשפה. בדוק ומלא מחדש את הנדן ואת מיכלי המים אם הנפח נמוך.

ודא שמכלול הליבה הנוזלית והאופטית של 250 מיקרומטר נמצא במקומו. חבר והפעל את הדוגם האוטומטי. פתח את תוכנת ההתקן autosampler כדי לפתוח את autosampler ואת תוכנת LPS.

בחלון תוכנת LPS, עבור אל קובץ ולחץ על ניסוי חדש, ולאחר מכן בחר קובץ שוב ולחץ על בדיקת דוגמה חדשה. אפשר לייזרים להפעיל לייזרים של 488 ו- 561 ננומטר אם זה עדיין לא נעשה. כעת צור תבניות עבור חלקות נקודות רכישה, תוך שימוש בזמן טיסה, הכחדה ותעלות פלורסנט בחלון תוכנת LPS.

לחצו לחיצה ימנית בתוך גוף התרשים כדי לשנות את קנה המידה. לאחר מכן, טען את דגימות הבקרה. בחלון הדגימה האוטומטית, בחר ראשוני, עבור לקובץ, לחץ על סקריפט פתוח כדי לבחור את הסקריפט המובנה הנכון ולחץ על אישור.

עבור אל תבנית צלחת בתפריט תוכנת הדגימה כדי לבחור את הבארות הרצויות לניתוח. לאחר טעינה ואבטחת הלוחית על במת הדוגם האוטומטי, לחץ על לוחית ההפעלה בחלון הדוגם האוטומטי ושמור את הקובץ כשתתבקש, ולאחר מכן לחץ על לחצן אחסן נתונים נוכחיים ברצועת הכלים העליונה בחלון תוכנת LPS ושמור שוב את הנתונים. פתח את תוכנת LPS.

נווט אל קובץ ובחר ניסוי חדש, ולאחר מכן חזור לקובץ ולחץ על דגימה חדשה. צור תרשים נקודה עם זמן הטיסה על ציר X והכחדה על ציר Y. צור תרשים נקודות נוסף עם זמן הטיסה על ציר X ואדום על ציר Y.

הקפד לבדוק את הפעלת הלייזרים 488 ו- 561 ננומטר. מקם את צינור הדגימה של הבקרה ביציאת הדגימה ולאחר מכן לחץ על רכישה בתיבת הדו-שיח רכישה וניפוק. כשתתבקש, הקפד לשמור את הקובץ.

לאחר שנמדדו מספיק תולעים כדי להבדיל בין אוכלוסיות, בחרו להפיל בחלקת הנקודות המציגה את זמן התעופה לעומת הכחדה. ציירו שער סביב האזור המייצג את האוכלוסייה הבוגרת. לאחר מכן נווט כדי להציג, לחץ על היררכיית gating ובדוק שהשערים הפלואורסצנטיים רשומים כראוי תחת שער האוכלוסייה הבוגרת.

בזמן טיסה לעומת תרשים נקודה אדומה, צרו שערים סביב אזורי הערך האדום הגבוה והנמוך כדי להדגיש את אזורי העניין המראים התיישבות מיקרוביום בתולעים בוגרות. לאחר מיטוב ההגדרות, המשך לקובץ ולחץ על שמור ניסוי, ולאחר מכן לחץ על קובץ ובחר שמור דגימה. כדי לטעון את מנגנון האיסוף, בחר לוחית טעינה A כדי לאפשר לשלב האיסוף לעבור למצב מוכן לטעינת צינור איסוף או צלחת באר 96.

עבור חלוקה צלחת 96 באר, עבור אל סעיף ההתקנה ובחר צלחות, ולאחר מכן לחץ על צלחות מכוילות ובחר צלחת 96 היטב. לאחר מכן, בחר את הבארות שאליהן ימוינו התולעים והזן את מספר החפצים שיש למיין לכל באר. הקפד לציין גם את אזורי העניין המגודרים.

אם ישנם מספר אזורים מגודרים הממוינים לאותה לוחית, הקפד לבדוק את התיבה המסומנת שער כל באר. לחץ על אישור כדי לשמור את השינויים. לאחר מיון מספרים והקצאת המיקומים, טען את הדגימה ליציאת הדגימה ולחץ על כפתורי צלחת המילוי מתיבת הדו-שיח רכישה וחלוקה כדי ליזום חלוקה לצלחת באר 96.

ערכי הארכה וזמן טיסה גבוהים יותר נצפים אצל מבוגרים בהשוואה לזחלים. צאצאים מבוגרים בני יומיים נשלטו על ידי שלבי L1 ו- L2, בעוד שרוב הצאצאים ממבוגרים בני שלושה ימים הגיעו לשלבי L3 ו- L4. כאשר גדלו על E.coli, זמן הטיסה וערכי ההארכה עלו ביום השלישי בהשוואה ליום השני.

כאשר גדלו על ochrobactrum, BH שלוש ותרבויות מעורבות, cenor abdidas allegands הראו הבדלים בזמן הטיסה ואת ערכי ההרחבה. נשאות מוגברת של ochrobactrum BH3 נצפתה במצב מעורב מאשר ב- ochrobactrum BH3 בלבד. לעומת זאת, ערכים ירוקים פלואורסצנטיים הצביעו על נשאות נמוכה יותר של OP50 במצב המעורב מאשר ב-OP50 בלבד.

התולעים מוטות בכבדות לכיוון ציר Y, מה שמרמז על כך שההתיישבות של OP50 נמוכה ברוב התולעים, בעוד שרמות ההתיישבות של אוכרוביקטרום, BH3 מפוזרות באופן שווה באוכלוסייה. כמו כן נצפה הקשר בין אוכרובקטרום, רמות ההתיישבות של BH3 והתפתחות הפונדקאי כגון צפיפות הגוף וההבדלים בדפוסי הרבייה. הבוגרים בני שלושת הימים שגדלו על תערובת שני החברים, מיקרוביום הציג מגוון רחב של עוצמת RFP, מה שמצביע על שינויים אינדיבידואליים בהתיישבות האוכrobactrum בתוך הקבוצה.

מוצגות תמונות RFP של הבארות המכילות 15 תולעים ממוינות ובודדות משערי RFP גבוהים ונמוכים. הדבר החשוב ביותר הוא לזכור להשתמש בבקרות מתאימות עבור כל השלבים כדי להבטיח כי הפרוטוקול והמכונה פועלים כראוי. בזמן אמת, בעלי חיים עם תכונות ספציפיות יכולים לשמש לבידוד זנים ממאגרים של מוטציות פונדקאיות או מיקרוביאליות כדי לזהות גנים המווסתים אינטראקציות פוסט-מיקרוביות.

בעלי חיים מבודדים יכולים לשמש גם לבעל חיים בודד או לבריכה פנוטיפית מועשרת המבוססת על ניתוחים במורד הזרם, כמו RNA-seq וכדומה. באמת, ההזדמנויות הן באמת אינסופיות.