Name: אנליזה חד-תאית של ביטוי גנים של מזרקי Pseudomonas בתוך רקמת הצמח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-10-06T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: למדו שיטה לאנליזת ביטוי גנים ברמת תא בודד של Pseudomonas syringae ברקמת הצמח. השיטה מאפשרת אחזור חיידקים מאפופלסט העלה עם מינימום זיהום משיירי צמח, ומתאימה למחקר אינטראקציות צמח-חיידק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי פרויקט מענק RTI2018-095069-B-I00 במימון MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ ועל ידי "ERDP דרך לעשות אירופה". J.S.R. מומן על ידי Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación (PAIDI 2020). N.L.P. מומן על ידי פרויקט Grant P18-RT-2398 מ-Plan Andaluz de Investigación, Desarrollo e Innovación.

1. הכנת הצמח
<ol><li>הכינו צמחי Arabidopsis Col-0 לפי השלבים הבאים.<ol><li>ממלאים עציץ בקוטר 10 ס"מ בתערובת מצע ורמיקוליט-צמח ביחס 1:3 (ראו טבלת חומרים), שהושקה בעבר, ומכסים את העציץ ברשת מתכת בגודל 15X15 ס"מ עם חורים בגודל 1.6 מ"מ x 1.6 מ"מ. התאימו את רשת המתכת לאדמה הרטובה באמצעות גומייה (איור 1A).</li>
		<li>בעזרת קיסם רטוב, זורעים זרעי Arabidopsis לתוך החורים של רשת המתכת. הניחו שלושה עד ארבעה זרעים במקומות מרוחקים בתוך הסיר (איור 1B, C).</li>
		<li>מכסים את הסירים בכיפת פלסטיק כדי לשמור על לחות יחסית גבוהה ודגרים עליהם במשך 72 שעות ב-4 מעלות צלזיוס לריבוד. הערה: ריבוד (דגירה בלחות גבוהה ובטמפרטורה נמוכה, כמתואר) משפר את קצב הנביטה ואת הסנכרון של הזרעים.</li>
		<li>מעבירים את העציצים לתא גידול צמחים בתנאים קצרים של יום (8 שעות בהירות/16 שעות כהות ב-21°C, עוצמת אור: 100 μmol·m−2·s−1, לחות יחסית: 70%).</li>
		<li>לאחר נביטת זרעים (8-10 ימים), השתמשו בפינצטה כדי להסיר את רוב השתילים, ושמרו שתיל אחד בכל אחד ממיקומי העציץ (שישה שתילים/עציץ) (איור 1D). הסירו את כיפת הפלסטיק כדי לחשוף את הסירים. הערה: הצמחים יהיו מוכנים לשימוש 4-5 שבועות לאחר הנביטה.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו צמחי שעועית Phaseolus vulgaris (זן הפלא הקנדי).<ol><li>מכסים את תחתית צלחת פטרי בחתיכת נייר מגבת רטובה, ומניחים עליה את זרעי הפולים. אטמו את צלחת הפטרי בעזרת סרט כירורגי ודגרו בטמפרטורה של 28°C למשך 3-4 ימים (איור 2A).</li>
		<li>מעבירים את הזרעים המונבטים לעציץ בקוטר 10 ס"מ מלא בתערובת רטובה של מצע צמחי ורמיקוליט ביחס 1:3.</li>
		<li>יש לדגור בתא גידול של צמחים בסביבה של יום ארוך (16 שעות בהירות/8 שעות כהות ב-23°C, עוצמת אור: 100 μmol·m−2·s−1, לחות יחסית: 70%). הערה: הצמחים יהיו מוכנים לשימוש 10 ימים לאחר הנביטה (איור 2B).</li>
	</ol></li>
</ol>2. חיסון של Arabidopsis וצמחי שעועית
הערה: במחקר זה, הזנים P. מזרקים pv. עגבניות DC3000 ו P. מזרקים pv. נעשה שימוש בפאזוליקולה 1448A.
<ol><li>הכינו את P. מזרקים inoculum.<ol><li>פזרו את זן מזרקי P . המעניין ממלאי גליצרול של -80°C על צלחת LB (10 גרם/ליטר טריפטון, 5 גרם/ליטר NaCl, תמצית שמרים 5 גרם/ליטר ואגר בקטריולוגי 16 גרם/ליטר, ראו טבלת חומרים) בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה. לדגור ב 28 ° C במשך 40-48 שעות. הערה: השימוש באנטיביוטיקה מומלץ אם הזן המעניין נושא פלסמיד או גן עמידות גנומית. הריכוזים האנטיביוטיים המומלצים למזרקי P. הם כדלקמן: קנמיצין (15 מיקרוגרם/מ"ל), גנטמיצין (10 מק"ג/מ"ל), אמפיצילין (300 מק"ג/מ"ל) (ראו טבלת חומרים).</li>
		<li>לגרד את הביומסה החיידקית ולהשהות מחדש ב 5 מ"ל של 10 mM MgCl2. מדוד את OD600 והתאם ל- 0.1 על-ידי הוספת 10 mM MgCl2. הערה: OD600 של 0.1 של תרבית מזרקי P . מתאים ל- 5 x 107 CFU·mL−1.</li>
		<li>בצע דילולים סדרתיים לתוך 10 mM MgCl2 כדי להגיע לריכוז החיסון הסופי של 5 x 105 CFU·mL−1. הכינו 200 מ"ל של חיסון עבור צמחי Arabidopsis ו 50 מ"ל עבור צמחי שעועית.</li>
		<li>ממש לפני החיסון, יש להוסיף את חומר פעילי השטח סילווט L-77 (ראו טבלת חומרים) לריכוז סופי של 0.02% לחיסון שעועית ו-0.01% לארבידופסיס. שימו לב שסילווט מזיק במידה מסוימת לרקמת הארבידופסיס.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע חדירת ואקום.<ol><li>במקרה של חדירת ארבידופסיס, הניחו שני מקלות עץ שיוצרים X מעל הסיר (איור 1E), והניחו את הסיר כשהוא פונה כלפי מטה מעל צלחת פטרי בקוטר 14 ס"מ שמכילה את החיסון בנפח 200 מ"ל (איור 1F).</li>
		<li>לחיסון עלי שעועית, הכניסו את העלה לתוך צינור צנטריפוגה חרוטי בנפח 50 מ"ל שמכיל את החיסון (איור 2C).</li>
		<li>הכניסו את הצמחים השקועים בתמיסת האינוקולום לתוך תא ואקום (איור 1G ואיור 2D) ותנו פולס של 500mbar למשך 30 שניות כדי לחדור לעלים. חזרו על פעימת הוואקום 2-3 פעמים עד שהעלה חודר לחלוטין (איור 1H ואיור 2E).</li>
		<li>מסננים את תמיסת החיסון העודפת בעזרת פיסת נייר ומחזירים את הצמחים לתא הגידול המתאים להם.</li>
	</ol></li>
</ol>3. מיצוי חיידקים מהאפופלסט
<ol><li>ארבעה ימים לאחר החיסון, חתכו את החלק האווירי של צמח הארבידופסיס או את העלה המחוסן מצמח השעועית והכניסו אותו למזרק בנפח 20 מ"ל ללא מחט (איור 2G). עבור עלי שעועית, גלגלו את העלה על עצמו, והשאירו את הפנים האבקסיאליות כלפי חוץ, כפי שמוצג באיור 2F.</li>
	<li>מוסיפים נפח מספיק של מים מזוקקים כדי לכסות את הרקמה (בדרך כלל 10-15 מ"ל).</li>
	<li>הכניסו את הבוכנה, וכשהמזרק במצב אנכי כשהקצה מצביע כלפי מעלה, הסירו את עודפי האוויר ובועות האוויר בתוך המזרק על ידי הקשה עדינה על החבית עד שכל האוויר ממוקם ליד הקצה. החלק ואז את הבוכנה כדי להוציא את האוויר החוצה. ברגע שיש כמה שפחות אוויר בתוך המזרק, מכסים את קצה חבית המזרק בסרט פרפין.</li>
	<li>לחצו בזהירות על הבוכנה כדי ליצור לחץ חיובי עד שהרקמה הופכת כהה יותר (איור 1I ואיור 2H). לאחר מכן, משכו את הבוכנה כדי ליצור לחץ שלילי (איור 1J ואיור 2I). חזור על שלב זה 3-5 פעמים.</li>
	<li>הסירו את סרט הפרפין ואת הבוכנה ואספו את הנוזל שמכיל את החיידקים שחולצו באמצעות אפופלסט, כמו באיור 2J.</li>
</ol>4. אנליזה חד-תאית של החיידקים שחולצו על ידי אפופלסט
<ol><li>דמיינו באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי לפי השלבים הבאים.<ol><li>מכינים תמיסת אגרוז 1.5% במים מזוקקים. לאחר ההתכה, הוסיפו מספיק נפח כדי למלא את החלל בין שתי שקופיות מיקרוסקופיות המונחות זו לצד זו והניחו עליהן שקופית נוספת (איור 3). תן להם להתייבש במשך 15 דקות בזהירות להסיר את המגלשה ממוקם על החלק העליון. בעזרת להב, חתכו את כרית האגרוז לחתיכות בגודל 5 מ"מ x 5 מ"מ ממש לפני השימוש.</li>
		<li>במקביל, צנטריפוגה 1 מ"ל של חיידקים שחולצו אפופלסט ב 12,000 x גרם במשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, בזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה, ולהשהות מחדש את הגלולה לתוך 20 μL של מים כדי לרכז את התאים. הניחו טיפה של 2 μL של התאים המרוכזים על משטח כיסוי של 0.17 מ"מ וכסו את הטיפה בחתיכה בגודל 5 מ"מ x 5 מ"מ של כרית האגרוז שהתקבלה קודם לכן בשלב 1, כפי שמיוצג באיור 3.</li>
		<li>דמיינו את תכשיר החיידקים תחת המיקרוסקופ הקונפוקלי (ראו טבלת חומרים). כדי לזהות חיידקים פלואורסצנטיים ירוקים, השתמש בלייזר עירור ב 488 ננומטר ומסנן פליטה הנע בין 500 ננומטר ל 550 ננומטר. כדי לזהות את כל החיידקים, השתמשו בשדה הבהיר ומיזגו את שני השדות.</li>
		<li>עבד את התמונות הקונפוקליות באמצעות פיג'י (ראה טבלת חומרים). כדי לעשות זאת, השתמש בתוסף MicrobeJ כדי לזהות את קווי המתאר של תא החיידק ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות שבתוכו. הערה: רכישת תמונה מחיידקים מבודדים (לא מקובצים) מומלצת לניתוח זה.</li>
	</ol></li>
	<li>בצע ניתוח לפי ציטומטריית זרימה.<ol><li>קח aliquot של תרחיפים חיידקים שחולצו אפופלסט לנתח באמצעות ציטומטר זרימה. לרכוש 100,000 אירועים.</li>
		<li>כדי להבחין בין חיידקים לפסולת צמחים, נתחו את האפופלסט המופק מצמח לא מחוסן והשוו את חלקת הנקודות המציגה את גודל תא הפיזור הקדמי (FSC) לעומת גודל תא הפיזור הצדדי (SSC) לזה של תרחיף החיידקים שחולץ אפופלסט. כדי לזהות חיידקים שאינם פלואורסצנטיים, השתמשו באפופלסטים המופקים מהצמחים שחוסנו בחיידקים איזוגניים שאינם פלואורסצנטיים והשוו את פליטות הפלואורסצנטיות שלהם.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Weigel, W. A., Dersch, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phenotypic+heterogeneity%3A+A+bacterial+virulence+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Microbes+and+Infection%22%5BJournal%5D)">Phenotypic heterogeneity: A bacterial virulence strategy.</a> Microbes and Infection. 20 (9-10), 570-577 (2018).</li>
<li>Hare, P. J., LaGree, T. J., Byrd, B. A., DeMarco, A. M., Mok, W. W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+technologies+to+study+phenotypic+heterogeneity+and+bacterial+persisters%5BTitle%5D)+AND+%22Microorganisms%22%5BJournal%5D)">Single-cell technologies to study phenotypic heterogeneity and bacterial persisters.</a> Microorganisms. 9 (11), 2277(2021).</li>
<li>Mansfield, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Top+10+plant+pathogenic+bacteria+in+molecular+plant+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Top 10 plant pathogenic bacteria in molecular plant pathology.</a> Molecular Plant Pathology. 13 (6), 614-629 (2012).</li>
<li>Morris, C. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+life+history+of+the+plant+pathogen+Pseudomonas+syringae+is+linked+to+the+water+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22The+ISME+Journal%22%5BJournal%5D)">The life history of the plant pathogen Pseudomonas syringae is linked to the water cycle.</a> The ISME Journal. 2 (3), 321-334 (2008).</li>
<li>Rufián, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+microscopy+reveals+in+planta+dynamic+interactions+between+pathogenic%2C+avirulent+and+non-pathogenic+Pseudomonas+syringae+strains%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Pathology%22%5BJournal%5D)">Confocal microscopy reveals in planta dynamic interactions between pathogenic, avirulent and non-pathogenic Pseudomonas syringae strains.</a> Molecular Plant Pathology. 19 (3), 537-551 (2018).</li>
<li>Macho, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subversion+of+plant+cellular+functions+by+bacterial+type-III+effectors%3A+Beyond+suppression+of+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22New+Phytologist%22%5BJournal%5D)">Subversion of plant cellular functions by bacterial type-III effectors: Beyond suppression of immunity.</a> New Phytologist. 210 (1), 51-57 (2016).</li>
<li>Xiao, Y., Hutcheson, S. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+promoter+sequence+recognized+by+a+newly+identified+alternate+sigma+factor+directs+expression+of+pathogenicity+and+host+range+determinants+in+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Bacteriology%22%5BJournal%5D)">A single promoter sequence recognized by a newly identified alternate sigma factor directs expression of pathogenicity and host range determinants in Pseudomonas syringae.</a> Journal of Bacteriology. 176 (10), 3089-3091 (1994).</li>
<li>Rufián, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+chromosome-located+transcriptional+fusions+to+fluorescent+proteins+for+single-cell+gene+expression+analysis+in+Pseudomonas+syringae%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Generating chromosome-located transcriptional fusions to fluorescent proteins for single-cell gene expression analysis in Pseudomonas syringae.</a> Methods in Molecular Biology. 1734, 183-199 (2018).</li>
<li>Rufian, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+syringae+differentiates+into+phenotypically+distinct+subpopulations+during+colonization+of+a+plant+host%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas syringae differentiates into phenotypically distinct subpopulations during colonization of a plant host.</a> Environmental Microbiology. 18 (10), 3593-3605 (2016).</li>
<li>Katagiri, F., Thilmony, R., He, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+interaction%5BTitle%5D)+AND+%22Arabidopsis+Book%22%5BJournal%5D)">The Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae interaction.</a> Arabidopsis Book. 1, 0039(2002).</li>
<li>Fouts, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomewide+identification+of+Pseudomonas+syringae+pv.+tomato+DC3000+promoters+controlled+by+the+HrpL+alternative+sigma+factor%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Genomewide identification of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 promoters controlled by the HrpL alternative sigma factor.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 99 (4), 2275-2280 (2002).</li>
<li>Huber, P. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuber%2C+PJ+%22Robust+Statistics%22">Robust Statistics</a>. , Wiley. New York, NY. (1981).</li>
<li>Freed, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+screen+to+identify+promoters+conferring+high+levels+of+phenotypic+noise%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">A simple screen to identify promoters conferring high levels of phenotypic noise.</a> PLoS Genetics. 4 (12), 1000307(2008).</li>
<li>Hirano, S. S., Upper, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacteria+in+the+leaf+ecosystem+with+emphasis+on+Pseudomonas+syringae-a+pathogen%2C+ice+nucleus%2C+and+epiphyte%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+and+Molecular+Biology+Reviews%22%5BJournal%5D)">Bacteria in the leaf ecosystem with emphasis on Pseudomonas syringae-a pathogen, ice nucleus, and epiphyte.</a> Microbiology and Molecular Biology Reviews. 64 (3), 624-653 (2000).</li>
<li>Lindeberg, M., Myers, C. R., Collmer, A., Schneider, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Roadmap+to+new+virulence+determinants+in+Pseudomonas+syringae%3A+Insights+from+comparative+genomics+and+genome+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Plant+Microbe+Interactions%22%5BJournal%5D)">Roadmap to new virulence determinants in Pseudomonas syringae: Insights from comparative genomics and genome organization.</a> Molecular Plant Microbe Interactions. 21 (6), 685-700 (2008).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bacterial+leaf+infiltration+assay+for+fine+characterization+of+plant+defense+responses+using+the+Arabidopsis+thaliana-Pseudomonas+syringae+pathosystem%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Bacterial leaf infiltration assay for fine characterization of plant defense responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae pathosystem.</a> Journal of Visualized Experiments. (104), e53364(2015).</li>
<li>O'Leary, B. M., Rico, A., McCraw, S., Fones, H. N., Preston, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+infiltration-centrifugation+technique+for+extraction+of+apoplastic+fluid+from+plant+leaves+using+Phaseolus+vulgaris+as+an+example%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">The infiltration-centrifugation technique for extraction of apoplastic fluid from plant leaves using Phaseolus vulgaris as an example.</a> Journal of Visualized Experiments. (94), e52113(2014).</li>
<li>Tornero, P., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+method+for+quantifying+growth+of+phytopathogenic+bacteria+in+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22The+Plant+Journal%22%5BJournal%5D)">A high-throughput method for quantifying growth of phytopathogenic bacteria in Arabidopsis thaliana.</a> The Plant Journal. 28 (4), 475-481 (2001).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

השיטה המוצגת כאן מתארת הליך לא פולשני המאפשר חדירת חיידקים לרקמת העלווה של הצמח, ומאפשר חיסון מהיר של נפחים גדולים תוך מזעור הפרעה לרקמות. אחד המאפיינים של קומפלקס מיני מזרקי P . הוא היכולת לשרוד ולהתרבות בתוך אפופלסט הצמח ועל פני הצמח כאפיפיט14. לפיכך, לא ניתן לשלול את האפשרות שהחיידקים המופקים בפרוטוקול הנוכחי מגיעים רק מהצמח אפופלסט. עם זאת, בעבר הוכח באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי כי שיעור החיידקים על פני העלה הוא מינורי באופן בולט בהשוואה לצמיחת החיידקים בתוך עלההצמח 5<...

חיידקים פתוגניים מציגים הבדלים בפנוטיפים מגוונים, מה שגורם להיווצרות תת-אוכלוסיות בתוך אוכלוסיות זהות גנטית. תופעה זו ידועה בשם הטרוגניות פנוטיפית והוצעה כאסטרטגיית הסתגלות במהלך אינטראקציות חיידקים-מארחים1. ההתקדמות האחרונה ברזולוציה האופטית של מיקרוסקופים קונפוקליים, ציטומטריית זרימה ומיקרופלואידיקה, בשילוב עם חלבונים פלואורסצנטיים, טיפחה אנליזות חד-תאיות של אוכלוסיות חיידקים2.
מזרקי Pseudomonas גראם-שליליים הם חיידקים פתוגניים צמחיים ארכיטיפיים בשל חשיבותם האקדמית והכלכלית3. מחזור החיים של מזרקי P. קשור למחזור המים4. מזרקי P. נכנסים לחללים הבין-תאיים שבין תאי המזופיל, אפופלסט עלה הצמח, דרך פתחים טבעיים כגון פיוניות או פצעים5. ברגע שהוא בתוך האפופלסט, מזרקי P. מסתמכים על מערכת ההפרשה מסוג III (T3SS) ועל המשפיעים המועתקים מסוג III (T3E) כדי לדכא את חסינות הצמח ולתפעל את תפקודי התא הצמחי לטובת הפתוגן6. הביטוי של T3SS ו-T3E תלוי בווסת הראשי HrpL, גורם סיגמא חלופי הנקשר למוטיבים של תיבת HRP באזור המקדם של גני המטרה7.
על ידי יצירת איחוי שעתוק הממוקם בכרומוזומים לגנים חלבוניים פלואורסצנטיים במורד הזרם של הגן המעניין, ניתן לעקוב אחר ביטוי גנים בהתבסס על רמות הפלואורסצנטיות הנפלטות ברמת התא הבודד8. בשיטה זו נקבע כי ביטוי HRPL הוא הטרוגני הן בתרביות חיידקים הגדלות במעבדה והן באוכלוסיות חיידקים שנמצאו מהצמח אפופלסט 8,9. למרות שניתוח ביטוי גנים ברמת התא הבודד מבוצע בדרך כלל בתרביות חיידקים הגדלות באמצעי מעבדה, ניתוחים כאלה יכולים להתבצע גם על אוכלוסיות חיידקים הגדלות בתוך הצמח, ובכך לספק מידע רב ערך על היווצרות תת-אוכלוסיות בהקשר הטבעי. מגבלה פוטנציאלית לניתוח אוכלוסיות חיידקים המופקות מהצמח היא ששיטות חיסון קלאסיות על ידי חדירת לחץ מזרק לאפופלסט, ואחריה מיצוי חיידקים על ידי השרייה של רקמת העלה, מייצרות בדרך כלל כמות גדולה של פסולת צמחית תאית המפריעה לניתוח במורד הזרם10. רוב פסולת התא מורכבת מקטעים אוטופלואורסצנטיים של כלורופלסטים החופפים לפלואורסצנטיות GFP, והתוצאה היא תוצאות מטעות.
הפרוטוקול הנוכחי מתאר את תהליך ניתוח ההטרוגניות של ביטוי גנים חד-תאיים בשתי מערכות מודל: זו שנוצרה על ידי מזרקי P. pv. זן עגבניות DC3000 ו Arabidopsis thaliana (Col-0), והשני על ידי P. מזרקים pv. זן פאזוליקולה 1448A וצמחי שעועית (Phaseolus vulgaris cultivar Canadian Wonder). שיטת חיסון מוצעת המבוססת על חדירת ואקום באמצעות תא ואקום ומשאבה, וכתוצאה מכך שיטה מהירה ונטולת נזקים לחדירת עלים שלמים. יתר על כן, כשיפור לפרוטוקולים הקונבנציונליים, משתמשים בשיטה עדינה יותר למיצוי אוכלוסיית החיידקים מהאפופלסט המפחיתה באופן משמעותי את הפרעה הרקמות, המבוססת על מיצוי נוזל אפופלסטי על ידי הפעלת מחזורים של לחץ חיובי ושלילי באמצעות כמות קטנה של נפח בתוך מזרק.

<table><tbody><tr>כיסוי <td></td><td></td><td>0.17 מ"מ</td><td>ללא דרישות מיוחדות</td></tr><tr><td>1.6 x 1.6 מ"מ רשת מתכת</td><td>Buzifu</td><td></td><td>רשת רשת פיברגלס</td></tr><tr><td>בקוטר 10 ס"מ ללא</td><td></td><td></td><td>דרישות</td></tr><tr><td>מיוחדות צלחות</td><td></td><td></td> פטרי 140 מ"מ <td>ללא דרישות מיוחדות</td></tr><tr><td>מזרק</td><td></td><td></td> 20 מ"ל <td>ללא דרישות מיוחדות</td></tr> צינורות <tr><td>חרוטיים 50 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin נתרן</td><td>GoldBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אגר בקטריולוגי</td><td>Roko</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי Stellaris</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS מנתח תאים מסחרי</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנת</td><td></td><td></td> פיג'י<td></td></tr><tr><td>Gentamycin sulfate</td><td>Duchefa</td><td>G-0124</td><td></td></tr><tr><td>Kanamycin monosulfate</td><td>Phytotechnology</td><td>K378</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney פלסטיק אריזה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מצע</td><td></td><td></td> צמח <td>אין דרישות מיוחדות</td></tr><tr><td>סילווט L-77</td><td>קרומטון אירופה בע"מ</td><td></td><td></td></tr><tr><td>קיסמים</td><td></td><td></td><td>ללא דרישות מיוחדות</td></tr><tr><td></td><td></td><td>פינצטה</td><td></td></tr><tr><td>טריפטון</td><td>מרק</td><td></td><td></td></tr> אין דרישות <tr><td>מיוחדות תא ואקום קוטר 25 ס"מ</td><td>Kartell</td><td>554</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום</td><td>GAST</td><td>DOA-P504-BN</td><td></td></tr><tr><td>ורמיקוליט</td><td></td><td></td><td>ללא דרישות מיוחדות</td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>מרק</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

אנליזה חד-תאית של ביטוי גנים של מזרקי pseudomonas בתוך רקמת הצמח

Single-Cell Analysis of the Expression of Pseudomonas syringae Genes within the Plant Tissue

שפע של מיקרואורגניזמים פתוגניים תוקפים כל הזמן צמחים. קומפלקס מיני מזרקי Pseudomonas כולל חיידקים גראם-שליליים צמחיים-פתוגניים בעלי רלוונטיות מיוחדת למספר רב של פונדקאים. מזרקי P . נכנסים לצמח מפני השטח של העלה ומתרבים במהירות בתוך האפופלסט, ויוצרים מיקרו-מושבות המאכלסות את החלל הבין-תאי. הביטוי המכונן של חלבונים פלואורסצנטיים על ידי החיידקים מאפשר הדמיה של המיקרוקולוניות ומעקב אחר התפתחות הזיהום ברמה המיקרוסקופית. ההתקדמות האחרונה באנליזה של תא בודד חשפה את המורכבות הגדולה שאליה מגיעות אוכלוסיות חיידקים איזוגניים משובטים. מורכבות זו, המכונה הטרוגניות פנוטיפית, היא תוצאה של הבדלים בין תאים בביטוי גנים (שאינם קשורים להבדלים גנטיים) בקרב קהילת החיידקים. כדי לנתח את הביטוי של אתרים בודדים ברמת התא היחיד, נעשה שימוש נרחב באיחוי שעתוק לחלבונים פלואורסצנטיים. בתנאי עקה, כמו אלה המתרחשים במהלך קולוניזציה של אפופלסט הצמח, מזרקי P. מתמיינים לתת-אוכלוסיות נפרדות בהתבסס על ביטוי הטרוגני של גנים אלימים מרכזיים (כלומר, מערכת ההפרשה מסוג Hrp III). עם זאת, ניתוח חד-תאי של כל אוכלוסיית מזרקי P . נתונה שהתאוששה מרקמת הצמח הוא מאתגר בשל הפסולת התאית המשתחררת במהלך השיבוש המכני המהותי לתהליכי החיסון ומיצוי החיידקים. הדו"ח הנוכחי מפרט שיטה שפותחה כדי לעקוב אחר ביטוי של גנים בעלי עניין של P. syringae ברמת התא הבודד במהלך ההתיישבות של Arabidopsis וצמחי שעועית. מתוארים הכנת הצמחים והתרחיפים החיידקיים המשמשים לחיסון באמצעות תא ואקום. ההתאוששות של חיידקים אנדופיטיים מעלים נגועים על ידי מיצוי נוזל אפופלסטי מוסברת גם כאן. הן שיטות החיסון החיידקי והן שיטות מיצוי החיידקים ממוטבות אמפירית כדי למזער את הנזק לצמחים ולתאי חיידקים, וכתוצאה מכך ההכנות החיידקיות אופטימליות למיקרוסקופיה ולניתוח ציטומטריית זרימה.

ביטוי מערכת ההפרשה מסוג III חיוני לצמיחת חיידקים בתוך הצמח. הביטוי בזמן של גנים T3SS מושג באמצעות ויסות מורכב, שבמרכזו גורם הסיגמה של הפונקציה החוץ-ציטופלזמית (ECF) HrpL, המפעיל העיקרי של ביטוי גנים הקשורים ל- T3SS11. ניתוח הביטוי של hrpL בוצע בעבר באמצעות איחוי שעתוק הממוקם כרומוזום לגן gfp ללא מקדם במורד הזרם ועל ידי מעקב אחר דפוסי הביטוי על ידי מיקרוסקופ קונפוקלי וציטומטריית זרימה9. איחויים אלה נוצרים באמצעות אינטגרציה הומולוגית בתיווך רקומינוס של מבנים...

הפרוטוקול הנוכחי מתאר שיטה המאפשרת ניתוח ביטוי גנים של תא בודד על אוכלוסיות מזרקי Pseudomonas הגדלות בתוך אפופלסט הצמח.

אנליזה חד-תאית של ביטוי גנים של מזרקי Pseudomonas בתוך רקמת הצמח

A plethora of pathogenic microorganisms constantly attack plants. The Pseudomonas syringae species complex encompasses Gram-negative plant-pathogenic ...

הפרוטוקול שלנו מספק שיטת חיסון ומיצוי צמחית עדינה המאפשרת לשחזר אוכלוסיות חיידקים הגדלות באפופלסט העלה המתאים לניתוח ביטוי גנים של תא בודד כגון ציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת מיצוי של כמות ניכרת של חיידקים מהאפופלסט מבלי לזהם משמעותית את הדגימות בפסולת תאית צמחית. שיטה אופטימלית זו לשחזור חיידקים אפופלסטיים יכולה להיות מיושמת ישירות או עם שינויים קלים במספר מערכות חיידקים צמחיות הכוללות חיידקים פתוגניים צמחיים או חיידקים אנדוציטיים מועילים.מי שתדגים את ההליך תהיה ניבס לופז-פגאן, דוקטורנטית מהמעבדה שלנו. כדי להתחיל, מלאו עציץ בקוטר 10 ס"מ בתערובת מצע צמחי ורמיקוליט 1:3 שהושקה בעבר. מכסים את העציץ ברשת מתכת מחוררת ומתאימים את רשת המתכת לאדמה הרטובה באמצעות גומייה.לאחר מכן, לזרוע זרעי Arabidopsis לתוך החורים של רשת מתכת עם קיסם רטוב. מניחים שלושה-ארבעה זרעים במקומות מרוחקים בתוך העציץ. מכסים את הסיר בכיפת פלסטיק כדי לשמור על לחות יחסית גבוהה ודגרים לריבוד בארבע מעלות צלזיוס למשך 72 שעות.מעבירים את העציץ לתא גידול של הצמח בתנאים קצרים. כדי לחשוף את הסיר, הסירו את כיפת הפלסטיק. לאחר שהזרעים נובטים, השתמשו בפינצטה כדי להסיר את רוב השתילים, תוך שמירה על שתיל אחד בכל אחד ממיקומי העציץ.לאחר מכן הכינו צמחי שעועית Phaseolus vulgaris על ידי כיסוי תחתית צלחת פטרי בחתיכת מגבת נייר רטובה והנחת זרעי השעועית מעליה. אוטמים את צלחת הפטרי בסרט כירורגי ודגרים בחום של 28 מעלות צלזיוס למשך שלושה עד ארבעה ימים. מעבירים את הזרעים המונבטים לעציץ בקוטר 10 ס"מ מלא בתערובת רטובה של מצע צמחי ורמיקוליט ביחס 1:3 ודגרים בתא גידול של צמחים בתנאים ארוכי יום.פזרו את מלאי הגליצרול של זן מזרקי Pseudomonas המעניין ממינוס 80 מעלות צלזיוס לתוך צלחת LB בתוספת אנטיביוטיקה מתאימה. לדגור על הצלחת ב 28 מעלות צלזיוס במשך 40 עד 48 שעות. לגרד את הביומסה החיידקית ולהשהות אותה מחדש בחמישה מיליליטר של מגנזיום כלורי 10 מילימולרי.מדוד את הצפיפות האופטית ב- 600 ננומטר והתאם אותה ל- 0.1 על ידי הוספת מגנזיום כלורי 10 מילימולרי. בצע דילולים סדרתיים במגנזיום כלורי של 10 מילימולר כדי לקבל ריכוז חיסוני סופי של פי חמש פי 10 עד החמישי CFU למיליליטר. לאחר מכן, להכין 200 מיליליטר של inoculum עבור צמחי Arabidopsis ו 50 מיליליטר עבור צמחי שעועית.לפני החיסון, יש להוסיף את חומר פעילי השטח סילווט L-77 לריכוז סופי של 0.02% לחיסון שעועית ו-0.01% לארבידופסיס. לחדירת ארבידופסיס מניחים שני מקלות עץ היוצרים X מעל הסיר ומניחים את הסיר עם הפנים כלפי מטה מעל צלחת פטרי בקוטר 14 ס"מ המכילה 200 מיליליטר אינקולום. לחיסון עלי שעועית, הכניסו את הצמחים ואת תמיסת האינקולום לתא ואקום והכניסו את העלה לצינור צנטריפוגה חרוטי של 50 מיליליטר המכיל את החיסון.תן דופק של 500 מיליבר במשך 30 שניות כדי לחדור את העלים. מסננים את תמיסת החיסון העודפת בעזרת פיסת נייר ומחזירים את התוכניות לתא הגידול המתאים להן. ארבעה ימים לאחר החיסון, חותכים את החלק האווירי של צמח הארבידופסיס או את העלה המחוסן מצמח השעועית ומניחים אותו במזרק של 20 מיליליטר ללא מחט.עבור עלי שעועית, לגלגל את העלה על עצמו, משאיר את הפנים abaxial כלפי חוץ. מוסיפים מספיק נפח של מים מזוקקים כדי לכסות את הרקמה. לאחר מכן, הכנס את הבוכנה המחזיקה את המזרק במצב זקוף והסר את עודפי האוויר ובועות האוויר בתוך המזרק על ידי הקשה עדינה על החבית עד שכל האוויר ממוקם ליד הקצה, ולאחר הסרת האוויר, כסה את קצה חבית המזרק בסרט פרפין.עכשיו בזהירות לחץ על הבוכנה כדי ליצור לחץ חיובי עד הרקמה הופך כהה יותר. לאחר מכן, משוך את הבוכנה כדי ליצור לחץ שלילי. הסר את סרט הפרפין ואת הבוכנה ולאסוף את הנוזל המכיל את החיידקים שחולצו אפופלסט.לאנליזה של תא בודד, הכינו תמיסת אגרוז של 1.5% במים מזוקקים. לאחר ההמסה, הוסף מספיק נפח כדי למלא את החלל בין שתי שקופיות מיקרוסקופיה המונחות זו לצד זו והניחו שקופית נוספת למעלה. תן להם לנהוג במשך 15 דקות והסר את המגלשה שהונחה על החלק העליון בזהירות.בעזרת להב, חותכים את כרית האגרוז לחמישה מילימטר על חמישה מילימטר לפני השימוש. במקביל, צנטריפוגה מילימטר אחד של החיידק המופק אפופלסט. בזהירות להסיר את supernatant באמצעות פיפטה ו resuspend את הגלולה לתוך 20 מיקרוליטר מים כדי לרכז את התאים.מניחים טיפה של שני מיקרוליטר של התאים המרוכזים על מכסה 0.17 מ"מ ומכסים את הטיפה עם חתיכת כרית אגרוז. דמיינו את הכנת החיידקים תחת המיקרוסקופ הקונפוקלי כדי לזהות חיידקים פלואורסצנטיים ירוקים באמצעות לייזרים ספציפיים. זהה את כל החיידקים באמצעות השדה הבהיר ומיזג את שני השדות.כדי לבצע ניתוח על ידי ציטומטריית זרימה, לקחת aliquot של תרחיפים חיידקים אפופלסט. לנתח באמצעות ציטומטר זרימה ולרכוש 100, 000 אירועים. ביטוי של hrpL GFP מנוטר על ידי פלואורסצנטיות GFP.גרפי תרשים הנקודות מראים את התפלגות עוצמת הפלואורסצנטיות של GFP לעומת גודל התא באוכלוסייה, ואילו ההיסטוגרמות מראות את עוצמת הפלואורסצנטיות של GFP לעומת ספירת תאים. אחוזי hrpL ON היו גבוהים מהאחוזים המקבילים של hrpL OFF. תמונות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מראות רמות הטרוגניות של GFP הקשורות לביטוי של hrpL.החיידקים המציגים פלואורסצנטיות GFP נמוכה או ללא פלואורסצנטיות נצפים. לקבלת תוצאות מיטביות, היו עדינים במהלך שלבי מיצוי החיידקים כדי למנוע פגיעה ברקמת הצמח ובכך להגביל את הזיהום מתכולת תאי הצמח. דגימות החיידקים המתקבלות יכולות לשמש למטרות אחרות שבהן הפחתת זיהום הצמח היא יתרון, כגון מיצוי חומצות גרעין לניתוח גנומי חיידקי או שעתוק לאחר מכן.

single-cell-analysis-expression-pseudomonas-syringae-genes-within

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

הבסיס המולקולרי של מרחבי ספציפי התגובות phytochrome נחקרת באמצעות הצמחים הטרנסגניים כי התערוכה רקמות איברים ספציפיים ליקויים phytochrome. הבידוד של תאים ספציפיים מציג המושרה דלדול chromophore phytochrome על ידי תא הקרינה המופעל מיון ואחריו מנתח microarray הוא מנוצל כדי לזהות גנים המעורבים מרחבית ספציפית התגובות phytochrome.

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

כמותי בזמן אמת PCR (qRT-PCR) היא כלי יעיל לאבחון רמות ה-mRNA ברקמות חרקים שונים, שלבי התפתחות. בדוח זה אנו מציגים את השימוש qRT-PCR כדי לברר רמות ה-mRNA ברקמות הזחל שונים שלבי ההתפתחות של מינים פולשניים חרקים, דקור ברקת אפר.

ניתוח של ביטוי גנים בורר אש אמרלד ( Agrilus planipennis) באמצעות Real Time-PCR כמותי

ניתוח ספציפי של תא<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; עלים באמצעות מיון תא הופעל פלואורסצנטי

מקור: Lee, H. et al., מערכת חלבון פלואורסצנטי ירוקה מפוצלת להדמיית אפקטורים המועברים מחיידקים במהלך זיהום. J. Vis. Exp. (2018)סרטון זה מדגים שיטה לניטור זיהום חיידקי ואספקת חלבון אפקטור בתאי צמחים באמצעות השלמת חלבון פלואורסצנטי ירוק מפוצל (sfGFP) בשילוב עם מיקרוסקופיה קונפוקלית. הגישה מאפשרת הדמיה מדויקת של טרנסלוקציה של אפקטור לציטוזול התא המארח.

ניטור זיהום חיידקי ואספקת חלבון אפקטור בתאי הצמח

מקור: Rufián, J. S. ואחרים, ניתוח תא יחיד של ביטוי גנים של Pseudomonas syringae ברקמת הצמח. J. Vis. Exp. (2022)הסרטון הזה מדגים שיטת לחץ מבוססת מזרק להפקת חיידקים אפופלסטיים, המתרבים ויוצרים מיקרוקולוניות בתוך אפופלסט, המרחב הבין-תאי בין תאי הצמח. השיטה מניבה דגימות חיידקים נטולות פסולת, המתאימות לניתוח תא יחיד במורד הזרם.

חילוץ חיידקים אפופלסטיים באמצעות שיטת לחץ מבוססת מזרקים

מקור: רופיאן, י. ס. ואחרים. ניתוח תא יחיד של ביטוי גני Pseudomonas syringae ברקמת הצמח. J. Vis. Exp. (2022).סרטון זה מדגים שיטה לניתוח ביטוי גנים בחיידקים פתוגניים שמופקים מצמחים ברמת תא יחיד באמצעות פקטור שעתוק פלואורסצנטי. הדמיה קונפוקלית חושפת הטרוגניות בביטוי גנים של אלימות, ומדגיש גיוון פונקציונלי בתוך אוכלוסיית חיידקים משובטים.

ניתוח ביטוי גנים בתא יחיד מפתוגנים שמופקים על ידי צמחים

Source: Liu, X., et al. Bacterial Leaf Infiltration Assay for Fine Characterization of Plant Defense Responses using the Arabidopsis thaliana-Pseudomonas syringae Pathosystem. J. Vis. Exp. (2015).This video demonstrates a method to assess the bacterial load in Arabidopsis thaliana leaves infected with Pseudomonas syringae. Leaf discs from infected leaves are homogenized, serially diluted, and plated onto nutrient-rich agar to promote bacterial colony formation. Colony counts are then used to...

Assessing Pseudomonas syringae Infection Load in Arabidopsis thaliana Leaves

כימות צמיחת פתוגנים הוא כלי רב עוצמה לאפיון תגובות חיסוניות שונות של Arabidopsis thaliana (להלן: Arabidopsis). השיטה המתוארת כאן מציגה בדיקת חדירת מזרק אופטימלית לכימות Pseudomonas syringae pv. מקוליקולה גידול ES4326 בעלים בוגרים של Arabidopsis.

חיידקי עלה הסתננות Assay עבור אפיון פיין של תגובות הצמחים ביטחון באמצעות<em&gt; Thaliana-Pseudomonas ארבידופסיס syringae</em&gt; Pathosystem

המטרה של פרוטוקול המובאת כאן היא ללמוד תגובת transcriptomic בודדים endosphere Bacillus mycoides תפוחי אדמה השורש exudates. שיטה זו מקלה על הזיהוי של גנים חיידקיים חשוב מעורב אינטראקציות צמח-חיידק, באופן עקרוני החלים endophytes וצמחים אחרים, עם התאמות קלות.

צמח-חיידק האינטראקציה: תעתיק בתגובה של Bacillus Mycoides תפוחי אדמה שחורה Exudates

גישות מבוססות חלבון פלואורסצנטי לפקח effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התאים המארחים הם מאתגרים. זאת בשל בעיית אי התאימות בין חלבונים פלורסנט ומערכת ההפרשה סוג-III. כאן, מערכת ה-GFP פיצול ממוטב superfolder משמש עבור ויזואליזציה של effectors מופרש על ידי חיידקים לתוך התא הצמח הפונדקאי.

מערכת חלבון פלואורסצנטי ירוק לדמיין Effectors מועברת בין חיידקים במהלך זיהום

כאן, אנו מציגים שיטת הקרנה שונה שניתן להשתמש בהרחבה כדי להקרין במהירות RNA השתקה דכאי במחלות צמחים.

הקרנה וזיהוי של רנ א השתקה דכאי מ מופרש העריקים של פתוגנים צמח

למדו שיטה לאנליזת ביטוי גנים ברמת תא בודד של Pseudomonas syringae ברקמת הצמח. השיטה מאפשרת אחזור חיידקים מאפופלסט העלה עם מינימום זיהום משיירי צמח, ומתאימה למחקר אינטראקציות צמח-חיידק.

אנליזה חד-תאית של ביטוי גנים של מזרקי Pseudomonas בתוך רקמת הצמח

גלה סרטונים נוספים