הכנת דגימה ללכידת תרחיף חלבונים עבור פרוטאומיקה של דמעות על ידי כרומטוגרפיה נוזלית-ספקטרומטריית מסה טנדם
1 בדצמבר 2023
פרוטוקול זה מתאר שיטה לאיסוף דגימות דמעות באמצעות רצועות Schirmer ותהליך עבודה כמותי משולב לגילוי סמנים ביולוגיים לא פולשניים של חלבון דמעות. תהליך העבודה של הכנת דגימת לכידת מתלים מאפשר הכנת דגימת דמעות מהירה וחזקה וניתוח ספקטרומטרי מסה, וכתוצאה מכך תפוקות שחזור פפטידים וזיהוי חלבונים גבוהים יותר מאשר הליכים סטנדרטיים בתמיסה.
מטרת המחקר שלנו היא להדגים את השימוש בהכנת דגימת לכידת תרחיף חלבון, המכונה מלכודת S למחקר מבוסס ספקטרומטריית מסות. פרוטוקול זה משתמש בהכנת דגימה מהירה, ניתנת לשחזור ומתוקננת של דגימת נוזל דמעות אנושי שנאספה באמצעות מחקר תרגומי ברפואת עיניים. נוזל דמעות אנושי הוא נוזל גוף שניתן לאסוף לבדיקות מולקולריות לא פולשניות ברפואת עיניים.
יש הרבה שיטות סטנדרטיות של איסוף נוזל דמעות והכנת דגימה, שהן קריטיות למחקר קליני מוצלח של מחלות ותנאים. שיטות לא סטנדרטיות קשות להשוואה ולפירוש בין מתודולוגיות ולכן משפיעות על התוצאות הכימיות. פרוטוקול זה מאפשר דגימה ואחסון של נוזלי גוף הדמעות בטמפרטורת החדר.
זה עוזר עם איסוף דוגמאות ומשלוח קלים יותר. הוא מספק מיצוי פפטידים מהיר וחזק לניתוח ספקטרומטר מסות, המשפר את התאוששות הפפטידים. פרוטוקול זה כולל שלבי הכנת מדגם מינימליים כדי למזער שגיאות ואי ודאויות.
הביצועים המהירים והמעולים של זיהוי וכימות חלבונים על ידי ספקטרומטריית מסות יקלו על רופאים וחוקרים בפיתוח בדיקות מולקולריות לא פולשניות. אופטימיזציה של הכנת הדגימה תמיד תהיה אחד השלבים הקריטיים. ללא קשר לשיטת האיתור, הערך הקליני של נוזל הדמעות האנושי טרם נחקר במלואו.
יש לקוות ששיטת הכנת דוגמת ההצעה תפתח את הדלת ליישום קליני פוטנציאלי בעתיד הקרוב.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מפרט שיטה לאיסוף דגימות דמעות אנושיות באמצעות רצועות שירמר (Schirmer strips) וזרימת עבודה סטנדרטית לזיהוי סמנים ביולוגיים של חלבוני דמעות בשיטה לא פולשנית. הכנת הדגימה באמצעות לכידת תליה (suspension trapping) משפרת את התשואה של הפפטידים ואת זיהוי החלבונים באמצעות ספקטרומטריית מסות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- רפואת עיניים
- ספקטרומטריית מסות
- גילוי סמנים ביולוגיים
רקע
- נוזל דמעות אנושי הוא נוזל ביולוגי בעל ערך לבדיקות מולקולריות לא פולשניות.
- חסרות שיטות סטנדרטיות לאיסוף והכנה של נוזל דמעות.
- שיטות שאינן סטנדרטיות מעכבות את היכולת להשוות בין מחקרים קליניים.
- פרוטוקול זה מאפשר אחסון של דגימות דמעות בטמפרטורת החדר.
מטרת המחקר
- ביסוס שיטה מהימנה לאיסוף וניתוח של נוזל דמעות.
- שיפור מיצוי פפטידים וזיהוי חלבונים בספקטרומטריית מסות.
- סיוע בפיתוח של בדיקות מולקולריות לא פולשניות במסגרות קליניות.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- איסוף דגימות דמעות באמצעות רצועות שירמר (Schirmer strips).
- הכנת דגימות באמצעות מתודולוגיית לכידת תליה (S-Trap).
- ניתוח ספקטרומטריה של מסות לזיהוי חלבונים.
- פרוטוקולים סטנדרטיים להפחתת שגיאות ואי-ודאויות.
תוצאות עיקריות
- סך של 1,183 חלבונים זוהו באמצעות שיטת S-Trap.
- 874 חלבונים זוהו באמצעות פרוצדורות סטנדרטיות בתמיסה (in-solution).
- ניתוח אונטולוגיה של גנים הראה תפקודי פרוטאומיקה דומים בין השיטות.
- הושגו שיפור בהתאוששות וזיהוי של פפטידים באמצעות הפרוטוקול החדש.
מסקנות
- שיטת ה-S-Trap מספקת גישה חסונה לניתוח דגימות דמעות.
- סטנדרטיזציה באיסוף נוזל דמעות עשויה לשפר תוצאות קליניות.
- פרוטוקול זה עשוי להוביל ליישומים חדשים ברפואת עיניים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הכנה סטנדרטית של דגימות בעלת תפוקה גבוהה עבור פרוטאומיקה של דמעות נותנת מענה לבקבוק קריטי בגילוי סמנים ביולוגיים לא פולשניים למחלות עיניים. זרימת העבודה של לכידה בסספנסיה (S-Trap) משפרת את השחזוריות ואת זיהוי החלבונים, ובכך תומכת במחקר תרגומי ובהמשכיות תהליכי הפיתוח. גישה זו מאפשרת ניתוח חסון וניתן להרחבה של נוזל דמעות לצורך תיקוף סמנים ביולוגיים בשלבים מוקדמים ומיון פורטפוליו במחקר ופיתוח (R&D) בתחום הפתלוגיה של העין.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה סיסטמטית של פרוטאומי נוזל הדמעות לצורך זיהוי מועמדים לסמני ביולוגיים הרלוונטיים למחלה.
- מפחית שונות ביולוגית וטכנית, ובכך תומך בתיקוף של מטרות פונקציונליות.
- משפר את רמת הביטחון החזויה בבחירה ותיעדוף של סמנים ביולוגיים בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת הכנות פפטידים סטנדרטיות וניתנות לשחזור עבור תהליכי עבודה המשכיים של ספקטרומטריית מסות.
- מקלה על זיהוי חלבונים כמותי ובספיקת תפוקה גבוהה לצורך פיתוח בדיקות.
- תומכת במדרגיות של הבדיקה ובניתבוי להשוואה בין מחקרים באמצעות מזעור שגיאות בהכנת הדגימות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים דגימה לא פולשנית של דמעות לאסטרטגיות של סמנים ביולוגיים תרגומיים באופתלמולוגיה.
- מאפשר רציפות מאיסוף דגימות קליני ועד לתיקוף פרה-קליני של סמנים ביולוגיים מועמדים.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות אספקת נתונים פרוטאומיים חסונים.
שילוב תהליכי עבודה ופייפליין
פרוטוקול זה, המבוסס על S-Trap, משלב את התהליך החל מאיסוף דגימה קלינית ועד לזיהוי חלבונים באמצעות ספקטרומטריית מסות, ובכך הוא תומך בזרימות עבודה החל משלב הגילוי המוקדם ועד למחקר תרגומי.
- ביולוגיה של תגליות: מספקת הפקת חלבונים סטנדרטית בעלת תפוקה גבוהה עבור מחקרי ביומרקרים מונחי-השערה.
- סריקה: מבטיחה תוצרי פפטידים כמותיים וניתנים לשחזור עבור פיתוח מאסייים מהימן.
- אנליזה: מאפשרת כימות חלבונים חסון ואנליזה השוואית בין תנאים שונים.
- מחקר תרגומי: מגשר בין רכישת דגימות קליניות לבין תיקוף ביומרקרים פרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמה אוניברסלית וממוטבת להכנת דגימות עבור פרוטאומיקה של דמעות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בגילוי סמנים ביולוגיים.
- ערך תפעולי: מספק הכנת דגימות מהירה, הניתנת לשחזור וניתנת להרחבה עבור ספקטרומטריית מסות.
- ערך אסטרטגי: תומך בקבלת החלטות יעילה של המשך/עצירה (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלב מאוחר בתיקי פיתוח בתחום האופתלמולוגיה.
- השפעה על תיק הפיתוח: מאפשר תעדוף של מועמדים לסמנים ביולוגיים המותאם לסיכון לצורך פיתוח נוסף.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתהליכי פרוטאומיקה וספקטרומטריית מסות.
- דורש גישה לעמודי S-Trap ולמכשור אנליטי תואם.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים לאיסוף ועיבוד דגימות.
- ניתן להתאמה לסוגי דגימות שונים של נוזלים ביולוגיים באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- תלוי בטיפול קפדני בדגימות כדי למזער זיהומים ושונות.
