Name: הכנת תרחיף חד-תאי ממעי אמנון הנילוס לריצוף חד-תאי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: למדו הכנת תרחיף חד-תאי מאיכות גבוהה ממעי אמנון הנילוס (Oreochromis niloticus) לריצוף חד-תאי. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לחקר ביולוגיה ימית ודגי מאכל.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מבקשים להכיר בתמיכת הקרן למדעי הטבע של מחוז היינאן של סין (NO. 320QN211) ותוכנית קרן המחקר של מעבדת המפתח המחוזית של גואנגדונג לבקרת מחלות בעלי חיים ימיים ותרבות בריאה של סין (NO. PBEA2021ZD01).

כל הפרוטוקולים של בעלי חיים במהלך מחקר זה אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת היינאן (מספר פרוטוקול: HNUAUCC-2022-00063; תאריך אישור: 2022-03-03). רשימה של הציוד והאספקה ששימשו בניסוי זה ניתן למצוא בטבלת החומרים. סיכום הפרוטוקול הנוכחי מתואר באיור 1.
1. הכנת דגים
<ol><li>להשיג אמנון נילוס בן 6 חודשים עם משקל גוף ממוצע של 100 גרם ממקור אמין. בחר דגים ללא כל סימני מחלה.</li>
	<li>הפסיקו להאכיל את הדגים 24 שעות לפני שתמשיכו לשלב הבא. הערה: צום דגים מפחית את נפח תוכן המעי ומקל על הכנת מקטעי מעיים.</li>
	<li>שטפו את הדגים במים סטריליים מאווררים היטב במשך 15 דקות כדי לשטוף חיידקים הקשורים באופן רופף על פני הגוף.</li>
	<li>הרדימו את הדג עם 300 מ"ג/ליטר טריקאין מתאן-סולפונט (MS-222) למשך כ-10 דקות עד שכל התנועה תיפסק.</li>
</ol>2. הכנת מגיב
<ol><li>הכן 0.08% מלח חוצץ פוספט של BSA-Dulbecco (BSA-DPBS, לשטיפת תאים והשעיה). יש להמיס 0.08 גרם BSA (0.8% w/v) ב-100 מ"ל של DPBS אחד. יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C ולקרר מראש על קרח בעת השימוש. הערה: התוספת של BSA מועילה למזעור גושי תאים. ניתן להגדיל את יחס BSA מ -0.04% ל -1% בהתאם לתנאי גושי התא.</li>
	<li>הכינו את מגיב הדיסוציאציה האנזימטי של התא.<ol><li>לדלל את collagenase / dispase עם 1x PBS לריכוז סופי של 1 מ"ג / מ"ל (0.1 U/mL collagenase ו 0.8 U/mL dispase). ודא שנעשה שימוש ב- PBS ולא ב- DPBS. הערה: PBS מספק את יוני הסידן הדרושים לתפקוד תקין של האנזים. אין להשתמש ב- DPBS בשלב זה מכיוון שהוא נטול Ca 2+/Mg2+. בנוסף, collagenase סוג I משמש בפרוטוקול הנוכחי.</li>
		<li>מסננים את הדילול דרך מסנן קרום סטרילי של 0.22 מיקרומטר.</li>
		<li>הכינו מגיב דיסוציאציה תאי המורכב מנפח של 95% של תמיסת קולגן/דיספאס ונפח של 5% של סרום בקר עוברי (FBS). הערה: מגיב הדיסוציאציה צריך להיות טרי בכל פעם שהוא בשימוש. שימוש ב-5% FBS מסייע לשמור על יכולת הקיום של התא במהלך העיכול.</li>
	</ol></li>
	<li>הכינו תמיסת טריפאן כחולה.<ol><li>קח את הפתרון הכחול טריפאן מן המקרר 4 ° C, ולשמור אותו על 15-20 ° C במשך כמה דקות לפני השימוש כדי למנוע משקעים.</li>
		<li>סנן את התמיסה דרך קרום סטרילי של 0.22 מיקרומטר.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הכנת ציוד
<ol><li>מצננים מראש את הצנטריפוגה בקירור ל-4°C לפני השימוש.</li>
	<li>השג צינורות צנטריפוגות סטריליים ללא RNase 1.5 מ"ל, צינורות חרוטיים 50 מ"ל, פיפטות וקצוות זכוכית רחבים, מסנני ממברנה, מסננות תאים וכל צינורות השימור הנמוכים והקצוות.</li>
	<li>פיפטות זכוכית אוטוקלאביות וכלי דיסקציה, כולל מלקחיים, מספריים ואזמלים, ולטפל בהם מראש עם תמיסת הסרת RNase כדי למנוע את ההשפעות השליליות של RNase עבור RNA-seq תא יחיד.</li>
</ol>4. דיסקציה של רקמות ודיסוציאציה של תאים
<ol><li>הניחו את הדג המרדים על קרח לנתיחה. Aseptically, לאסוף 3-4 ס"מ של החלק האמצעי של המעי, הבלו כמו שומן mesentery ככל האפשר. בזהירות להסיר את השומן מחובר פני השטח של המעי ואת שכבת רירית אלסטי גמיש ברור עם מלקחיים. הערה: השומן והמזנטריה מחוברים לפני השטח החיצוניים של המעי.</li>
	<li>הסר כמה שיותר שומן כדי למנוע את ההשפעות השליליות שלה על פרוטוקול הדיסוציאציה. באמצעות מזרק, לשטוף בעדינות את השברים עם PBS סטרילי קר כקרח מספר פעמים כדי לשטוף את תוכן המעי ואת הריר. הימנע מטיפול גס.</li>
	<li>לנתח את קטע המעי לחתיכות קטנות, ולהעביר אותם צינור 1.5 מ"ל מלא 1 מ"ל של PBS קר כקרח.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F). הסר את הסופרנאטנט בעדינות, והחלף ב-1 מ"ל של 0.08% BSA-DPBS קר כקרח. השהה מחדש את שברי הרקמה על ידי שאיפה עדינה באמצעות פיפטה זכוכית. חזור על שלב זה פעמיים.</li>
	<li>הסר את supernatant, ולעכל את שברי הרקמה באמצעות 1 מ"ל של מגיב דיסוציאציה אנזימטי (950 μL של collagenase / dispase פתרון ו 50 μL של FBS) באמבט מים 37 ° C במשך 30-60 דקות.<ol><li>בנוסף, הוסף 5 μL של מעכב RNase (40 U/μL בתמיסת המלאי) למגיב הדיסוציאציה אם הדגימות מוכנות לריצוף RNA חד-תאי. הערה: הריכוז הסופי של תערובת collagenase/dispase הוא 1 מ"ג/מ"ל, כולל collagenase ב-0.1 U/mL ו-dispase ב-0.8 U/mL.</li>
	</ol></li>
	<li>הפוך ידנית את הצינור במרווחים של 5 דקות במהלך אמבט המים של 30-60 דקות. הערה: זמן הדגירה המדויק משתנה בהתאם לרקמות המשמשות. בדוק את התקדמות הדיסוציאציה תחת מיקרוסקופ עד שלא נראית רקמה בתפזורת. מניחים 10 μL של תרחיף התא על מגלשת זכוכית עם פיפטה, ולבחון אותו תחת המיקרוסקופ. הגדל את זמן העיכול אם התאים אינם מנותקים לחלוטין.</li>
	<li>סובב את הצינורות ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C, ובעדינות להסיר את מגיב דיסוציאציה תאים אנזימטי באמצעות קצוות רחבים. הוסיפו 1 מ"ל של BSA-DPBS 0.08% קר כקרח, והפייטו בעדינות את התאים מעלה ומטה באמצעות פיפטה רחבה מזכוכית למשך דקה אחת.<ol><li>חזור על שלב זה פעמיים. הערה: יש לבצע את הפיטינג למעלה ולמטה בזהירות באמצעות קצוות רחבים ובעלי שימור נמוך כדי למנוע הפרעה לתאים.</li>
	</ol></li>
	<li>הרטיבו מראש מסננת תאים בגודל 40 מיקרומטר עם 0.08% BSA-DPBS, והכניסו אותה לצינור חרוטי בנפח 50 מ"ל. מעבירים את מתלה התא דרך המסננת. יש לטפוח ולשטוף עם DPBS נוסף של 200 μL, ולאסוף את המתלה בתחתית הצינור.</li>
	<li>מעבירים את המתלה לצינור בנפח 1.5 מ"ל. הוסף 5 μL של DNase I (1 U/μL), ודגור במשך 15 דקות ב 15-20 ° C. צנטריפוגה ב 300 × גרם במשך 5 דקות ב 4 °C (75 °F).</li>
	<li>הסר את supernatant, ו resuspend את גלולת התא ב 400 μL של DPBS קר כקרח (Ca 2+/Mg2+ חינם). פיפטה בעדינות למעלה ולמטה עם קצוות רחבים כדי לערבב את התאים. חזור על שלב זה פעמיים.</li>
</ol>5. צביעה ובדיקה מיקרוסקופית
<ol><li>להכתמה, ערבבו את מתלה התא עם תמיסת טריפאן כחולה 0.4% ביחס של 1:1. יש לדגור במשך 3 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>מוסיפים 5-10 μL מהתערובת על המוציטומטר, ובודקים תחת המיקרוסקופ. הערה: לתאים בני קיימא תהיה ציטופלסמה לא מוכתמת, בעוד שלתאים מתים תהיה ציטופלסמה כחולה (איור 2).</li>
	<li>ספרו את התאים החיים והמתים בשלושה שדות שונים תחת המיקרוסקופ. חשב את אחוז הכדאיות של התא על-ידי חלוקת מספר התאים בני קיימא במספר התאים הכולל בשדה. הערה: כדאיות התא צריכה להיות יותר מ- 85%, וריכוז התא לא צריך להיות קטן מ- 1 x 105-1 x 107/mL. רקע תרחיף התא צריך להיות נקי, ללא גושים, שברים או זיהומים.</li>
</ol>

<ol><li>Tang, X., Huang, Y., Lei, J., Luo, H., Zhu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+single-cell+sequencing%3A+new+developments+and+medical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+and+Bioscience%22%5BJournal%5D)">The single-cell sequencing: new developments and medical applications.</a> Cell and Bioscience. 9 (1), (2019).</li>
<li>He, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+human+skin+identifies+novel+fibroblast+subpopulation+and+enrichment+of+immune+subsets+in+atopic+dermatitis%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Allergy+and+Clinical+Immunology%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of human skin identifies novel fibroblast subpopulation and enrichment of immune subsets in atopic dermatitis.</a> The Journal of Allergy and Clinical Immunology. 145 (6), 1615-1628 (2020).</li>
<li>Carmona, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptome+analysis+of+fish+immune+cells+provides+insight+into+the+evolution+of+vertebrate+immune+cell+types%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptome analysis of fish immune cells provides insight into the evolution of vertebrate immune cell types.</a> Genome Research. 27 (3), 451-461 (2017).</li>
<li>Wen, L., Tang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+epigenome+sequencing+technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Single cell epigenome sequencing technologies.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 62-69 (2018).</li>
<li>Xu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+sequencing+coupled+with+bioinformatics+reveals+PHYH+as+a+potential+biomarker+in+kidney+ischemia+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemical+and+Biophysical+Research+Communications%22%5BJournal%5D)">Single cell sequencing coupled with bioinformatics reveals PHYH as a potential biomarker in kidney ischemia reperfusion injury.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 602, 156-162 (2022).</li>
<li>Potter, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+for+the+study+of+development%2C+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Nephrology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing for the study of development, physiology and disease.</a> Nature Reviews Nephrology. 14 (8), 479-492 (2018).</li>
<li>Andrews, T. S., Hemberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+cell+populations+with+scRNASeq%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Aspects+of+Medicine%22%5BJournal%5D)">Identifying cell populations with scRNASeq.</a> Molecular Aspects of Medicine. 59, 114-122 (2018).</li>
<li>Lafzi, A., Moutinho, C., Picelli, S., Heyn, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tutorial%3A+Guidelines+for+the+experimental+design+of+single-cell+RNA+sequencing+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Tutorial: Guidelines for the experimental design of single-cell RNA sequencing studies.</a> Nature Protocols. 13 (12), 2742-2757 (2018).</li>
<li>Reichard, A., Asosingh, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Best+practices+for+preparing+a+single+cell+suspension+from+solid+tissues+for+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+Part+A%22%5BJournal%5D)">Best practices for preparing a single cell suspension from solid tissues for flow cytometry.</a> Cytometry Part A. 95 (2), 219-226 (2019).</li>
<li>Sathiyanarayanan, A., Goswami, M., Nagpure, N., Babu, P. G., Das, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+new+gill+cell+line+from+the+striped+catfish%2C+Pangasianodon+hypophthalmus+%28Sauvage%2C+1878%29%5BTitle%5D)+AND+%22Fish+Physiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a new gill cell line from the striped catfish, Pangasianodon hypophthalmus (Sauvage, 1878).</a> Fish Physiology and Biochemistry. 48 (2), 367-380 (2022).</li>
<li>Ager-Wick, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+a+high-quality+primary+cell+culture+from+fish+pituitaries%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Preparation of a high-quality primary cell culture from fish pituitaries.</a> Journal of Visualized Experiments. (138), e58159(2018).</li>
<li>Kumar, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+and+characterization+of+a+caudal+fin-derived+cell+line%2C+AOF%2C+from+the+Oscar%2C+Astronotus+ocellatus%5BTitle%5D)+AND+%22FishPhysiology+and+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Establishment and characterization of a caudal fin-derived cell line, AOF, from the Oscar, Astronotus ocellatus.</a> FishPhysiology and Biochemistry. 45 (1), 123-131 (2019).</li>
<li>Schnell, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedures+for+the+reconstruction%2C+primary+culture+and+experimental+use+of+rainbow+trout+gill+epithelia%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Procedures for the reconstruction, primary culture and experimental use of rainbow trout gill epithelia.</a> Nature Protocols. 11 (3), 490-498 (2016).</li>
<li>Xu, S. H., Cooke, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Voltage-gated+currents+of+tilapia+prolactin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22General+and+Comparative+Endocrinology%22%5BJournal%5D)">Voltage-gated currents of tilapia prolactin cells.</a> General and Comparative Endocrinology. 150 (2), 219-232 (2007).</li>
<li>Ayyaz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomes+of+the+regenerating+intestine+reveal+a+revival+stem+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomes of the regenerating intestine reveal a revival stem cell.</a> Nature. 569 (7754), 121-125 (2019).</li>
<li>Pan, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analysis+of+neuroepithelial+cells+and+other+cell+types+of+the+gills+of+zebrafish+%28Danio+rerio%29+exposed+to+hypoxia%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analysis of neuroepithelial cells and other cell types of the gills of zebrafish (Danio rerio) exposed to hypoxia.</a> Scientific Reports. 12, 10144(2022).</li>
<li>Huang, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+proteome+alteration+during+cell+subculture+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Science%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced proteome alteration during cell subculture in mammalian cells.</a> Journal of Biomedical Science. 17 (1), 36(2010).</li>
<li>Kapiszewska, M., Reddy, N. M., Lange, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trypsin-induced+changes+in+cell+shape+and+chromatin+structure+result+in+radiosensitization+of+monolayer+Chinese+hamster+V79+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Radiation+Biology%22%5BJournal%5D)">Trypsin-induced changes in cell shape and chromatin structure result in radiosensitization of monolayer Chinese hamster V79 cells.</a> International Journal of Radiation Biology. 60 (4), 635-646 (1991).</li>
<li>Vrtačnik, P., Kos, Š, Bustin, S. A., Marc, J., Ostanek, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Influence+of+trypsinization+and+alternative+procedures+for+cell+preparation+before+RNA+extraction+on+RNA+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Influence of trypsinization and alternative procedures for cell preparation before RNA extraction on RNA integrity.</a> Analytical Biochemistry. 463, 38-44 (2014).</li>
<li>Huettner, J. E., Baughman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+of+identified+neurons+from+the+visual+cortex+of+postnatal+rats%5BTitle%5D)+AND+%22The+Journal+of+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats.</a> The Journal of Neuroscience. 6 (10), 3044-3060 (1986).</li>
<li>Kinoshita, K., Sato, K., Hori, M., Ozaki, H., Karaki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decrease+in+activity+of+smooth+muscle+L-type+Ca2%2B+channels+and+its+reversal+by+NF-kappaB+inhibitors+in+Crohn%27s+colitis+model%5BTitle%5D)+AND+%22American+Journal+of+Physiology.+Gastrointestinal+and+Liver+Physiology%22%5BJournal%5D)">Decrease in activity of smooth muscle L-type Ca2+ channels and its reversal by NF-kappaB inhibitors in Crohn's colitis model.</a> American Journal of Physiology. Gastrointestinal and Liver Physiology. 285 (3), 483-493 (2003).</li>
<li>Chung, M. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequences+and+domain+structures+of+mammalian%2C+avian%2C+amphibian+and+teleost+tropoelastins%3A+Clues+to+the+evolutionary+history+of+elastins%5BTitle%5D)+AND+%22Matrix+Biology%22%5BJournal%5D)">Sequences and domain structures of mammalian, avian, amphibian and teleost tropoelastins: Clues to the evolutionary history of elastins.</a> Matrix Biology. 25 (8), 492-504 (2006).</li>
<li>Berry, M. N., Friend, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-yield+preparation+of+isolated+rat+liver+parenchymal+cells%3A+A+biochemical+and+fine+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">High-yield preparation of isolated rat liver parenchymal cells: A biochemical and fine structural study.</a> Journal of Cell Biology. 43 (3), 506-520 (1969).</li>
<li>Merlos-Suárez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+intestinal+stem+cell+signature+identifies+colorectal+cancer+stem+cells+and+predicts+disease+relapse%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">The intestinal stem cell signature identifies colorectal cancer stem cells and predicts disease relapse.</a> Cell Stem Cell. 8 (5), 511-524 (2011).</li>
<li>Glass, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+a+distinct+population+of+proglucagon-expressing+cells+specific+to+the+mouse+upper+small+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Metabolism%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals a distinct population of proglucagon-expressing cells specific to the mouse upper small intestine.</a> Molecular Metabolism. 6 (10), 1296-1303 (2017).</li>
<li>Herring, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsupervised+trajectory+analysis+of+single-cell+RNA-seq+and+imaging+data+reveals+alternative+tuft+cell+origins+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut.</a> Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).</li>
<li>Gu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA+sequencing+reveals+size-dependent+effects+of+polystyrene+microplastics+on+immune+and+secretory+cell+populations+from+zebrafish+intestines%5BTitle%5D)+AND+%22Environmental+Science+%26+Technology%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA sequencing reveals size-dependent effects of polystyrene microplastics on immune and secretory cell populations from zebrafish intestines.</a> Environmental Science & Technology. 54 (6), 3417-3427 (2020).</li>
<li>Yang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analysis+reveals+a+hepatic+stellate+cell-activation+roadmap+and+myofibroblast+origin+during+liver+fibrosis+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Hepatology%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analysis reveals a hepatic stellate cell-activation roadmap and myofibroblast origin during liver fibrosis in mice.</a> Hepatology. 74 (5), 2774-2790 (2021).</li>
<li>Howard, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+enzymatic+preparation+of+isolated+intact+parenchymal+cells+from+rat+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The enzymatic preparation of isolated intact parenchymal cells from rat liver.</a> Journal of Cell Biology. 35 (3), 675-684 (1967).</li>
<li>Pezoldt, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+of+splenic+fibroblasts+reveals+subset-specific+innate+immune+signatures+in+homeostasis+and+during+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Communications+Biology%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling of splenic fibroblasts reveals subset-specific innate immune signatures in homeostasis and during viral infection.</a> Communications Biology. 4 (1), 1355(2021).</li>
<li>Baron, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+transcriptomic+map+of+the+human+and+mouse+pancreas+reveals+inter-+and+intra-cell+population+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">A single-cell transcriptomic map of the human and mouse pancreas reveals inter- and intra-cell population structure.</a> Cell Systems. 3 (4), 346-360 (2016).</li>
<li>Barriga, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mex3a+Marks+a+slowly+dividing+subpopulation+of+Lgr5%2B+intestinal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Mex3a Marks a slowly dividing subpopulation of Lgr5+ intestinal stem cells.</a> Cell Stem Cell. 20 (6), 801-816 (2017).</li>
<li>Volovitz, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+non-aggressive%2C+highly+efficient%2C+enzymatic+method+for+dissociation+of+human+brain-tumors+and+brain-tissues+to+viable+single-cells%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">A non-aggressive, highly efficient, enzymatic method for dissociation of human brain-tumors and brain-tissues to viable single-cells.</a> BMC Neuroscience. 17 (1), 30(2016).</li>
<li>Chen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+effects+of+arsenic+and+2%2C2-dichloroacetamide+on+different+cell+populations+of+zebrafish+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Science+of+the+Total+Environment%22%5BJournal%5D)">Combined effects of arsenic and 2,2-dichloroacetamide on different cell populations of zebrafish liver.</a> Science of the Total Environment. 821, 152961(2022).</li>
<li>FAO. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+state+of+world+fisheries+and+aquaculture+2022.+Towards+blue+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Food+and+Agriculture+Organization+of+the+United+Nations+%28FAO%29%22%5BJournal%5D)">The state of world fisheries and aquaculture 2022. Towards blue transformation.</a> Food and Agriculture Organization of the United Nations (FAO). , Rome, Italy. (2022).</li>
<li>Beck, B. H., Peatman, E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBeck%2C+BH+%22Mucosal+Health+in+Aquaculture%22">Mucosal Health in Aquaculture</a>. , Academic Press. Cambridge, MA. (2015).</li>
<li>Leelatian, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Single+cell+analysis+of+human+tissues+and+solid+tumors+with+mass+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+B%2C+Clinical+Cytometry%22%5BJournal%5D)">A Single cell analysis of human tissues and solid tumors with mass cytometry.</a> Cytometry. Part B, Clinical Cytometry. 92 (1), 68-78 (2017).</li>
<li>Lee, H., Engin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparing+highly+viable+single-cell+suspensions+from+mouse+pancreatic+islets+for+single-cell+RNA+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protocols%22%5BJournal%5D)">Preparing highly viable single-cell suspensions from mouse pancreatic islets for single-cell RNA sequencing.</a> STAR Protocols. 1 (3), 100144(2020).</li>
<li>Bresciani, E., Broadbridge, E., Liu, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+dissociation+protocol+for+generation+of+single+cell+suspension+from+zebrafish+embryos+and+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">An efficient dissociation protocol for generation of single cell suspension from zebrafish embryos and larvae.</a> MethodsX. 5, 1287-1290 (2018).</li>
<li>Denisenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+assessment+of+tissue+dissociation+and+storage+biases+in+single-cell+and+single-nucleus+RNA-seq+workflows%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Systematic assessment of tissue dissociation and storage biases in single-cell and single-nucleus RNA-seq workflows.</a> Genome Biology. 21 (1), 130(2020).</li>
<li>vanden Brink, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+reveals+dissociation-induced+gene+expression+in+tissue+subpopulations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing reveals dissociation-induced gene expression in tissue subpopulations.</a> Nature Methods. 14 (10), 935-936 (2017).</li>
<li>Avey, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+RNA-seq+uncovers+a+robust+transcriptional+response+to+morphine+by+glia%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Single-cell RNA-seq uncovers a robust transcriptional response to morphine by glia.</a> Cell Reports. 24 (13), 3619-3629 (2018).</li>
<li>Herring, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unsupervised+trajectory+analysis+of+single-cell+RNA-seq+and+imaging+data+reveals+alternative+tuft+cell+origins+in+the+gut%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Systems%22%5BJournal%5D)">Unsupervised trajectory analysis of single-cell RNA-seq and imaging data reveals alternative tuft cell origins in the gut.</a> Cell Systems. 6 (1), 37-51 (2018).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

פרוטוקול זה מתאר הכנה של תרחיף חד תאי באיכות גבוהה של מעי אמנון הנילוס. לפני הדיסוציאציה, הסרת שומן ומזנטריה מהמעי היא הכרחית, במיוחד עבור מעיים דגים טורפים עם שומן רב. שימוש במזרק במקום גירוד קשה כדי לשטוף את תוכן המעי מפחית את הנזק המכני לתאים. כדי להבטיח את כדאיות התא, חיוני גם לשמור על הטמפרטורה ב -20 מעלות צלזיוס ומטה עבור שלבי הדיסקציה והשטיפה של הרקמות. פתרונות הכביסה מקוררים על קרח, וטמפרטורת הצנטריפוגות מותאמת ל -4 מעלות צלזיוס מראש. והכי חשוב, יש לבחור אנזימי דיסוציאציה תאיים קלים ויעילים עבור הרקמה הנחקרת. בהת...

תאים הם היחידות הבסיסיות של אורגניזמים. בהשוואה למחקרי רקמות בתפזורת, מחקרים ברמת תא בודד יכולים לשקף הטרוגניות של תאים ולספק מידע ברזולוציה גבוהה יותר1. בשנים האחרונות, חוקרים יישמו טכנולוגיות ריצוף חד-תאי עבור גנום, שעתוק, אפיגנום או מחקרים רב-אומיים ברמת התא הבודד ביונקים, דגי זברה ואורגניזמים מודל אחרים ודיווחו על פריצות דרך גדולות 2,3,4,5,6,7 . בעוד שרוב המחקרים התמקדו באורגניזמים מודלים, יש מעט פרוטוקולי ייחוס או ערכות דיסוציאציה מסחריות לריצוף חד-תאי במיני דגים כלכליים, מה שמגביל את היישום של ריצוף חד-תאי במחקר חקלאות ימית. לכן, פיתוח פרוטוקולים לדיסוציאציה של רקמות המייצרים תרחיפים חד-תאיים באיכות גבוהה עם כדאיות גבוהה של תאים ושלמות חומצות גרעין הוא חיוני.
מיטוב פרוטוקול הדיסוציאציה של רקמות עם שילוב האנזים או האנזים המתאים כדי להשיג מספיק תאים בני קיימא עם נזק מינימלי הוא חיוני. האנזים היעיל ביותר לדיסוציאציה של רקמות משתנה בהתאם לסוג הרקמה. ביונקים נעשה שימוש במספר אנזימים להכנת תרחיפים חד-תאיים לרקמות מוצקות של יונקים, כולל קולגן, דיספאז, טריפסין, פפאין, אלסטאז, היאלורונידאז, ליבראז, אקוטאז וטריפול 8,9. עיכול טריפסין בשילוב עם הפרעה מכנית שימש בדרך כלל כדי לנתק רקמות לתרבית תאים בדגים 10,11,12,13,14. טריפסין שימש או נוסף גם לקוקטייל העיכול לדיסוציאציה של רקמות במעי החולדה15 וברקמת הזימים של דג הזברה16. עם זאת, מכמה סיבות, טריפסין אינו האפשרות הטובה ביותר עבור ריצוף תא יחיד. טריפסין לבדו בדרך כלל אינו יעיל לדיסוציאציה של רקמות. בנוסף, טריפסין גורם לשבירת גדיל DNA 17,18 ולפירוק RNA19.
פפאין מפרק את החלבונים המרכיבים את הצמתים הצפופים בין התאים. בעצב יונקים ובתאי שריר חלקים, פפאין יעיל יותר והרסני פחות מפרוטאזות אחרות20,21. עם זאת, כמו טריפסין, פפאין גורם לצבירה חופשית של תאים הנגרמת על ידי DNA עקב ליזה התא המתרחשת במהלך עיכול אנזימטי9. אלסטאז מפרק אלסטין, הנמצא בדרך כלל בעור, בריאות, ברצועות, בגידים וברקמות כלי הדם22. לעתים קרובות משתמשים בו בשילוב עם collagenase, dispase או טריפסין לניתוק רקמת ריאה8. היאלורונידאז קוטע את הקשרים הגליקוזידים של היאלורונן, ותורם לעיכול המטריצה החוץ תאית ברקמות חיבור שונות ובעור 9,23.
באופן כללי, collagenase ו dispase הם אפשרויות טובות עבור פירוק מטריצה תאיים. הם שימשו בדיסוציאציה של מעיים אנושיים, עכברים ודגי זברה24,25,26,27. Collagenase הורס את הקשר הפפטידי בקולגן, מקדם את העיכול של המטריצה החוץ תאית ומשחרר את התאים לתרחיף, ולכן collagenase משמש לעתים קרובות לדיסוציאציה של רקמות מוצקות של בני אדם ועכברים, כולל עבור הכבד 28,29, טחול30, לבלב31 ומעי 25. דיספאז הוא פרוטאז שמבצע הידרוליזה של קשרי פפטיד N-טרמינליים של שאריות חומצות אמינו לא קוטביות, והוא עדין יותר מקולגן. הוא מבקע את מרכיבי המטריקס החוץ תאיים, כגון פיברונקטין (fibronectin), קולגן מסוג IV, ובמידה פחותה קולגן מסוג I, מבלי להשפיע על הצטלבויות התא. דיספאז משמש בנפרד או עם אנזימים אחרים לדיסוציאציה של רקמות, כגון עבור מעי25,32, מוח33, כבד 34 וכו '. נוסף על כך, קוקטיילים מסחריים לעיכול, כולל ליבראז, אקוטאז וטריפל, הם גם חלופות טובות לדיסוציאציה של רקמות מוצקות, במיוחד עבור העור, הכבד והכליות 8,9.
אמנון הנילוס (Oreochromis niloticus) שייך למשפחה Cichlidae של הסדר Perciformes. זהו אחד ממיני דגי המים המתוקים המתורבתים ביותר באזורים טרופיים וסובטרופיים, עם ייצור שנתי של 4.5 מיליון טון בשנת 202235. זהו אחד ממיני דגי החקלאות הימית הנחקרים ביותר עם גנום מבואר היטב. אמנון הנילוס הוא מודל מחקר אידיאלי עבור מיני דגים בחקלאות ימית בשל זמן הייצור הקצר שלו, קלות הגידול שלו ויכולת ההסתגלות למגוון רחב של סביבות גידול. המעי הוא בעל עניין מחקרי רב שכן הוא איבר התזונה, העיכול והספיגה, חילוף החומרים ומערכת החיסון הרירית. המעי הוא בית הגידול של אוכלוסיות מיקרוביאליות והוא רקמת חיסון חיונית36. הוא פעיל מבחינה חיסונית בשל נוכחותם של סוגים רבים של תאי חיסון, כולל מקרופאגים, תאי B, גרנולוציטים ותאי T.
במחקר הנוכחי פיתחנו פרוטוקול להכנת תרחיף חד-תאי איכותי ממעי האמנון של הנילוס כדי להקל על מחקרים ברמת התא הבודד במינים של דגי חקלאות ימית. על פי המאפיינים של אנזימים ספציפיים לרקמות אלה ועבודה ראשונית, collagenase/dispase מתאים לניתוק רקמת מעי אמנון. סוג האנזים האחרון שיש לקחת בחשבון בהכנת תרחיפים חד-תאיים הוא DNase-I, המונע צבירת תאים על ידי פירוק דנ"א חופשי המשתחרר דרך ליזה של תאים מתים במהלך עיכול אנזימטי מבלי ליזום מסלולים אפופטוטיים9 ומגביר את תפוקת התא החי36. בנוסף, אלבומין בסרום בקר (BSA) מתווסף למאגר הכביסה כדי להפחית את גושי התאים ולשפר את כדאיות התא. מספר חברות ריאגנטים מתארות BSA כמייצב אנזים. תוספת של 0.04%-1% BSA ל-PBS (מלח חוצץ פוספט) שימשה לפיתוח פתרון שטיפה להכנת מתלי ריצוף חד-תאי ללא תופעות לוואי38. תוספת של יחס נמוך של BSA יכולה לעזור לשמור על כדאיות התא ולמנוע הצטברות חופשית של תאים הנגרמת על ידי DNA עקב ליזה של תאים. פרוטוקול זה יכול גם לספק התייחסות רבת ערך לפיתוח פרוטוקולי דיסוציאציה של תאים מהמעיים של מיני דגים אחרים בחקלאות ימית.

<table><tbody><tr><td>0.22-&mu; m מסנן סטרילי</td><td>Solarbio מדעי החיים</td><td>SLGV033RB</td><td>הוא משמש לסינון ועיקור תמיסת האנזים.</td></tr><tr><td>40-&mu; מסננת תאים m מסננת תאים</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>F8200</td><td>מיושמת כדי לסלק חתיכות רקמה לא מעוכלות.</td></tr><tr>אבקת <td>אלבומין בסרום בקר (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SRE0098</td><td>; יש לדלל 0.04 גרם BSA עם 100 מ"ל 1& DPBS להכנת 0.04% BSA-DPBS כביסה bffer. יש לאחסן בטמפרטורה של 2 - 8 מעלות צלזיוס.</td></tr><tr><td>קולגנאז II</td><td>Sangon Biotech</td><td>A004202</td><td>לדלל עם PBS לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל.</td></tr><tr><td>קולגנאז/דיספאז</td><td>Roche</td><td>10269638-001</td><td>יש לדלל עם PBS לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל.</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4818</td><td>יש לדלל עם PBS לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל.</td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>AMPD1</td><td>DNase I מסייע בהפחתת גושי תאים.</td></tr><tr><td>תמיסת מלח ללא פוספט (DPBS) של Dulbecco, Ca2+/Mg2+</td>-<td>free Solarbio Life Sciences</td><td>E607009-0500</td> יש <td>לאחסן בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>אלסטאז</td><td>סנגון ביוטק</td><td>A600438</td><td>לדלל עם PBS לריכוז סופי של 0.5 מ"ג/מ"ל.</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>סרום Gibco</td><td>16000-044</td><td>, המשמש בנפח של 5% בתמיסת דיגציה.</td></tr><tr><td>הפוך&nbsp; מיקרוסקופ</td><td>Leica</td><td>qTOWER3G</td><td>הוא משמש לבחינת כדאיות התא.</td></tr><tr><td>Liberase</td><td>Roche</td><td>5401119001</td><td>לדלל עם PBS לריכוז סופי של 0.25 מ"ג/מ"ל.</td></tr><tr><td>אמנון הנילוס (Oreochromis niloticus)</td><td>ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.</td><td>NA</td><td>דגים בריאים ללא סימני מחלה (משקל גוף ממוצע: 100 גרם).&nbsp;</td></tr><tr><td>תמיסת מלח עם חוצץ פוספט (PBS)</td><td>Solarbio Life Sciences</td><td>P1020</td><td>יש לאחסן בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מקוררת</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>הוא משמש לסיבוב הרקמה ופטט התאים.</td></tr><tr><td>מעכב RNase</td><td>NEB</td><td>M0314L</td><td>מעכב את פעילות RNase</td></tr><tr><td>ריאגנט RNase-Be-Gone בשלב מוצק</td><td>Sangon Biotech</td><td>B644201-0050</td><td>הוא משמש להסרת ה-RNase מכלים כגון מספריים לניתוח ופיפטות זכוכית. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.</td></tr><tr><td>טריקאין מתאן סולפונאט (MS-222)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E10521</td><td>להמתת חסד של דגים.&nbsp;</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Invitrogen</td><td>C0040</td><td>הוא משמש לצביעה של תאים מתים.</td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>סנגון ביוטק</td><td>E607001</td><td>לדלל עם PBS לריכוז סופי של 1 מ"ג/מ"ל.</td></tr></tbody></table>

הכנת תרחיף חד-תאי ממעי אמנון הנילוס לריצוף חד-תאי

Single-Cell Suspension Preparation from Nile Tilapia Intestine for Single-Cell Sequencing

אמנון הנילוס הוא אחד ממיני דגי המים המתוקים המתורבתים הנפוצים ביותר בעולם והוא מודל מחקר נפוץ לחקר דגי חקלאות ימית. הכנת תרחיפים איכותיים של תא בודד חיונית למחקרים ברמת התא הבודד כגון RNA של תא בודד או ריצוף גנום. עם זאת, אין פרוטוקול מוכן לשימוש עבור מיני דגים חקלאות ימית, במיוחד עבור המעי של אמנון. אנזימי הדיסוציאציה היעילים משתנים בהתאם לסוג הרקמה. לכן, אופטימיזציה של פרוטוקול הדיסוציאציה של רקמות על ידי בחירת שילוב האנזים או האנזים המתאים כדי להשיג מספיק תאים בני קיימא עם נזק מינימלי היא חיונית. מחקר זה מדגים פרוטוקול אופטימלי להכנת תרחיף חד-תאי איכותי ממעי אמנון הנילוס עם שילוב אנזים של collagenase/dispase. שילוב זה יעיל מאוד לדיסוציאציה עם שימוש באלבומין בסרום בקר ו- DNase להפחתת צבירת תאים לאחר העיכול. תפוקת התא עונה על הדרישות לריצוף תא בודד, עם 90% כדאיות התא וריכוז תאים גבוה. פרוטוקול זה יכול גם להשתנות כדי להכין תרחיף חד-תאי מהמעיים של מיני דגים אחרים. מחקר זה מספק פרוטוקול ייחוס יעיל ומפחית את הצורך בניסויים נוספים בהכנת תרחיפים חד-תאיים למיני דגים של חקלאות ימית.

פרוטוקול זה מתאר הכנה של תרחיף חד-תאי באיכות גבוהה של מעי אמנון הנילוס לריצוף חד-תאי (איור 1). מחקר זה מראה כי לתערובת collagenase/dispase יש אפקט דיסוציאציה טוב והיא קלה לרקמת המעי. הבחירה של אנזים העיכול האופטימלי חיונית להכנת תרחיף חד תאי באיכות גבוהה. בעבודה הראשונית הושוותה יעילות הדיסוציאציה של מספר אנזימים נפוצים, והתוצאות מפורטות בטבלה 1. תערובת collagenase/dispase אומתה כבעלת אפקט דיסוציאציה הרבה יותר טוב מאשר collagenase, dispase או טריפסין בלבד ומספר תערובות אנזימ...

כאן, אנו מדגימים את הכנת תרחיף חד תאי באיכות גבוהה של מעי אמנון לריצוף תא בודד.

Nile tilapia is one of the most commonly cultured freshwater fish species worldwide and is a widely used research model for aquaculture fish studies. The ...

פרוטוקול זה מספק סימוכין אמינים להכנת תרחיף חד-תאי באיכות גבוהה ממעי אמנון הנילוס כדי להקל על מחקרים ברמת התא הבודד במינים של דגים בחקלאות ימית. הטכנולוגיה יעילה ביותר וניתנת ליישום ברוב תנאי המעבדה. זה מפחית את הצורך בניסויים נוספים כדי להכין תרחיפים חד-תאיים עבור מיני דגים של חקלאות ימית.התחילו בשטיפת דגי אמנון הנילוס בני שישה חודשים במים סטריליים מאווררים היטב למשך 15 דקות כדי לשטוף חיידקים הקשורים באופן רופף מפני השטח. להכנת מגיב הדיסוציאציה האנזימטי של התא, יש לדלל את ה-collagenase dispase ב-PBS לריכוז סופי של מיליגרם אחד למיליליטר. מערבבים 95% נפח של תמיסה אנזימטית מוכנה ונפח 5% של FBS.לאחר מכן קיררו מראש את הצנטריפוגה לארבע מעלות צלזיוס לפני השימוש. לדיסקציה של רקמות, הניחו את הדג המרדים על קרח ואספו שלושה עד ארבעה סנטימטרים מאמצע המעיים. הבלו את השומן ואת mesentery באמצעות מלקחיים.הסר את השומן המחובר לפני השטח של המעי ואת הרירית השקופה האלסטית והגמישה. שטפו בעדינות את קטע המעי עם PBS סטרילי קר כקרח באמצעות מזרק כדי לשטוף את תוכן המעי ואת הריר. לאחר מספר שטיפות, מנתחים את השבר לחתיכות קטנות ומעבירים אותם לצינור 1.5 מיליליטר המכיל PBS קר כקרח של מיליליטר אחד.צנטריפוגה את התערובת ב 300 x גרם בארבע מעלות צלזיוס במשך חמש דקות. והחלף את הסופרנאטנט במיליליטר אחד קר כקרח 0.08% BSA-DPBS. בעזרת פיפטה מזכוכית שואפים בעדינות להשהות מחדש את שברי הרקמות.לאחר שטיפת החתיכות פעם נוספת, להסיר את supernatant ולהוסיף מיליליטר אחד של מגיב דיסוציאציה אנזימטית מוכן. כמו כן מערבבים חמישה מיקרוליטרים של מעכב RNA עם מגיב הדיסוציאציה לריצוף RNA חד-תאי. הניחו את הצינור באמבט מים מחוסמים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס והפכו את הצינור ידנית כל חמש דקות במהלך זמן הדגירה של 30 עד 60 דקות.לאחר סיבוב הצינורות, הסר את מגיב הדיסוציאציה האנזימטי של התאים באמצעות קצוות רחבים. הוסיפו מיליליטר אחד של BSA-DPBS קר כקרח 0.08% והוסיפו בעדינות את התאים למעלה ולמטה כדי למנוע הפרעה לתאים. לאחר צנטריפויה והשעיה מחדש של התאים פעם נוספת, הניחו את מסננת התאים בגודל 40 מיקרומטר שהורטבה מראש עם 0.08% BSA-DPBS על צינור חרוטי של 50 מיליליטר.מעבירים את מתלה התא דרך המסננת. הקש על המסננת, ולאחר מכן שטוף אותה עם DPBS של 200 מיקרוליטר ואסוף את התרחיף בתחתית הצינור. לאחר העברת התרחיף לתוך צינור 1.5 מיליליטר, להוסיף חמישה מיקרוליטר של DNA לדגור את התרחיף במשך 15 דקות ב 15 עד 20 מעלות צלזיוס.לאחר הצנטריפוגה, להסיר את supernatant ולהשהות מחדש את גלולת התא ב 400 מיקרוליטר של DPBS קר כקרח ללא יוני סידן ומגנזיום. לאחר מכן פיפטה בעדינות למעלה ולמטה עם קצוות רחבים כדי לערבב את התאים ולחזור על תהליך זה פעם נוספת. להכתמה, מערבבים את תרחיף התא בתמיסה כחולה טריפאן 0.4% ביחס שווה ודגרים במשך שלוש דקות בטמפרטורת החדר.לאחר מכן מוסיפים 10 מיקרוליטר מהתערובת על שקופית הזכוכית. ספרו את התאים החיים והמתים תחת המיקרוסקופ בשלושה שדות וחשבו את אחוז הכדאיות של התא. הושוותה יעילות הדיסוציאציה של מספר אנזימים נפוצים.תערובת collagenase dispase אומתה כבעלת אפקט דיסוציאציה טוב יותר מאשר collagenase dispase או טריפסין לבדם וכמה תערובות אנזימים אחרות. הבדיקה המיקרוסקופית הראתה כי תאי המעי היו בעלי כדאיות גבוהה והתפזרו כתאים בודדים. רוב התאים היו בני קיימא, בעוד שמעטים הוכתמו מתים בגלל קרום התא החדיר.שימו לב לסוג PBS בשימוש. לא ניתן להשתמש בתמיסת עיכול אנזימטית עם PBS נטול סידן/מגנזיום מכיוון שהאנזים דורש יוני סידן/מגנזיום כדי לתפקד ביעילות. ההליך מאפשר מחקרים ברמת התא הבודד במינים של דגי חקלאות ימית, ומספק התייחסות רבת ערך לפיתוח פרוטוקולי דיסוציאציה של תאים של מיני דגים בחקלאות ימית.

single-cell-suspension-preparation-from-nile-tilapia-intestine-for

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד במהירות את הגרעינים באיכות גבוהה מן הרקמה טרי או קפוא עבור רצפי RNA בנפט מקבילים במורד הזרם. אנו כוללים רקמת חומרי ניקוי-מכניים, היפוטוניק-מכניים הפרעה ותא פירוק אפשרויות, אשר שניהם יכול לשמש עבור בידוד של גרעין האטום.

בידוד של חוט השדרה למבוגרים גרעינים עבור רצפי RNA חד-גרעין בנפט מקבילים

בידוד גרעיני בודד מסתמך על חדירות הדיסוציאציה וחומרי הניקוי המבוססים על קרום התא, צעדים הזקוקים לאופטימיזציה ונוטים להציג חפצים טכניים. אנו מדגימים כביסה ופרוטוקול ללא אנזים לבידוד מהיר של גרעינים שלמים ישירות מרקמות שלמות, מניב גרעינים מתאים לגרעין בודד RNA-seq (snRNA-Seq) או ATAC-seq.

גרעיני בידוד מרקמות שלמות באמצעות ניקוי ושיטה נטולת אנזימים

אנו מציגים שיטה לבידוד תאי אנדותל וגרעינים מלומן של עורקי הצוואר של עכברים החשופים לתנאי זרימה יציבים או מופרעים כדי לבצע ניסויים באומיקה חד-תאית.

בידוד תאי אנדותל מהלומן של עורקי הצוואר של עכברים לניסויים רב-תאיים חד-תאיים

תאי T ו-ILC2 המבטאים IL-9 מושרים במהלך זיהום ב-N. brasiliensis , אך האפיון שלהם התעלם במידה רבה במעי הנגוע בשל התדירות הנמוכה והקינטיקה הדיפרנציאלית שלהם. פרוטוקול זה מתאר בידוד של תאים אלה מאיברי מטרה שונים ואישור זהותם באמצעות ציטומטריית זרימה בשלבי זיהום שונים.

אסטרטגיה לחקר תאי לימפה מייצרי IL-9 במודל זיהום Nippostrongylus brasiliensis

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד גרעינים מהמוחות של מודל בעלי החוליות קצרי הימים Nothobranchius furzeri עבור יישומים במורד הזרם כגון ריצוף RNA בעל גרעין יחיד או בדיקת גרעין יחיד עבור כרומטין נגיש לטרנספוזאז עם ריצוף (ATAC-seq).

בידוד עדין של גרעינים מרקמת המוח של דגי טורקיז אפריקאים בוגרים, מודל טבעי קצר מועד לחקר ההזדקנות

כאן אנו מציגים פרוטוקול לבידוד גרעינים מרקמות כבד מוקפאות בהבזק, בארכיון עבור RNA-seq, ATAC-seq ומולטיומיקה של מפרקים (RNA-seq ו-ATAC-seq).

בידוד גרעינים מרקמת כבד קפואה עבור מולטיומיה חד-תאית

המחקר מתאר פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים איכותיים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף RNA של גרעינים בודדים במורד הזרם.

פרוטוקול פשוט, מהיר ואוטומטי חלקית לבידוד גרעינים בודדים מרקמות יונקים קפואים לצורך ריצוף גרעין יחיד

כאן אנו מתארים פרוטוקול עיכול תאים דו-שלבי להכנת תרחיף חד-תאי של עורקי התרדמה של עכברים.

הכנת תרחיף חד-תאי מעורקי התרדמה של העכבר לריצוף חד-תאי

במאמר זה אנו מתארים שיטה לבידוד מעיים מזחלי דגי זברה 5 ימים לאחר ההפריה, לצורך ניתוח ריצוף RNA חד-תאי.

בידוד מעיים מזחלי דגי זברה לריצוף RNA חד-תאי

הפרוטוקול משלב טכנולוגיית אורגנואיד מעיים אנושיים עם ניתוח תעתיק של תא בודד כדי לספק תובנה משמעותית לגבי ביולוגיית המעי שלא נחקרה בעבר.

שימוש באורגנואידים של המעי האנושי כדי להבין את אפיתל המעי הדק ברמת השעתוק של תא בודד

כדי להשיג פריציטים קורטיקליים במוח העכבר העומדים בדרישות scRNA-seq, אנו מציגים פרוטוקול FACS מותאם באופן קריטי המבוסס על בחירת CD13⁺/CD31⁻. השיפורים המרכזיים שלנו משפרים משמעותית את חיוניות התא ואת שלמות ה-RNA, ומאפשרים פרופיל טרנסקריפטומי אמין.

בידוד פריציטים מרקמת קורטיקת העכבר באמצעות FACS לצורך ריצוף תא יחיד

למדו הכנת תרחיף חד-תאי מאיכות גבוהה ממעי אמנון הנילוס (Oreochromis niloticus) לריצוף חד-תאי. פרוטוקול זה מספק שיטה אמינה לחקר ביולוגיה ימית ודגי מאכל.

הכנת תרחיף חד-תאי ממעי אמנון הנילוס לריצוף חד-תאי

גלה סרטונים נוספים