הדמיה תוך חיונית של ביטוי חלבון פלואורסצנטי בעכברים עם פגיעה מוחית טראומטית בגולגולת סגורה וחלון גולגולת באמצעות מיקרוסקופ דו-פוטוני
21 באפריל 2023
מחקר זה מדגים העברה של פגיעה מוחית טראומטית חוזרת ונשנית לעכברים והשתלה סימולטנית של חלון גולגולתי לצורך הדמיה תוך-חיונית עוקבת של EGFP המתבטא בנוירונים באמצעות מיקרוסקופ של שני פוטונים.
הפרוטוקול שלנו מספק דרך לדמיין את התגובה העצבית ללחץ מכני בעכבר חי, אשר יכולה לספק ראיות ישירות לאופן שבו פגיעה מוחית טראומטית משפיעה על המוח. טכניקה זו יכולה לנטר את חלבון המטרה באותו מיקום במוח באותה חיה הן בשלב החריף והן בשלב הכרוני לאחר פגיעה מוחית טראומטית. הגן המעניין ומקדם הנגיף יכולים להשתנות בהתאם כדי לחקור חלבונים אחרים בסוגי התאים הספציפיים במוח.
כדי להתחיל, להחיל משחה אופתלמית על העיניים של העכבר מורדם. הסר את השיער מהחלק העליון של הראש על ידי חיתוך עם מספריים רגילים. לאחר קביעת חתך בקו האמצע באורך 12 עד 15 מילימטרים, יש לכרות את העור מעל האונה השמאלית והימנית של הגולגולת באמצעות מספריים קפיציים מעוקלים.
לאחר חשיפת הגולגולת, הסירו את הפריאוסטאום על ידי שפשוף עדין עם המוליך הסטרילי מכותנה, ושטיפתו במי מלח סטריליים. לאחר ייבוש אזור הגולגולת, סמנו את אזור הפגיעה המוחית הטראומטית, או TBI, בקואורדינטות 2.5 מילימטרים אחוריים לברגמה ושני מילימטרים רוחביים מתפר הקשת מימין. הסר במהירות את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והנח את הראש על כרית החיץ מתחת להתקן TBI.
ישר את קצה המשפיע לאתר ההשפעה המסומן. הרימו את עמוד המתכת על ידי משיכת חוט הניילון הקשור 15 סנטימטרים מעל ראש העכבר, ואז שחררו אותו, מה שמאפשר למשקל ליפול בחופשיות על מוט המתמר, שנמצא במגע עם ראש הגולגולת באתר TBI. הניחו את ראשו של העכבר המורדם על המסגרת הסטריאוטקסית שנשמרה מתחת למיקרוסקופ הכירורגי.
קדח בעדינות ובאיטיות את פני השטח של הגולגולת באמצעות ביט קרביד FG4 במהירות רוטור נמוכה כדי להסיר את הפריאוסטאום שנותר, וצור משטח גולגולת מחוספס כך שהמלט הדנטלי נקשר היטב עם הגולגולת. השתמשו במי מלח כדי לשטוף ולנקות אבק עצמות מפני השטח של הגולגולת. כדי להפריד את השרירים הרוחביים מהגולגולת, בערך חמישה מילימטרים אחוריים לעין, שם ממוקם התפר המחבר בין הגולגולת הקודקודית והרקתית, הכניסו בעדינות את הקצוות הסגורים העדינים והזיזו בעדינות את הקצוות הסגורים בכיוון האחורי עד לתפר הלמבדואיד.
הפרידו את השרירים הרוחביים בצד שבו תתרחש השתלת חלון גולגולתי. לשטוף את הפסולת מאתר הניתוח באמצעות מלוחים ולייבש את האזור עם גזה. כדי להשתיל את עמוד הראש, סמן את נקודת המרכז 2.5 מילימטרים אחורית לברגמה ו -1.5 מילימטרים מתפר הקשת בהמיספרה הימנית באמצעות עט סמן וקליפר כירורגי.
לאחר מכן עקוב אחר היקף הקרניוטומיה על הגולגולת הנקייה והיבשה. שחררו את מוט האוזן וסובבו את הראש, כך שמישור הקרניוטומיה יהיה אופקי לחלוטין, ולאחר מכן הדקו שוב את מוט האוזן. השתמשו במקל העץ של אפליקטור עם קצוות כותנה כדי להוסיף שתי טיפות קטנות של דבק-על לקצה הקדמי והאחורי של עמוד הראש.
מקמו את עמוד ראש הטיטניום מעל מרכז הקרניוטומיה, והתאימו אותו במהירות למנוחה באותו מישור שבו יושתל חלון הגולגולת. הפעילו לחץ קל עד לייבוש דבק העל, פעולה שנמשכת בדרך כלל כ-30 שניות. הכינו מלט דנטלי בכלי קרמי מקורר מראש על ידי ערבוב יסודי של 300 מיליגרם אבקת מלט, שש טיפות נוזל QuickBase וטיפה אחת של זרז.
יש למרוח במהירות כמות נדיבה של תערובת צמנט דנטלי על ההיקף החיצוני ולכסות כל משטח עצם חשוף. עם זאת, אין לכסות את האתר של craniotomy. שחררו את מוט האוזן והצמידו את עמוד הראש למסגרת המתכת כדי להבטיח שהראש יציב לקידוח מדויק לאורך היקף הקרניוטומיה המסומן.
כדי לבצע את הקרניוטומיה, השתמש בקליפר כירורגי כדי לוודא את קוטר העיגול המסומן כפי שהודגם קודם, והתאם לפי הצורך, כך שחלון הגולגולת יתאים היטב לתוך הקרניוטומיה. בעזרת מקדחה דנטלית חשמלית, חורטים ומדללים את הגולגולת לאורך החלק החיצוני של העיגול המסומן באמצעות ביט קרביד FG4 תחילה, היוצר מסילה שבתוכה ניתן לדלל את הגולגולת. השקו את האזור במי מלח כדי לשטוף את אבק העצמות.
ממשיכים לדלל את הגולגולת באמצעות FG 1/4 carbide bit עד שהגולגולת דקה ושקופה. מעת לעת, להפסיק את הקידוח, ולהשקות את כל האזור עם מלוחים סטריליים שוב כדי להפחית את החימום מן המקדחה כדי לשטוף את אבק העצם. השלימו את דילול הגולגולת באמצעות ביט קרביד EF4, והמשיכו לדלל ולקדוח דרך שאר הגולגולת לאורך המסילה.
הכניסו מלקחיים עדינים בקוטר 0.5 מ"מ דרך המקום הסדוק, והרימו את דש העצם בעדינות כלפי מעלה מבלי להסיט פנימה את המוח שמתחתיו. לאחר הסרת דש העצם, להשקות את אזור craniotomy עם מלוחים. בעזרת המלקחיים הכירורגיים בעלי הקצה המעוקל, הסר בעדינות את החומר הארכנואיד הנראה לעין.
השתמש במלקחיים כירורגיים בעלי קצה ישר כדי להרים את חלון הזכוכית הסטרילית כאשר כיסוי הזכוכית בגודל שלושה מילימטר פונה כלפי מטה. מקמו וכווננו את חלון הזכוכית מעל אתר הקרניוטומיה כדי לוודא שהחלון יכול להתאים היטב לקצה הקרניוטומיה. משטח כיסוי הזכוכית בקוטר חמישה מ"מ נמצא למעלה.
מכינים את המלט הדנטלי כפי שהודגם קודם לכן, וממתינים כשש דקות עד שהמלט הופך בצקי וסמיך. בזמן ההמתנה שהמלט יהפוך לבצקי ועבה, הפעילו כמות מספקת של לחץ על החלון באמצעות מניפולטור סטריאוטקסי כדי לבדוק שהגולגולת יכולה לבוא במגע בטוח והדוק עם חלון הזכוכית. השתמש במברשת אפליקטור מדויקת מתכווננת כדי להוסיף כמות קטנה של מלט לצד קצה החלון כדי לאטום את חלון הזכוכית עם הגולגולת.
המתן כ -10 דקות כדי לתת למלט להתייבש לחלוטין, ואז שחרר בעדינות, והסר את המניפולטור מעל החלון. השלם על ידי חיתוך המלט הדנטלי באמצעות מקדחה דנטלית עם ביט קרביד FG4 אם עודפי מלט מכסים את החלון. כארבע שעות לאחר הניתוח בוצעה הדמיה של שני פוטונים, כאשר ברמה השטחית כלי הדם נראו שחורים, וברמה העמוקה של כ-400 מיקרומטר, ביטוי חלבון EGFP התפזר באופן מפוזר בכל גוף התא.
שבוע וארבעה חודשים לאחר TBI, תבנית כלי הדם שנצפתה בנקודת זמן של יום אפס שימשה כנקודת התייחסות לאיתור אותו אזור הדמיה. דפוס כלי הדם דומה לזה שביום האפס. באופן דומה, ביטוי EGFP זוהה בכל גוף התא.
עוצמת הפלואורסצנטיות ביום אפס ובארבעה חודשים הייתה דומה הן ברמה השטחית והן ברמה העמוקה יותר. עם זאת, עוצמת הפלואורסצנטיות בשבוע אחד הייתה נמוכה מזו של יום אפס וארבעה חודשים, אולי בגלל הדיכוי התרגומי שדווח עבור מודלים אחרים של TBI. חשוב לנקוט משנה זהירות בעת הפעלת שלב הקרניוטומיה כדי למנוע פגיעה ברקמת המוח.
אל תחדיר את קצה המקדחה למוח. באמצעות שיטה זו, חוקרים יכולים לדמיין חלבונים שונים בעלי עניין באותו תא לאורך שלבים שונים לאחר TBI, ולספק מידע על הלוקליזציה, הביטוי והמסיסות של חלבון זה במוח יונקים לאחר טראומה.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מדגים שיטה להדמיית התגובה הנוירונלית למאמץ מכני בעקבות פגיעה מוחית טראומטית (TBI) במודל של עכבר חי. הוא מפרט את השתלת חלון גולגולתי כדי לאפשר הדמיה אינטרה-ויטלית של נוירונים המבטאים EGFP באמצעות מיקרוסקופיה דו-פוטונית, דבר המאפשר מעקב אחר התגובה הנוירונלית לאורך זמן.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדעי
- מדעי המוח
- פגיעה מוחית טראומטית
- טכניקות דימות
רקע
- פגיעה מוחית טראומטית (TBI) מובילה לשינויים נוירונליים משמעותיים.
- ניטור תגובות נוירונליות במהלך השלבים החריפים והכרוניים הוא קריטי להבנת השפעות ה-TBI.
- מיקרוסקופיית דו-פוטון מאפשרת הדמיה עמוקה ברקמות חיות.
- ביטוי של EGFP מסייע במעקב אחר אוכלוסיות נוירונליות ספציפיות.
מטרת המחקר
- להדמיה וכימות של תגובות עצביות למאמץ מכני במודל של עכבר חי לאחר TBI.
- לספק תובנות לגבי השפעות ה-TBI על התפקוד העצבי לאורך זמן.
- לבסס פרוטוקול להחלפת מטרות גנטיות לצורך חקר חלבונים שונים בסוגי תאים שונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- מיקרוסקופיית פוטונים כפולים להדמיית תגובות נוירונליות.
- שימוש בעכברים לניסויי in vivo עם פגיעת ראש טראומטית מושרית.
- פרוטוקול ניתוחי מפורט להשתלת חלון גולגולתי כדי לאפשר נגישות להדמיה.
- שום דגש על טכניקות קיבוע והכנה יציבות כדי למזער נזקים במהלך ההליכים.
תוצאות עיקריות
- הטכניקה מאפשרת ניטור בזמן אמת של התנהגות נוירונלית בעקבות TBI.
- תגובות שנצפו בנוירונים המבטאים EGFP ממחישות שינויים בעירור בעקבות פגיעה מכנית.
- נתונים המראים רציפות בתגובות הן בשלב החריף והן בשלב הכרוני מדגימים את ההשפעות המתמשכות של TBI על השלמות הנוירונלית.
מסקנות
- מחקר זה מבסס כלי בעל ערך לחקר התגובות הדינמיות של נוירונים לפגיעה טראומטית in vivo.
- הוא מאפשר חקירה של שינויים מולקולריים ספציפיים הקשורים ל-TBI לאורך זמן, מה שעשוי להוביל להבנה טובה יותר ולאסטרטגיות טיפול משופרות.
- לממצאים יש השלכות על פלסטיות נוירונלית ומנגנוני התאוששות לאחר פגיעה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
דימוי אינטרה-ויטלי (intravital) ארוך-טווח של ביטוי חלבונים פלואורסצנטיים במודלים של עכברים חיים מאפשר ויזואליזציה ישירה של תגובות נוירונליות לפגיעת ראש טראומטית (TBI) ברזולוציה של תא בודד. גישה זו תומכת בביטחון חיזוי של תיקוף מטרות ובהפחתת סיכונים מכניסטיים עבור תהליכי מחקר בנוירוטראומה. יכולתה של השיטה לעקוב אחר לוקליזציה וביטוי של חלבונים לאורך זמן תורמת להמשכיות תרגומית ולהחלטות על תיקי פיתוח מותאמות סיכון בגילוי תרופות למערכת העצבים המרכזית (CNS).
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של התגובה הנוירונלית לפגיעה מכנית in vivo.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות חלבוניות באזורי מוח רלוונטיים למחלה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים באמצעות ויזואליזציה של שינויים מולקולריים אקוטיים וכרוניים לאחר TBI.
- מספק פלטפורמה לבדיקת השערות לגבי לוקליזציה של חלבונים ודינמיקה של מסיסות.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מבסס מערכות דימות in vivo שעברו תיקוף להערכה כמותית של ביטוי חלבונים.
- תומך במדידות אורכיות הניתנות לשחזור בנקודות זמן מרובות באותה חיה.
- מאפשר סטנדרטיזציה של תוצרי הדימות לצורך הערכת תרכובות בהמשך התהליך.
- מאפשר התאמה של וקטורים ויראליים ופרומוטורים לסריקת מטרות חלבון מגוונות.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה לצורך גילוי סמנים ביולוגיים תרגומיים בטראומה נוירולוגית.
- מספק רצף ממחקרים מכניסטיים מוקדמים ועד לתיקוף פרה-קליני של היפותזות טיפוליות.
- מאפשר קבלת החלטות לגבי התקדמות מותאמת סיכון, בהתבסס על שינויים מולקולריים מתמידים לאחר פגיעה.
- תומך בהערכת השפעות של התערבויות על פלסטיקות נוירונלית ומנגנוני התאוששות.
שילוב תהליכים וזרימת עבודה
שיטה זו משלבת שלבים החל מגילוי מוקדם ועד למחקר פרה-קליני, ומאפשרת בדיקת השערות, תיקוף מטרות (target validation) והתאמה של סמנים ביולוגיים תרגומיים במודלים של פגיעות במערכת העצבים המרכזית (CNS).
- ביולוגיה של התגליות: תומך בבדיקת היפותזות מכניסטיות ובבירור מסלולים ברקמת מוח חיה.
- סריקה: מספק פלטי דימוי כמותיים וניתנים לשחזור להערכת מוכנות הבדיקה.
- אנליטיקה: מספק מדידות אורך של עוצמת פלואורסצנציה לצורך ניתוח השוואתי.
- מחקר טרנסלציונלי: מגשר בין השלבים החריפים והכרוניים של הפגיעה להמשכיות של סממנים ביולוגיים.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פלטפורמת דימוי לשימוש חוזר הניתנת להתאמה למגוון מטרות חלבון ותתי-סוגים של נוירונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות בטראומה נוירולוגית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של תהליכי עבודה של דימות in vivo לצורך הדירות ויכולת הרחבה.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות go/no-go ולהקצאת הון באמצעות אספקת קריאות מולקולריות עקביות.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מטרות במערכת העצבים המרכזית (CNS) מותאם סיכון, בהתבסס על נתוני in vivo ארוכי טווח.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בניתוח סטריאוטקסי ובמיקרוסקופיית פוטונים כפולים.
- דורש גישה למכשור דימות מתקדם ולחדרי ניתוח לבעלי חיים.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית של פרוטוקולי ניתוח ודימות בין צוותים שונים.
- ניתן להתאמה למטרות חלבון שונות באמצעות בחירת וקטורים ויראליים ופרומוטורים.
- טכניקה כירורגית זהירה היא קריטית כדי למנוע נזק לרקמת המוח ולהבטיח את איכות הנתונים.
