Name: מעקב אחר הדינמיקה של וריאנטים מבניים באוכלוסיות שהתפתחו בניסוי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-02-03T13:35:00.000+00:00
Duration: 4 min 52 s
Description: חקור שיטה חדשנית לעקוב אחרי דינמיקת וריאנטים מבניים באבולוציה ניסויית באמצעות PCR משולש ואלקטרופורזה קפילרית מקבילית. השיטה מאפשרת מעקב אחרי שינויי תדרי אללים לאורך זמן בחיידקים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי ERC HGTCODONUSE (ERC-2015-CoG-682819) ל- S.B. הנתונים ששימשו בעבודה זו הופקו (בחלקם) באמצעות המתקנים הטכניים של GenSeq של המכון למדעים של מונפלייה בתמיכת LabEx CeMEB, תוכנית "Investissements d'avenir" של ANR (ANR-10-LABX-04-01).

הגדרת פרוטוקול זה דורשת ידע מדויק של נקודת ההכנסה, המחיקה, ההיפוך או השכפול בתוך רצף האבות. מידע זה מתקבל בדרך כלל על ידי ריצוף גנום שלם (WGS) של דגימות נקודת הקצה או הביניים. בפרוטוקול הבא ניתן העיקרון הכללי למקרה של מוטציית החדרה לכל שלב, לצד מקרה מייצג שבו עוקבים אחר תדירות החדרת IS10 לגן mutS באוכלוסיית אבולוציה ניסיונית של E. coli. באוכלוסייה זו, WGS של אוכלוסיית נקודות הקצה זיהה הכנסה של 1,329 bp IS10 בין מיקומים 2,463 ו- 2,471, וכתוצאה מכך נוצר שכפול של אתר החדרה זה. שיטה זו ישימה לשלושת סוגי SV האחרים, והספציפיות של כל מקרה ניתנת בדיון.
1. עיצוב פריימרים לשלישייה
<ol><li>השתמש בשיטות עיצוב פריימר קלאסיות (18-24 bp, תוכן GC של 40%-60%, התחלה/סיום עם זוגות G/C במידת האפשר, הפרשT m &lt; 5°C) כדי לייצר פריימרים FW1 ו- RV1. תכננו פריימרים כדי להגביר אמפליקון קצר על אלל WT סביב אתר החדרת האלל המוטנטי (איור 1). הערה: גודל האמפליקון יכול לנוע בין 100 bp עד 3,000 bp, בהתאם לסולם גודל ה- DNA המשמש באלקטרופורזה נימית. בדוגמה זו, אמפליקון של 155 bp הוגדל. גודל המקטע הקטן שנבחר כאן מונע הגברה מחוץ למטרה של כל רצף החדרת IS10 (ראה סעיף 2).</li>
	<li>תכננו פריימר קדמי שני FW2 בתוך רצף ההחדרה, כדי להפיק אמפליקון שני שהוא בערך 5% גדול או קטן יותר מאפליקון WT (איור 1). הבדל גודל זה של 5% הוא הפרש הגודל המינימלי שמכשיר אלקטרופורזה נימית מקבילית יכול להבחין באופן אמין. לכן, תכננו את הפריימרים כך שלשני האמפליקונים יהיה הבדל בגודל, שהוא מעל אך קרוב ככל האפשר לסף היחסי. הערה: הקפד למזער את הפרש Tm ואת היווצרות דימר פריימר. בדוגמה זו, פריימר קדמי שני תוכנן לייצר אמפליקון של 226 bp, גדול ב-71 bp ממגבר WT. בדוגמה מייצגת זו, רצפי הפריימר הם כדלקמן: FW1: AAAGCATTTCGCCGAACGCC RV1: GCGATAAATCCACTCCAGCGCC FW2: AGTTCGCTTAGGCATGGAAG</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64709/64709fig01.jpg" style="opacity: 0.9;"> איור 1: סכימה של תכנון פריימר משולש על הגן mutS WT והחדרת mutS IS10 מוטנטית. המשולש השחור מייצג את אתר החדרת IS10 בגן mutS. הגן WT הוא בכחול, וה-IS10 הוא בכתום. פריימרים FW1 ו-RV1 מסמנים את אתר החדרת IS10 ומפיקים מגבר WT של 155 bp. פריימר RV1 ופריימר FW2 intra-IS10 מייצרים אמפליקון שני של 226 bp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/64709/64709fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
2. אופטימיזציה של תנאי PCR
<ol><li>לגדל בן לילה תרבות של WT קבוע ושיבוטים של אללים מוטנטיים.</li>
	<li>חלצו את הדנ"א באמצעות כל ערכה.</li>
	<li>לכמת את הדנ"א.</li>
	<li>הכינו את דגימת הדנ"א על ידי דילול מיצוי ה-WT והדנ"א המוטנטי ל-5 ננוגרם/μL. ערבבו את שתי דגימות הדנ"א ביחס של 50/50.</li>
	<li>הגבירו 10 ננוגרם של שלוש דגימות הדנ"א (WT, מוטנט, תערובת 50/50) באמצעות תערובת מאסטר PCR מוכנה לשימוש פי 2, פריימר FW1 0.5 מיקרומטר, פריימר RV1 מיקרומטר 1 ופריימר FW2 0.5 מיקרומטר בנפח תגובה של 20 מיקרוליטר. השתמש בג'ל אגרוז 2% כדי להעביר את מוצר ה- PCR על ידי אלקטרופורזה קלאסית, ולקבוע את תנאי ה- PCR האופטימליים. הערה: יש למזער את זמני ההתארכות כדי למנוע היווצרות של אמפליקון FW1 ו-RV1 על האלל המוטנטי. יש להתאים את טמפרטורת החישול כדי למזער הגברה מוטה של האללים והגברה לא ספציפית.<ol><li>כדי לעקוב אחר התוכנית בדוגמה זו, השתמש בהגדרות הבאות: 98 ° C עבור 10 שניות, ולאחר מכן 25 מחזורים של 98 ° C עבור 1 s, 58 ° C עבור 15 שניות, 72 ° C עבור 8 שניות, ושלב התארכות סופי ב 72 ° C למשך דקה אחת. הערה: זמן ההתארכות קוצר ל-8 שניות כדי למנוע הגברה של תוצר &gt;1,000 bp מהפריימר הקדמי והפריימר RV1 על האלל המוטנטי (mutS עם החדרת IS10).</li>
	</ol></li>
</ol>3. עקומת כיול
<ol><li>ערבבו את שתי דגימות הדנ"א, WT ומוטנט, ביחסים של 10/90, 25/75, 40/60, 50/50, 60/40, 75/25 ו-90/10. הערה: שכפולים ביולוגיים מוכנים מתרביות חיידקים עצמאיות בן לילה.</li>
	<li>הגברה באמצעות תנאי PCR ממוטבים (ראה סעיף 2).</li>
	<li>כמת את מכפלת האמפליקון.</li>
	<li>יש לדלל את מוצרי ה-PCR ל-0.1 ננוגרם/מיקרוליטר.</li>
	<li>הכן את מכשיר אלקטרופורזה נימי מקביל.<ol><li>מערבבים ג'ל וצבע טריים (ערכת ניתוח כמותי של NGS (22, 33 או 55); HS NGS קטע 1-6,000 bp עבור דוגמה זו). הערה: עיין במדריך השברים של אלקטרופורזה נימית מקבילית HS NGS לקבלת הוראות מפורטות (עיין בטבלת החומרים).</li>
	</ol></li>
	<li>החלף את תמיסת האחסון הנימי ואת מאגר הכניסה, והנח את לוחית חיץ השטיפה במיקומי המגירה הנכונים של מכשיר האלקטרופורזה הנימית המקביל.</li>
	<li>הוסף 2 μL של סמן מדלל HS ל 22 μL של כל דגימה מדוללת בצלחת 96 באר.</li>
	<li>הוסף סולם גודל (סולם גודל DNA; טווח 1-6,000 bp) מערכת ניתוח כמותי HS NGS לבאר אחת של צלחת 96 בארות.</li>
	<li>הניחו את צלחת 96 הקידוחים במגירה הנכונה של מכשיר האלקטרופורזה הנימית המקבילית, ובחרו באפשרות 'הפעל' בתוכנת מכשיר האלקטרופורזה הנימית המקבילית.</li>
	<li>נתח את התוצאות באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים, המזהה ומזהה כל שיא בסולם הגודל, ומקצה כל שיא של הדגימות לגודלן האמיתי הידוע.<ol><li>בעת שימוש בערכה כמותית, השתמש בתוכנה כדי לקבוע את כמות ה- DNA של כל מקטע על ידי שילוב האזור מתחת לשיא, כמו בניתוח נתוני כרומטוגרפיה. שוב, השוו דגימות עם כמויות ידועות בתקנים כדי לכמת כל שיא מדגימה, וחשבו את היחסים בין הפסגות השונות שזוהו בדגימות.</li>
		<li>בנו עקומת כיול (איור 2), המקשרת בין היחס הידוע בין האלל המוטנטי (תערובת הדנ"א) לזה שנמדד באמצעות מכשיר האלקטרופורזה הנימית המקבילית. עקומת כיול זו מאפשרת להעריך ולתקן את אמינות השיטה עבור הטיית הגברה קלה.</li>
	</ol></li>
</ol>4. הכנת מדגם
<ol><li>הגדל דגימות של נקודות זמן במהלך הלילה בתנאים סטנדרטיים.</li>
	<li>לחלץ את הדנ"א.</li>
	<li>לכמת את הדנ"א.</li>
	<li>להגביר את הדגימות באמצעות תנאי PCR אופטימליים (ראה סעיף 2).</li>
	<li>הפעל את הדגימות במכשיר אלקטרופורזה נימית מקבילית (ראה שלבים 3.5-3.10).</li>
</ol>5. כימות אלל
<ol><li>חלץ כמויות אלל מוטנטיות מנתוני מכשיר האלקטרופורזה הנימית המקבילית באמצעות התוכנה, וחשב את הפרופורציות בפועל על ידי התוויית ערכים אלה על עקומת הכיול.</li>
</ol>

<ol><li>Mahmoud, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+variant+calling%3A+the+long+and+the+short+of+it%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural variant calling: the long and the short of it.</a> Genome Biology. 20 (1), 246(2019).</li>
<li>Bragg, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease+onset+in+X-linked+dystonia-parkinsonism+correlates+with+expansion+of+a+hexameric+repeat+within+an+SVA+retrotransposon+in+TAF1%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Disease onset in X-linked dystonia-parkinsonism correlates with expansion of a hexameric repeat within an SVA retrotransposon in TAF1.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (51), 11020-11028 (2017).</li>
<li>Stransky, N., Cerami, E., Schalm, S., Kim, J. L., Lengauer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+landscape+of+kinase+fusions+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">The landscape of kinase fusions in cancer.</a> Nature Communications. 5, 4846(2014).</li>
<li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+diversity+of+adaptive+convergence%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The molecular diversity of adaptive convergence.</a> Science. 335 (6067), 457-461 (2012).</li>
<li>Vandecraen, J., Chandler, M., Aertsen, A., Van Houdt, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+insertion+sequences+on+bacterial+genome+plasticity+and+adaptability%5BTitle%5D)+AND+%22Critical+Reviews+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">The impact of insertion sequences on bacterial genome plasticity and adaptability.</a> Critical Reviews in Microbiology. 43 (6), 709-730 (2017).</li>
<li>Andersson, D. I., Gene Hughes, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((amplification+and+adaptive+evolution+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Genetics%22%5BJournal%5D)">amplification and adaptive evolution in bacteria.</a> Annual Review of Genetics. 43, 167-195 (2009).</li>
<li>Bailey, S. F., Bataillon, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Can+the+experimental+evolution+programme+help+us+elucidate+the+genetic+basis+of+adaptation+in+nature%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Ecology%22%5BJournal%5D)">Can the experimental evolution programme help us elucidate the genetic basis of adaptation in nature.</a> Molecular Ecology. 25 (1), 203-218 (2016).</li>
<li>Consuegra, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertion-sequence-mediated+mutations+both+promote+and+constrain+evolvability+during+a+long-term+experiment+with+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Insertion-sequence-mediated mutations both promote and constrain evolvability during a long-term experiment with bacteria.</a> Nature Communications. 12 (1), 980(2021).</li>
<li>Burch, C. L., Romanchuk, A., Kelly, M., Wu, Y., Jones, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+determination+of+barriers+to+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Genome-wide determination of barriers to horizontal gene transfer.</a> bioRxiv. , (2022).</li>
<li>Slomka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+evolution+of+Bacillus+subtilis+reveals+the+evolutionary+dynamics+of+horizontal+gene+transfer+and+suggests+adaptive+and+neutral+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Experimental evolution of Bacillus subtilis reveals the evolutionary dynamics of horizontal gene transfer and suggests adaptive and neutral effects.</a> Genetics. 216 (2), 543-558 (2020).</li>
<li>Choudhury, D., Saini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+Escherichia+coli+in+different+carbon+environments+for+2%2C000+generations%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Evolutionary+Biology%22%5BJournal%5D)">Evolution of Escherichia coli in different carbon environments for 2,000 generations.</a> Journal of Evolutionary Biology. 32 (12), 1331-1341 (2019).</li>
<li>Tenaillon, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tempo+and+mode+of+genome+evolution+in+a+50%2C000-generation+experiment%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tempo and mode of genome evolution in a 50,000-generation experiment.</a> Nature. 536 (7615), 165-170 (2016).</li>
<li>Behringer, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Escherichiacoli+cultures+maintain+stable+subpopulation+structure+during+long-term+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences%22%5BJournal%5D)">Escherichiacoli cultures maintain stable subpopulation structure during long-term evolution.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 115 (20), 4642-4650 (2018).</li>
<li>Voordeckers, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+to+high+ethanol+reveals+complex+evolutionary+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genetics%22%5BJournal%5D)">Adaptation to high ethanol reveals complex evolutionary pathways.</a> PLoS Genetics. 11 (11), 1005635(2015).</li>
<li>Levy, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+evolutionary+dynamics+using+high-resolution+lineage+tracking%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Quantitative evolutionary dynamics using high-resolution lineage tracking.</a> Nature. 519 (7542), 181-186 (2015).</li>
<li>Bruger, E. L., Marx, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+genome+sequencing+has+revolutionized+studies+of+experimental+evolution%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Opinion+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">A decade of genome sequencing has revolutionized studies of experimental evolution.</a> Current Opinion in Microbiology. 45, 149-155 (2018).</li>
<li>Grubaugh, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+amplicon-based+sequencing+framework+for+accurately+measuring+intrahost+virus+diversity+using+PrimalSeq+and+iVar%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology%22%5BJournal%5D)">An amplicon-based sequencing framework for accurately measuring intrahost virus diversity using PrimalSeq and iVar.</a> Genome Biology. 20 (1), 8(2019).</li>
<li>Bedhomme, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolutionary+changes+after+translational+challenges+imposed+by+horizontal+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biology+and+Evolution%22%5BJournal%5D)">Evolutionary changes after translational challenges imposed by horizontal gene transfer.</a> Genome Biology and Evolution. 11 (3), 814-831 (2019).</li>
<li>Tenaillon, O., Toupance, B., Le Nagard, H., Taddei, F., Godelle, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutators%2C+population+size%2C+adaptive+landscape+and+the+adaptation+of+asexual+populations+of+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Mutators, population size, adaptive landscape and the adaptation of asexual populations of bacteria.</a> Genetics. 152 (2), 485-493 (1999).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

כאן, הצענו שיטה חסכונית המאפשרת לעקוב אחר הדינמיקה של אללי SV אדפטיביים מתפתחים באוכלוסיות אבולוציה ניסיונית. שיטה זו משלבת טכניקות PCR קלאסיות ואלקטרופורזה קפילרית מקבילית אוטומטית, המאפשרת לקבוע את הכמויות היחסיות של שני אללים. לאחר ההגדרה, היא מאפשרת לכמת את פרופורציות האלל בדגימות רבות במקביל, והיא זולה בהרבה מ-WGS. ניתן לראות בשיטה זו מקבילה לריצוף אמפליקון עבור מוטציות שאינן SNP וכפתרון למגבלות הטכניות של ריצוף אמפליקון של SVs גדולים. הראינו שהשיטה מכמתת במדויק את שיעור המוטנטים שאינם SNP, באמצעות עקומת כיול שמתגבר...

וריאנטים מבניים (SVs) הם שינויים ברצף הגנומי, המשפיעים בדרך כלל על 50 bp או יותר. ארבע הקטגוריות של SVs המתוארים הן הוספות גדולות, מחיקות גדולות, היפוכים וכפילויות. עד לאחרונה, תשומת לב רבה יותר הוקדשה לווריאנטים חד-נוקלאוטידים (SNVs) מאשר לווריאנטים מבניים, במונחים של ההשפעות הפנוטיפיות שלהם ותפקידם כגורמים גנטיים של מחלות, או תרומתם להסתגלות. זה כנראה בגלל שקל יותר גם לזהות SNV וגם לחזות את ההשפעות הפנוטיפיות שלהם. עם זאת, טכנולוגיות ריצוף עמוק לקריאה קצרה וארוכה שיפרו מאוד את הזיהוי של SVs, לפחות בגנום בודד או שבטי1. במקביל, ההשפעות הפנוטיפיות שלהם אופיינו טוב יותר, ותועדו דוגמאות רבות להשלכותיהם כגורמים גנטיים של מחלות אנושיות 2,3 או הסתגלות לסביבה חדשה4.
מחיקות והחדרות, לעתים קרובות עקב החדרת אלמנטים גנטיים ניידים (MGE), משבשות הרבה יותר מפולימורפיזמים של נוקלאוטידים בודדים (SNPs) ומובילות למוטציות בהסטת מסגרת ולשינויים במבנה החלבון. מחיקות והחדרות MGE בתוך גנים כמעט תמיד גורמות להשבתה של גנים, והחדרות לאזורים שאינם מקודדים יכולות להוביל לדיכוי או לביטוי מכונן של גנים סמוכים כאשר רצפי החדרה (ISs) מכילים רצפי מקדם או סיום5. בעוד שפגיעה בגנים חיוניים מובילה להשפעות מזיקות ברורות על כושר החיידקים, אובדן גנים לא חיוניים מועיל במקרים מסוימים. למרות העלויות הטבועות בהן, כפילויות יכולות גם להיות יתרון, ולהשתתף בהסתגלות מכיוון שהן מובילות לשינוי במינון הגנים; עלייה בפעילות של חלבון מסוים יכולה להיות יתרון בהתאם לתנאים6.
אוכלוסיות אבולוציה ניסיוניות מיקרוביאליות מתחילות בדרך כלל עם שיבוטים. היעדר ראשוני זה של מגוון גנטי, בשילוב עם "הסביבה הסגורה" המאפיינת מבחנות, מוביל לפוטנציאל מוגבל מאוד של אבולוציה על ידי רווח גנים באמצעות העברה אופקית של גנים ורקומבינציה. בתנאים ספציפיים אלה, התרומה להסתגלות של מחיקות, כפילויות והחדרת MGE תוך גנומית חשובה במיוחד; חיידקים מסתגלים לעתים קרובות באמצעות מוטציות של אובדן תפקוד (בעיקר עקב מחיקות או החדרות MGE), המשפיעות על גנים שאינם שימושיים בסביבות מלאכותיות יציבות, לעתים קרובות עשירות בחומרים מזינים,מונוקולטורה 7. בניסוי האבולוציה הארוך ביותר של E. coli , החדרות IS150 שכיחות במיוחד בקרב אוכלוסיות שהתפתחו לאחר 50,000 דורות, כאשר רכיבי IS מייצגים 35% מהמוטציות המגיעות לתדירות גבוהה באוכלוסיות השומרות על שיעור המוטציות של נקודת אבותיהם8.
מחקרי פיתוח וריצוף מחדש משלבים אבולוציה ניסיונית וטכנולוגיות ריצוף מהדור הבא (NGS) כדי לחקור כיצד חיידקים מסתגלים ברמה הפנוטיפית והגנומית לתנאים סביבתיים שונים וללחצים שונים, כגון מקורות פחמן ואנרגיה שונים, אנטיביוטיקה ועקה אוסמוטית 9,10,11 . מחקרים אלה בדרך כלל משיגים מידע גנומי על אוכלוסיות מפותחות או שיבוטים אך ורק בנקודת הסיום של הניסוי, ובמקרים מסוימים, במספר נקודות זמן ביניים12,13,14. נתונים אלה מספקים תובנה לגבי גנים ומסלולים המעורבים בהסתגלות לסביבה נתונה, אך רק לעתים רחוקות מאפשרים לחוקרים לעקוב אחר הדינמיקה של אללים מתפתחים וסוחפים דה נובו לאורך זמן.
גישה אחת לעקוב אחר דינמיקות אלה היא לבחור מספר מוגבל של אללים מפרידים בעלי עניין (בגלל תפקוד הגנים שהם משפיעים עליהם, מכיוון שהם סוחפים במקביל באוכלוסיות עצמאיות וכו ') ולהשתמש בריצוף אמפליקון כדי לכמת את יחס האלל, איגום נקודות זמן רבות באותו ריצוף15. שיטה זו שימשה בהצלחה כדי לעקוב אחר הדינמיקה של וריאנטים בגודל קטן (SNPs או 1 bp indels) בניסויים16 ו -17 אוכלוסיות טבעיות של חיידקים. עם זאת, במקרה של אינדל גדול יותר או החדרות MGE, הפרש הגודל של האמפליקונים גורם להבדלי יעילות PCR, אשר מעוותים את הקשר בין פרופורציות קריאה ואלל. במקרים מסוימים, הפרש הגודל בין שני האללים עדיף על האורך הקלאסי של האמפליקון. כאן, שילבנו טכניקת PCR משולשת עם אלקטרופורזה אוטומטית מקבילית של נימים כדי לכמת את התדירות היחסית של אלל החדרה בהתבסס על הבחנה בגודל. גישה זו מאפשרת ניצול של נקודות זמן ניסיוניות שאינן מנוצלות מספיק כדי לקבוע את הדינמיקה של אלל מוטנטי מתפתח ולעקוב אחר התדירות שלו לקיבוע או אובדן, באופן חסכוני. יישמנו שיטה זו כדי לעקוב אחר אללים מוטטיביים מתפתחים, שעברו מוטציה באמצעות החדרת IS10, וסיפקנו לגנוטיפ שעבר מוטציה פנוטיפ היפרמוטטור.
שיטה זו דורשת שני אללי מטרה עם הבדל של ≥5% בגודל. ראשית, שלישיות פריימר מתוכננות לייצר מקטעים בגודל דומה, החולקים פריימר משותף. שנית, תנאי PCR ממוטבים, ועקומת כיול נוצרת באמצעות תערובות של wild-type (WT) ו-gDNA מוטנטי. לבסוף, הדגימות מוגברות על ידי PCR, והתדירות היחסית של כל אלל מכומתת על ידי אלקטרופורזה קפילרית כמותית מקבילה.

<table><tbody><tr><td>96 צלחת PCR חצאית היטב</td><td>4titude</td><td>4Ti - 0740</td><td>PCR</td></tr><tr><td>אגרוז ביולוגיה מולקולרית כיתה</td><td>Eurogentec</td><td>EP-0010-05</td><td>אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז&nbsp;</td></tr><tr><td>Agilent DNF-474 HS NGS Fragment Kit מדריך מהיר למערכות מנתח השברים</td><td>Agilent</td><td></td><td>PDF מדריך הוראות</td></tr><tr><td>Buffer TBE</td><td>Panreac appliChem</td><td>A4228,5000Pc</td><td>אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז&nbsp;</td></tr><tr><td>לולאות ומחטים חיסון חד פעמיות מכוילות</td><td>LABELIANS</td><td>8175CSR40H</td><td>תרבית חיידקים</td></tr><tr><td>ערכת דם ורקמות Dneasy</td><td>Qiagen</td><td>69506</td><td>מיצוי DNA</td></tr><tr><td>ספק כוח אלקטרופורזה</td><td>Amilabo</td><td>ST606T</td><td>אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז&nbsp;</td></tr><tr><td>מנתח שברים מערכת CE אוטומטית</td><td>אלקטרופורזה נימית מקבילה</td><td>זריזה</td><td></td></tr><tr><td>שבר סולם DNA</td><td>Agilent</td><td>DNF-396, טווח 1-6000BP</td><td>אלקטרופורזה נימית מקבילה</td></tr><tr><td>GENTAMICIN SULFATE SALT BIOREAGENT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1264-1G</td><td>תרבית חיידקים</td></tr><tr><td>סמן מדלל ברגישות גבוהה</td><td>Agilent</td><td>DNF-373</td><td>נימי מקביל אלקטרופורזה</td></tr><tr><td>ערכת ניתוח כמותי NGS רגישות גבוהה</td><td>Agilent</td><td>DNF-474</td><td>אלקטרופורזה נימית מקבילה</td></tr><tr><td>סולם עומס מהיר 1 kb פלוס סולם DNA</td><td>NEB</td><td>N0469S</td><td>אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז&nbsp;</td></tr><tr><td>LB Broth, VegitoneNutriSelect Plus</td><td>Millipore</td><td>28713</td><td>תרבית חיידקים</td></tr><tr><td>Master Mix PCR High Fidelity Phusion Flash</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F548L</td><td>PCR</td></tr><tr><td>Primers</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>PCR</td></tr><tr><td>Prosize תוכנת ניתוח נתונים v.4</td><td>Agilent</td><td>V.4</td><td>אלקטרופורזה נימית מקבילה</td></tr><tr><td>בדיקות Qubit</td><td>Invitrogen</td><td>MAN0010876</td><td>כימות DNA</td></tr><tr><td>Qubit dsDNA HS ערכת בדיקה</td><td>LIFE TECHNOLOGIES SAS</td><td>Q32854</td><td>כימות DNA</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td>Ep שיפועים</td><td>PCR</td></tr><tr><td>UVbox, eBOX VX5</td><td>Vilber Lourmat</td><td></td><td>Agarose ג'ל אלקטרופורזה הדמיה</td></tr><tr><td>מים להכנה להזרקה</td><td>Aguettant</td><td>PROAMP</td><td>PCR</td></tr></tbody></table>

מעקב אחר הדינמיקה של וריאנטים מבניים באוכלוסיות שהתפתחו בניסוי

Following the Dynamics of Structural Variants in Experimentally Evolved Populations

וריאנטים מבניים (SVs) (כלומר, מחיקות, הוספות, כפילויות והיפוכים) ידועים כיום כממלאים תפקיד חשוב בווריאציה פנוטיפית, וכתוצאה מכך בתהליכים כגון קביעת מחלות או הסתגלות לסביבה חדשה. עם זאת, וריאנטים של נוקלאוטידים בודדים מקבלים הרבה יותר תשומת לב מאשר SVs, כנראה משום שקל יותר לזהות אותם, וההשפעות הפנוטיפיות שלהם קלות יותר לחיזוי. הפיתוח של טכנולוגיות ריצוף עמוק לקריאה קצרה וארוכה שיפר מאוד את הזיהוי של SVs, אך כימות התדירות שלהם מנתוני ריצוף מאוגד (poolseq) עדיין מורכב ויקר מבחינה טכנית.
כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה וזולה למדי, המאפשרת לחוקרים לעקוב אחר הדינמיקה של תדירות אלל SV. כדוגמה ליישום, אנו עוקבים אחר התדירות של החדרת רצף החדרה (IS) באוכלוסיות אבולוציוניות ניסיוניות של חיידקים. שיטה זו מבוססת על תכנון שלישיות פריימרים סביב גבולות הווריאנטים המבניים, כך שהאמפליקונים המיוצרים על ידי הגברה של האללים מסוג פרא (WT) ונגזרים נבדלים בגודלם בלפחות 5%, וכי יעילות ההגברה שלהם דומה. הכמות של כל אמפליקון נקבעת על ידי אלקטרופורזה נימית מקבילה ומנורמלת לעקומת כיול. ניתן להרחיב שיטה זו בקלות לכימות התדירות של וריאנטים מבניים אחרים (מחיקות, כפילויות והיפוכים) ולגישות pool-seq של אוכלוסיות טבעיות, כולל אוכלוסיות פתוגנים בתוך המטופל.

באמצעות דנ"א שהופק משיבוט קדמון ושיבוט היפרמוטטור שבודד מאוכלוסיית S2.11 בדור 1,000, ביססנו את עקומת הכיול שמוצגת באיור 2. הפרופורציות המוטנטיות בפועל מתערובות דנ"א שהוכנו במעבדה ונמדדו על ידי מכשיר אלקטרופורזה נימית מקביל קושרו על ידי יחס ליניארי של שיפוע 1.0706, עם R2 של 0.9705. בנוסף, היה הסכם טוב בין העתקים ביולוגיים; סטיית התקן הייתה בין 0.61 ל-17.74 לאורך תשע הנקודות של עקומת התקן.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/64709/6...

פיתחנו שיטה חסכונית לעקוב אחר דינמיקת אלל פולימורפיזם של נוקלאוטידים שאינם יחידים, שניתן להתאים בקלות לארכיונים קפואים של אבולוציה ניסיונית. טכניקת PCR משולשת שולבה עם אלקטרופורזה אוטומטית מקבילית של נימים כדי לכמת את התדירות היחסית של אלל החדרה במהלך האבולוציה הניסויית.

Structural variants (SVs) (i.e., deletions, insertions, duplications, and inversions) are now known to play an important role in phenotypic variation, and ...

וריאנטים מבניים כגון החדרות, מחיקות, כפילויות והיפוכים היו בעבר קשים יותר למעקב ניסיוני, ולא ניתן למדוד במדויק את התדרים שלהם על ידי ריצוף אמפליקון. כאן אנו מספקים טכניקה פשוטה וחסכונית, אשר משלבת עיצוב פריימר משולש ואלקטרופרזה נימית מקבילית כדי לעקוב אחר תדרי אלל משתנים מבניים לאורך זמן. שיטה זו נועדה להשלים את ריצוף נקודות הקצה באבולוציה הניסויית ולשחזר את התדרים של אללי דה נובו מתפתחים.אנו מקווים ששיטה זו תועיל גם לאלה העובדים עם נתוני פתוגן תוך מארחים. מי שתדגים את ההליך תהיה ז'אן המט, עוזרת מחקר מהמעבדה שלנו. השלבים השונים של השיטות יוצגו במקרה שבו האלל הנגזר נובע מהחדרת IS10 לגן חיידקי הנקרא mutS.ראשית, תכננו זוג פריימרים כדי להגביר אמפליקון קצר על האלל מסוג פרא סביב אתר החדרת המוטנטים. עצבו פריימר פריימר שלישי קדימה שניים בתוך רצף ההחדרה כדי ליצור משתנה גודל קל ממגבר הסוג הפראי. התחילו בחילוץ דנ"א מתרביות של 24 שעות ביממה של שיבוטים קבועים של אללים מסוג בר ומוטנטי.לאחר כימות הדנ"א, מדללים כל תמצית דנ"א לחמישה ננוגרם למיקרוליטר עם מים. תקן את שתי הדגימות ביחס של 50/50. הגדר תגובה של 20 מיקרוליטר המכילה 10 ננוגרם של דגימת DNA, פריימרים ותערובת מאסטר PCR.לאחר מכן, להפריד את מוצר PCR על ידי אלקטרופורזה, באמצעות ג'ל agarose 2%. יש לאמת את הבדלי הגודל בין האמפליקונים מהסוג הפראי לבין המוטציה על הג'ל. כדי לקבל עקומת כיול, התחילו בערבוב הדנ"א הפראי והדנ"א המוטנטי ביחסים שונים.לדלל את מוצרי PCR לריכוז של 0.1 ננוגרם למיקרוליטר. להכנת ג'ל ההפרדה, מערבבים את הג'ל הטרי והצבע. החלף את מאגר הכניסה.מקם את חיץ השטיפה במיקום המגירה הנכון של מכשיר האלקטרופורזה הנימית המקביל. הוסף 22 מיקרוליטר של סמן מדלל לבארות של צלחת באר 96. עכשיו להוסיף שני מיקרוליטר של מוצרי PCR מדולל לכל מדגם היטב.לאחד ובכן, להוסיף סולם גודל DNA מתוך ערכת רגישות גבוהה, החל אחד עד 6, 000 זוגות בסיס בגודל. מקם את צלחת המיקרו במכשיר אלקטרופורזה נימית מקבילה בהפעלה נבחרת על תוכנת המכשיר. נתח את התוצאות באמצעות תוכנת ניתוח הנתונים.ראשית, זהה את הפסגות על פי גודלן הידוע. כמת כל אמפליקון כדי ליצור עקומת כיול. לבסוף, ודא כי הכמויות היחסיות של שני האללים נמדדות כראוי.עקומת כיול זו משמשת לאחר מכן לחישוב כמות הווריאנטים המבניים לאחר הגברת PCR ואלקטרופורזה נימית מקבילית. תוצאות מייצגות אלה עוקבות אחר החדרה משבשת של הגן mutS. Knockdowns ו-mutS מובילים לפנוטיפ היפר-מוטטור, המאפשר לחיידקים לדגום יותר מוטציות משיעור המוטציות הבסיסי שלהם.באמצעות השיטה שהוצגה, בוצע מעקב אחר תדירות הווריאנטים המבניים mutS לאורך 1000 דורות. נחשף מסלול לא מונוטוני של האלל המוטנטי המתהווה. האלל המוטנטי זוהה לראשונה בדור 680.לאחר מכן האלל עלה במהירות בתדירותו, והגיע ל-67% בדור 713. עלייה זו קפאה על שמריה, וגדלה רק ב-10% במהלך 53 הדורות הבאים, ל-76%באופן בלתי צפוי, תדירות האלל המוטנטי ירדה אז מ-76% ל-49% במהלך 13 דורות, ולאחר מכן היא עלתה לקיבוע. שיטה זו תועיל לאלה העובדים על אבולוציה ניסיונית.פרוטוקול זה מאפשר למשתמש לקחת ארכיונים קפואים ולחקור מסלולים אבולוציוניים שאחרת לא ניתן לצפות בהם עם נתוני ריצוף נקודות קצה.

following-dynamics-structural-variants-experimentally-evolved

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

אסטרטגיה גנטית מולקולרית למציאת דה נובו מוטציות גרימת הפרעות שכיחות כמו אוטיזם וסכיזופרניה.

אסטרטגיה לזהות מוטציות דה נובו בהפרעות נפוצות כגון אוטיזם וסכיזופרניה

עמידות לתרופות לטיפולים ממוקדים היא נרחבת והצורך לזהות מנגנונים של התנגדות - לפני או אחרי הופעה קלינית - היא קריטי להדרכת אסטרטגיות ניהול קליניות חלופיות. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לגזירה כמה קווים עמידים לתרופות במבחנה עם רצף לזרז גילוי המנגנונים אלה.

הטמעה של<em&gt; במבחנה</em&gt; תרופות מבחני התנגדות: למקסם את הפוטנציאל לחשיפת מנגנוני התנגדות קלינית רלוונטיים

אנו מציגים תוכנית אסטרטגית ופרוטוקול לזיהוי וריאנטים גנטיים לא מקודדים המשפיעים על קשירת ה-DNA של גורם השעתוק (TF). פרוטוקול ניסיוני מפורט מסופק לבדיקת משמרת ניידות אלקטרופורטית (EMSA) וניתוח משקעים של זיקה ל-DNA (DAPA) של קשירת TF DNA תלויה בגנוטיפ.

הקרנה עבור וריאנטים גנטיים ללא קידוד תפקודיים באמצעות ניידות Electrophoretic Shift Assay (Emsa) ו Assay משקע זיקת DNA (DAPA)

כאן, אנו מציגים פרוטוקול להשיג אבולוצית מעבדה אדפטיבית של מיקרואורגניזמים בתנאים באמצעות תרבות chemostat. כמו כן, ניתוח גנטי של הזן התפתח נדון.

נוהל מסתגל מעבדת האבולוציה של מיקרואורגניזמים שימוש Chemostat

מסגרת החברה מאפשרת תרבות רציפה ומיקרוביאלית של תפוקה גבוהה עם רזולוציה גבוהה ושליטה דינמית על פרמטרים ניסיוניים. פרוטוקול זה מדגים כיצד להחיל את המערכת על מנת לבצע ניסוי כושר מורכב, המנחה את המשתמשים בתיכנות אוטומטי של שליטה על תרבויות בודדות, מדידת, איסוף ואינטראקציה עם נתונים ניסיוניים בזמן אמת.

עיצוב אוטומטי, תפוקה גבוהה, ניסויים בגידול תאים רציפים באמצעות הפיתוח

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את העיצוב ואת הביצועים של ניסויים vivo ב Drosophila ילה melanogaster כדי להעריך את ההשלכות הפונקציונליות של משתנים גנים נדירים הקשורים למחלות האדם.

במחקר פונקציונלי Vivo של מחלות-הקשורים משתנים אנושיים נדירים באמצעות Drosophila ילה

פלטפורמה חישובית אנליטית זו מספקת הדרכה מעשית למיקרוביולוגים, אקולוגים ואפידמיולוגים המתעניינים בגנומיקה של אוכלוסיית החיידקים. באופן ספציפי, העבודה שהוצגה כאן הדגימה כיצד לבצע: א) מיפוי מונחה פילוגניה של גנוטיפים היררכיים; 2) ניתוח מבוסס תדרים של גנוטיפים; 3) ניתוחי קרבה וקלונליות; 4) זיהוי של שושלת המבדילה בין לוקים לאביזר.

כרייה היוריסטית של גנוטיפים היררכיים וגושים של גנום עזר באוכלוסיות חיידקים

פרוטוקול זה מתאר כיצד לשמור על ניסוי האבולוציה לטווח ארוך של Escherichia coli (LTEE) על ידי ביצוע ההעברות היומיות והקפאות תקופתיות שלו, וכיצד לבצע מבחני תחרות למדידת שיפורי כושר בחיידקים מפותחים. הליכים אלה יכולים לשמש כתבנית לחוקרים המתחילים ניסויים משלהם באבולוציה מיקרוביאלית.

העברות יומיות, אחסון אוכלוסיות בארכיון ומדידת כושר בניסוי האבולוציה ארוך הטווח עם Escherichia coli

נוכחי HIV-1 אסטרטגיות לפעול כדי לדכא את מחזור החיים של נגיפי אבל לא יעיל למיגור זיהום. כאן, אנו מראים כי recombinase מהונדסים יכולים הבלו ביעילות משולב DNA HIV-1 proviral מן הגנום של תאים נגועים.

ראיון: HIV-1-DNA כריתה Proviral שימוש recombinase התפתח

אנו מתארים תהליך באמצעות לייזר ללכוד microdissection לבודד תמצית RNA מתוך אוכלוסייה הומוגנית תא, עצב פירמידליים, בשכבה III של gyrus הזמני מעולה במוח האנושי שלאחר המוות. לאחר מכן אנו להגביר באופן ליניארי (T7 מבוססי) mRNA, ועל להכליא את המדגם כדי האנושית Affymetrix X3P microarray.

קבלת RNA איכות גבוהה מאוכלוסיות תא בודד בתוך רקמות המוח האנושי שלאחר המוות

חקור שיטה חדשנית לעקוב אחרי דינמיקת וריאנטים מבניים באבולוציה ניסויית באמצעות PCR משולש ואלקטרופורזה קפילרית מקבילית. השיטה מאפשרת מעקב אחרי שינויי תדרי אללים לאורך זמן בחיידקים.

מעקב אחר הדינמיקה של וריאנטים מבניים באוכלוסיות שהתפתחו בניסוי

גלה סרטונים נוספים