Name: חקר סטיות X כרומוזומליות בתאי שחלה באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-04-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 11 min 8 s
Description: חקור שיטות FISH לניתוח תוכן כרומוזום X בתאי שחלה בנשים עם סטיות כרומוזומליות. טכניקות אלו מאפשרות הבנה מעמיקה של פוטנציאל רבייה בקבוצה זו ותומכות במחקר עתידי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים למרג'ו ואן בראקל, דומיניק סמיטס, גיום ואן דה זנדה, פטרישיה ואן קליף ומילאן אינטזאר על מומחיותם ועזרתם הטכנית. מקורות מימון: Merck Serono (A16-1395), Goodlife ו-Ferring.

פרוטוקול מחקר TurnerFertility אושר על ידי הוועדה המרכזית למחקר המערב נבדקים אנושיים (NL57738.000.16). במחקר זה התקבלה רקמת קליפת המוח השחלתית של 93 נשים עם TS. חומרים הדורשים אמצעי בטיחות מפורטים בטבלה 1.
טבלה 1: אמצעי בטיחות.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>חומר</td>
			<td colspan="3">הזארד</td>
		</tr><tr><td>חומצה אצטית</td>
			<td colspan="3">כוויות עור חמורות וגירוי של מערכת הנשימה</td>
		</tr><tr><td>קולגנאז</td>
			<td colspan="3">מגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור</td>
		</tr><tr><td>דאפי</td>
			<td colspan="3">מגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור</td>
		</tr><tr><td>DNase I</td>
			<td colspan="3">מגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור</td>
		</tr><tr><td>אתנול</td>
			<td colspan="3">דליק מאוד</td>
		</tr><tr><td>פורמלדהיד</td>
			<td colspan="3">רעיל לאחר שאיפה, בליעה ומגע עם העור</td>
		</tr><tr><td>פורממיד (בבדיקות פלואורסצנטיות)</td>
			<td colspan="3">עלול לפגוע בילד שטרם נולד</td>
		</tr><tr><td>ליבראסה</td>
			<td colspan="3">מגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור</td>
		</tr><tr><td>מתנול</td>
			<td colspan="3">דליק מאוד, רעיל בשאיפה, בליעה ומגע עם העור</td>
		</tr><tr><td>נונידט P40</td>
			<td colspan="3">מגרה את העור או העיניים</td>
		</tr><tr><td>פפסין</td>
			<td colspan="3">מגרה את העיניים, מערכת הנשימה והעור</td>
		</tr><tr><td>פרוטאינאז K</td>
			<td colspan="3">קשיי נשימה לאחר שאיפה</td>
		</tr><tr><td>קסילן</td>
			<td colspan="3">דליק מאוד, רעיל לאחר שאיפה ומגע עם העור. יש להימנע ממגע עם העיניים.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: חומרים הדורשים אמצעי בטיחות.
1. דגים על תאי קליפת שחלה בודדים מבודדים
<ol><li>דיסוציאציה של רקמת קליפת השחלות כדי להשיג תאים בודדים<ol><li>חתכו את רקמת קליפת השחלות המשומרת/מופשרת לחתיכות קטנות של כ-1 מ"מ x 1 מ"מ x 1 מ"מ באמצעות אזמל.</li>
		<li>לעכל אנזימטית את מקטעי הרקמה ב 4 מ"ל של מחומם מראש (37 ° C) L15 בינוני המכיל 0.1 מ"ג / מ"ל תערובת אנזימי דיסוציאציה רקמה, 10 מיקרוגרם / מ"ל DNase I, ו 1 מ"ג / מ"ל collagenase I מ C. histolyticum במשך מקסימום של 75 דקות ב 37 ° C. מקפצים את תערובת העיכול מעלה ומטה כל 15 דקות.</li>
		<li>עצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת 4 מ"ל של L15 קר בתוספת 10% סרום בקר עוברי (FBS). שטפו את הרקמה המנותקת פעם אחת עם 8 מ"ל של מדיום L15 קר על ידי צנטריפוגה ב 500 x גרם והשהו מחדש ב 500 μL של מדיום L15 ללא מערבולות כדי למנוע נזק לתאים.</li>
		<li>מעבירים את תרחיף התא המכיל בעיקר תאי סטרומה בודדים וזקיקים קטנים (ביציות מוקפות בשכבה אחת של תאי גרנולוזה) לצלחת פטרי פלסטית ובוחנים את תרחיף התא תחת סטריאומיקרוסקופ (הגדלה פי 100).</li>
		<li>הרימו את הזקיקים הקטנים (<50 מיקרומטר) באופן ידני באמצעות פיפטה פלסטית של 75 מיקרומטר והעבירו את הזקיקים לטיפה של L15 בינוני בתוספת 10% FBS ב 4 °C כדי למנוע הצטברות של זקיקים. בצעו איסוף זקיקים למשך 30 דקות לכל היותר. כדי לשפר את התפשטות תאי הזקיקים לפני ניתוח FISH, להעביר את הזקיקים מטוהרים לתמיסה של 0.06% טריפסין, 1 מ"ג / מ"ל חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA), ו 1 מ"ג / מ"ל גלוקוז לדגור במשך 20 דקות ב 37 ° C.</li>
		<li>להשיג תאי סטרומה השחלות מן ההשעיה התא קליפת המוח באמצעות פיפטה פלסטיק 75 מיקרומטר, תוך הקפדה מיוחדת כדי למנוע זיהום עם זקיקים קטנים.</li>
	</ol></li>
	<li>ניתוח FISH של תאי שחלה בודדים<ol><li>העבר את זקיקי השחלות המטופלים (מומלץ n = 5-20) עם טריפסין/EDTA/גלוקוז או תאי סטרומה (n > 1,000) לטיפות של 5 μL של 0.15 mM KCl/15 μL של מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS) על מגלשה ודגור במשך 20 דקות ב 37 ° C.</li>
		<li>יבשו וקיבעו מראש את המגלשות ב-300 מיקרוליטר של 0.05 mM KCl/7.5% חומצה אצטית/22.5% מתנול למשך 2 דקות בטמפרטורת החדר (RT). כסו את המגלשות במתנול/חומצה אצטית (3:1) למשך 2 דקות ב-RT כדי לסיים את הקיבוע.</li>
		<li>הכינו נתרן ציטראט סטנדרטי פי 20 (SSC) על ידי הוספת 876 גרם נתרן כלורי ו-441 גרם טרי-נתרן ציטראט דיהידרט ב-5 ליטר מים מזוקקים. לאחר מכן, הוסף 100 מ"ל של SSC 20x ל 900 מ"ל של מים demineralized (demi) כדי לקבל 2x SSC. שטפו את הדגימה ב-2x SSC ב-73°C, כסו אותה ב-100 μL של 2% פרוטאינאז K, ואטמו אותה בכיסוי. דגרו על המגלשות במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתחנת ההכלאה.</li>
		<li>הסר את הכיסוי ושטוף את המגלשות במשך 5 דקות ב- DPBS ב- RT. קבע את הדגימה למשך 5 דקות עם 1% פורמלדהיד ב- RT. בשלב זה, החומר עדיין אינו מחובר במלואו למגלשות הזכוכית ולכן אין להניחו על משטח ניעור.</li>
		<li>שטפו את המגלשות במשך 5 דקות ב-DPBS ב-RT, ולאחר מכן התייבשו ב-70%, 80%, 90% ו-100% אתנול למשך 2 דקות כל אחת. יבשו באוויר את הדגימה המיובשת והכליאו אותה עם בדיקות עם תווית פלואורסצנטית.</li>
		<li>בחר בדיקה ספציפית לצנטרומר עבור כרומוזום X ובדיקה צנטרומרית ספציפית לכרומוזום אחר כבקרה כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי השחלה. במקרה זה, נעשה שימוש בבדיקות ספציפיות לצנטרומרה עבור כרומוזום X (CEP X [DXZ1]) המסומן ישירות עם פלואורוכרום ספקטרוםירוק וכרומוזום 18 (CEP 18 [D18Z1]) המסומן ישירות עם פלואורוכרום ספקטרום.</li>
		<li>הוסף 1 μL של CEP X, 1 μL של CEP 18 ו- 18 μL של חיץ ההכלאה לדגימה ואטם עם מכסה המודבק לשקופיות כדי למנוע אידוי של הבדיקה במהלך הכלאה. העבר את המגלשות לתחנת ההכלאה לדנטורציה ב 73 ° C למשך 3 דקות, ואחריה הכלאה במהלך דגירה לילה ב 37 °C (77 °F).</li>
		<li>הסר את תלוש הכיסוי ואת כל הדבק שנותר מהמגלשה לאחר הכלאה. שטפו את המגלשות ב-0.4x SSC/0.3% Tween-20 ב-72°C למשך 2 דקות, ולאחר מכן דגירה למשך דקה אחת ב-2x SSC/0.1% Tween-20 ב-RT.</li>
		<li>יש לייבש את המגלשות על ידי דגירות עוקבות של 2 דקות ב-70%, 80%, 90% ו-100% אתנול ולייבש באוויר בחושך. כסו את השקופיות באמצעי הרכבה המכיל 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). יש לשמור על טמפרטורה של -20°C למשך 10 דקות לפחות לפני ניתוח על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.</li>
	</ol></li>
	<li>דימות<ol><li>בחן את האותות עבור כרומוזום X באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המקושר לתוכנת עיבוד תמונה.<ol><li>ראשית, בחר DAPI פלואורוכרום.<ol><li>קבל תמונה על-ידי בחירה באפשרות New Cell > Live > Capture בהגדלה של 630x. יופיע חלון חדש עם הסף. הגדר את הפס הכחול של הסף ל- 0 כדי למזער את הרקע ואת הסרגל האדום למקסימום (255) כדי להפוך את האותות לבהירים יותר. לחץ על קבל.</li>
				<li>יופיע חלון חדש עם שיפור עם הצעה לכהה/בהיר יותר (12), רדיוס (3) ועומק (1). השתמש בערכים המוצעים או התאם אותם אם אינך מרוצה.</li>
			</ol></li>
			<li>שנית, בחר fluorochrome SpectrumOrange ולחץ על לכידה.<ol><li>הגדר את הפס הכחול של הסף ל- 0 כדי למזער את הרקע ואת הסרגל האדום למקסימום (255) כדי להפוך את האותות לבהירים יותר. לחץ על קבל.</li>
				<li>החלון עם השיפור יופיע עם הצעה לכהה/בהיר יותר (-11), רדיוס (2.7) ועומק (0.6). השתמש בערכים המוצעים או התאם אותם אם אינך מרוצה.</li>
			</ol></li>
			<li>לבסוף, בחר fluorochrome SpectrumGreen ולחץ על לכידה.<ol><li>הגדר את הפס הכחול של הסף ל- 0 כדי למזער את הרקע ואת הסרגל האדום למקסימום (255) כדי להפוך את האותות לבהירים יותר. לחץ על קבל.</li>
				<li>החלון עם השיפור יופיע עם הצעה לכהה/בהיר יותר (0), רדיוס (3) ועומק (0). השתמש בערכים המוצעים או התאם אותם אם אינך מרוצה. שמור את התמונה בקובץ חדש שנוצר. הערה: תאים סומטיים הוערכו רק כאשר שני אותות של כרומוזום הביקורת 18 נראו. ברוב הביציות ניתן היה לזהות רק אות אחד לכל כרומוזום.</li>
			</ol></li>
		</ol></li>
		<li>אחסן את השקופיות בחושך ב- 4 ° C לאחר ניתוח כדי למנוע אובדן אותות.</li>
	</ol></li>
</ol>2. דגים על קטעי פרפין ברקמת קליפת השחלות המושתלת
הערה: שבר אחד של רקמת קליפת המוח השחלתית המשומרת/מופשרת בהקפאה של 18 נקבות עם TS הושתל בעכברים משולבים חמורים (SCID) למשך 5 חודשים. הליך הקסנוגרפטינג תואר בעבר ונערך באוניברסיטה הקתולית של לוביין (בריסל, בלגיה) בהתאם להנחיות המקומיות של הוועדה לחקר בעלי חיים בנוגע לרווחת בעלי חיים (סימוכין 2014/UCL/MD/007)18,19.
<ol><li>בחירת מקטעים של רקמת קליפת השחלות המכילה זקיקים<ol><li>קיבעו רקמת קליפת השחלות בפורמלדהיד 4% והטמיעו את הרקמה בפרפין. חותכים את הבלוקים עם אזמל כדי להסיר פרפין נוסף וחותכים את גוש הפרפין לעובי 4 מיקרומטר על מיקרוטום סיבוב.</li>
		<li>בחר כל חלק שביעי של סרט פרפין עבור צביעת hematoxylin ו eosin (HE) כדי לקבוע אילו חלקים מכילים זקיקים. שים את החלק באמבט מים ב 40-45 מעלות צלזיוס ולהרכיב אותם על שקופיות מיקרוסקופ immunohistochemistry.</li>
	</ol></li>
	<li>דה-פרפיניזציה וצביעת HE<ol><li>הניחו את המגלשות על כיריים למשך 10 דקות בטמפרטורה של 60°C, ולאחר מכן טבלו את המגלשות ב-100% קסילן למשך 5 דקות. אין צורך למקם את המגלשות ישירות על הכיריים. לחות את החלקים עבור 15 s ב 100% אתנול, ואחריו 2 x 15 s ב 96% אתנול. שטפו את המגלשות במי ברז במשך 2 דקות.</li>
		<li>הכתימו את המגלשות בהמטוקסילין למשך 10 דקות ולאחר מכן שטפו את המגלשות לזמן קצר במי ברז. לטבול בקצרה את שקופיות בתמיסת ביקרבונט (100 גרם של מגנזיום גופרתי ו 10 גרם של סודיום ביקרבונט ב 5 L של מים מזוקקים). שטפו את המגלשות במי ברז במשך 5 דקות.</li>
		<li>הכתימו את המגלשות באאוסין למשך 4 דקות וייבשו את המגלשות שלוש פעמים עם 100% אתנול, ולאחר מכן קסילן. מכסים את כתמי ה-HE בשקופיות ומעריכים את קטעי ה-HE תחת מיקרוסקופ אור כדי לבחור את המקטעים עם זקיקים (הגדלה פי 100).</li>
	</ol></li>
	<li>טיפול מקדים והכלאה של מקטעי פרפין לדגי DNA<ol><li>בחר מקטעים חדשים שהיו מונחים לפני או אחרי החלק שהכיל זקיקים מסרט הפרפין. הרכיבו קטע אחד על מגלשת זכוכית. יבשו את חלקי הפרפין למשך 45 דקות לפחות על כיריים בטמפרטורה של 56°C. אין צורך למקם את המגלשות ישירות על הכיריים.</li>
		<li>deparaffinize את החלקים ב xylene במשך 10 דקות. טבלו את המגלשות באתנול 99.5% ושטפו אותן במשך 5 דקות במי ברז. טפל מראש בשקופיות עם תמיסת אחזור מטרה (pH נמוך) למשך 10 דקות ב-96°C. לאחר הקירור, שטפו את המגלשות במים מזוקקים.</li>
		<li>טפל בשקופיות במשך 5 דקות עם חומצה הידרוכלורית 0.01 M, ולאחר מכן עיכול פפסין (200 U / mL) במשך 15 דקות ב 37 ° C. שטפו שוב את המגלשות בחומצה הידרוכלורית 0.01 M ולאחר מכן ב-PBS.</li>
		<li>קבעו את המגלשות בפורמלדהיד/PBS 1% למשך 5 דקות. שטפו את המגלשות לזמן קצר ב-PBS, ולאחר מכן שוב במי דמי. יש לייבש את המגלשות באתנול 99.5% ולתת להן להתייבש באוויר.</li>
		<li>בחר בדיקה ספציפית לצנטרומרה עבור כרומוזום X ובדיקה צנטרומרית ספציפית לכרומוזום אחר כבקרה כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי גרנולוזה. כאן, כרומוזום 18 משמש כבקרה.</li>
		<li>יש למרוח 5 μL של בדיקה CEP 18 (D18Z1) המסומנת ישירות ב-fluorochrome SpectrumGreen ו-probe CEP X (DXZ1) המסומן ישירות ב-fluorochrome SpectrumRed על השקופיות שטופלו מראש. יש למרוח כיסוי ולאטום את האזור בדבק צילום. הניחו את המגלשות בהכלאה לדנטורציה ב-80°C למשך 10 דקות והכלאה למשך לילה ב-37°C.</li>
		<li>למחרת, שטפו את המגלשות במשך 5 דקות ב-2x SSC ב-42°C, ולאחר מכן שטיפה של 2 דקות ו-1 דקות ב-0.3% Nonidet P40 ב-73°C. רענן את 2x SSC ושטוף את המגלשות שוב במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. מכסים את הקובט כך שהחלקים נשמרים בחושך.</li>
		<li>שטפו את המגלשות לזמן קצר במים מזוקקים. יש לייבש את המגלשות באתנול 99.5% ולתת להן להתייבש שוב באוויר. לבסוף, טען את השקופיות עם פתרון המכיל DAPI ואמצעי הרכבה.</li>
	</ol></li>
	<li>דימות<ol><li>נתח את התוצאות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 630x. פתח את תוכנת עיבוד התמונה במחשב. בחר FISH כפרופיל.</li>
		<li>בדוק אם פליטת DAPI מוגדרת ל- 431 ננומטר והעירור ל- 359 ננומטר, פליטה אדומה של טקסס ב- 613 ננומטר ועירור ב- 595 ננומטר, ופליטת FITC ב- 519 ננומטר ועירור ב- 495 ננומטר.</li>
		<li>רכשו תמונה באמצעות בחירה באפשרות Live > Capture Single Image. מטב את איכות התמונה באמצעות התאמת החשיפה והרווח באמצעות הזזת מחוון החשיפה והרווח בתפריט 'תמונה ' משמאל (לדוגמה, חשיפה: 212 אלפיות השנייה והרווח: 7.9). החשיפה והרווח הנדרשים עשויים להשתנות בהתאם לתמונה; שימו לב לשינויים במהלך תהליך זה לקבלת תמונה ממוטבת. שמור את התמונה בקובץ חדש שנוצר.</li>
		<li>אחסן את השקופיות בחושך ב- 4 ° C לאחר ניתוח כדי למנוע אובדן אותות.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Vander Borght, M., Wyns, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fertility+and+infertility%3A+Definition+and+epidemiology%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Fertility and infertility: Definition and epidemiology.</a> Clinical Biochemistry. 62, 2-10 (2018).</li>
<li>Yatsenko, S. A., Rajkovic, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetics+of+human+female+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Biology+of+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Genetics of human female infertility.</a> Biology of Reproduction. 101 (3), 549-566 (2019).</li>
<li>Yahaya, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosomal+abnormalities+predisposing+to+infertility%2C+testing%2C+and+management%3A+a+narrative+review%5BTitle%5D)+AND+%22Bulletin+of+the+National+Research+Centre%22%5BJournal%5D)">Chromosomal abnormalities predisposing to infertility, testing, and management: a narrative review.</a> Bulletin of the National Research Centre. 45 (1), 65(2021).</li>
<li>Foresta, C., Ferlin, A., Gianaroli, L., Dallapiccola, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Guidelines+for+the+appropriate+use+of+genetic+tests+in+infertile+couples%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Guidelines for the appropriate use of genetic tests in infertile couples.</a> European Journal of Human Genetics. 10 (5), 303-312 (2002).</li>
<li>Heard, E., Turner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Function+of+the+sex+chromosomes+in+mammalian+fertility%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Perspectives+in+Biology%22%5BJournal%5D)">Function of the sex chromosomes in mammalian fertility.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 3 (10), 002675(2011).</li>
<li>Reynaud, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Number+of+ovarian+follicles+in+human+fetuses+with+the+45%2CX+karyotype%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Number of ovarian follicles in human fetuses with the 45,X karyotype.</a> Fertility and Sterility. 81 (4), 1112-1119 (2004).</li>
<li>Otter, M., Schrander-Stumpel, C. T., Curfs, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Triple+X+syndrome%3A+a+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22European+Journal+of+Human+Genetics%22%5BJournal%5D)">Triple X syndrome: a review of the literature.</a> European Journal of Human Genetics. 18 (3), 265-271 (2010).</li>
<li>Modi, D. N., Sane, S., Bhartiya, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+germ+cell+apoptosis+in+sex+chromosome+aneuploid+fetal+human+gonads%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Accelerated germ cell apoptosis in sex chromosome aneuploid fetal human gonads.</a> Molecular Human Reproduction. 9 (4), 219-225 (2003).</li>
<li>Hassold, T., Hunt, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((To+err+%28meiotically%29+is+human%3A+the+genesis+of+human+aneuploidy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">To err (meiotically) is human: the genesis of human aneuploidy.</a> Nature Reviews Genetics. 2 (4), 280-291 (2001).</li>
<li>Huber, D., von Voithenberg, L. V., Kaigala, G. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%3A+History%2C+limitations+and+what+to+expect+from+micro-scale+FISH%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+and+Nano+Engineering%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH): History, limitations and what to expect from micro-scale FISH.</a> Micro and Nano Engineering. 1, 15-24 (2018).</li>
<li>Hu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29%3A+an+increasingly+demanded+tool+for+biomarker+research+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Biomarker+Research%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization (FISH): an increasingly demanded tool for biomarker research and personalized medicine.</a> Biomarker Research. 2 (1), 3(2014).</li>
<li>Hwang, K., Weedin, J. W., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+fluorescent+in+situ+hybridization+in+male+infertility%5BTitle%5D)+AND+%22Therapeutic+Advances+in+Urology%22%5BJournal%5D)">The use of fluorescent in situ hybridization in male infertility.</a> Therapeutic Advances in Urology. 2 (4), 157-169 (2010).</li>
<li>Ramasamy, R., Besada, S., Lamb, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+in+situ+hybridization+of+human+sperm%3A+diagnostics%2C+indications%2C+and+therapeutic+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Fluorescent in situ hybridization of human sperm: diagnostics, indications, and therapeutic implications.</a> Fertility and Sterility. 102 (6), 1534-1539 (2014).</li>
<li>Chatziparasidou, A., Christoforidis, N., Samolada, G., Nijs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sperm+aneuploidy+in+infertile+male+patients%3A+a+systematic+review+of+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Andrologia%22%5BJournal%5D)">Sperm aneuploidy in infertile male patients: a systematic review of the literature.</a> Andrologia. 47 (8), 847-860 (2015).</li>
<li>Schleedoorn, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TurnerFertility+trial%3A+PROTOCOL+for+an+observational+cohort+study+to+describe+the+efficacy+of+ovarian+tissue+cryopreservation+for+fertility+preservation+in+females+with+Turner+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22BMJ+Open%22%5BJournal%5D)">TurnerFertility trial: PROTOCOL for an observational cohort study to describe the efficacy of ovarian tissue cryopreservation for fertility preservation in females with Turner syndrome.</a> BMJ Open. 9 (12), 030855(2019).</li>
<li>Peek, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+follicles+of+young+patients+with+Turner%27s+syndrome+contain+normal+oocytes+but+monosomic+45%2CX+granulosa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Ovarian follicles of young patients with Turner's syndrome contain normal oocytes but monosomic 45,X granulosa cells.</a> Human Reproduction. 34 (9), 1686-1696 (2019).</li>
<li>Nadesapillai, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+some+patients+with+45%2CX+Turner+syndrome+fertile%3F+A+young+girl+with+classical+45%2CX+Turner+syndrome+and+a+cryptic+mosaicism+in+the+ovary%5BTitle%5D)+AND+%22Fertility+and+Sterility%22%5BJournal%5D)">Why are some patients with 45,X Turner syndrome fertile? A young girl with classical 45,X Turner syndrome and a cryptic mosaicism in the ovary.</a> Fertility and Sterility. 115 (5), 1280-1287 (2021).</li>
<li>Dolmans, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reimplantation+of+cryopreserved+ovarian+tissue+from+patients+with+acute+lymphoblastic+leukemia+is+potentially+unsafe%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Reimplantation of cryopreserved ovarian tissue from patients with acute lymphoblastic leukemia is potentially unsafe.</a> Blood. 116 (16), 2908-2914 (2010).</li>
<li>Dath, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xenotransplantation+of+human+ovarian+tissue+to+nude+mice%3A+comparison+between+four+grafting+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Reproduction%22%5BJournal%5D)">Xenotransplantation of human ovarian tissue to nude mice: comparison between four grafting sites.</a> Human Reproduction. 25 (7), 1734-1743 (2010).</li>
<li>Cacciottola, L., Donnez, J., Dolmans, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+tissue+damage+after+grafting%3A+systematic+review+of+strategies+to+improve+follicle+outcomes%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+BioMedicine+Online%22%5BJournal%5D)">Ovarian tissue damage after grafting: systematic review of strategies to improve follicle outcomes.</a> Reproductive BioMedicine Online. 43 (3), 351-369 (2021).</li>
<li>Bishop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applications+of+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+in+detecting+genetic+aberrations+of+medical+significance%5BTitle%5D)+AND+%22Bioscience+Horizons%22%5BJournal%5D)">Applications of fluorescence in situ hybridization (FISH) in detecting genetic aberrations of medical significance.</a> Bioscience Horizons. 3 (1), 85-95 (2010).</li>
<li>Burgoyne, P. S., Mahadevaiah, S. K., Turner, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+consequences+of+asynapsis+for+mammalian+meiosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The consequences of asynapsis for mammalian meiosis.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (3), 207-216 (2009).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

ניתוח FISH הוא טכניקה ידועה לזיהוי סטיות כרומוזומליות X בלימפוציטים או תאי buccal של זכרים ונקבותכאחד 10. מספר מחקרים תיארו FISH על גמטות של זכרים עם סטיות כרומוזומליות X, אך מידע מפורט שהתקבל על ידי FISH על תאי שחלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X עדיין חסר14. מאמר זה מציג שיטות חדשניות המבוססות על FISH כדי לקבוע אם אנופלואידיות קיימת בתאי השחלות של רקמת קליפת המוח השחלתית הלא מושתלת ומושתלת מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X.
האתגר העיקרי של הפרוטוק...

אי פוריות היא בעיה בריאותית של מערכת הרבייה הגברית או הנשית, המשפיעה על כ -186 מיליון אנשים בגיל הפוריות ברחבי העולם1. לפחות 35% מהזוגות העקרים, אי פוריות נגרמת על ידי הפרעה של מערכת הרבייה הנשית2. ישנם גורמים רבים שיכולים לגרום לאי פוריות נשית, כגון גורמים גנטיים, הפרעות בדרכי המין, תפקוד אנדוקריני, מחלות דלקתיות וטיפול יאטרוגני3.
הפרעות גנטיות קיימות בכ -10% מהנקבות העקרים 4,5. מכל ההפרעות הגנטיות, סטיות כרומוזום X הן הגורם השכיח ביותר לדיסגנזה שחלתית2. מספר מחקרים דיווחו כי סטיות כרומוזומליות X אצל נשים עם תסמונת טרנר (TS) או תסמונת X משולש קשורות לאי ספיקת שחלות מוקדמת עקב אובדן מואץ של תאי נבט או פגיעה באוגנזה 6,7,8.
ניתן לחלק סטיות של כרומוזום X ל: 1) סטיות מספריות, שבהן מספר כרומוזומי X שונה אך כרומוזומי X שלמים; ו-2) סטיות מבניות, שבהן כרומוזום X צבר או איבד חומר גנטי 3,9. סטיות מספריות של כרומוזום X שכיחות יותר מהפרעות מבניות ונגרמות לעיתים קרובות על ידי טעויות ספונטניות במהלך חלוקת התא 3,9. כאשר שגיאה כזו מתרחשת במהלך מיוזה, היא עלולה להוביל לגמטות אנאופלואידיות ובסופו של דבר לצאצאים עם סטיות כרומוזומליות בכל התאים. כאשר פגמים כרומוזומים מתעוררים בתאים סומטיים כתוצאה מטעויות המתרחשות במהלך מיטוזה בשלבים המוקדמים של האונטוגנזה, הדבר עלול להוביל למוזאיקה. אצל אנשים אלה, שני תאים עם תוכן כרומוזומלי X נורמלי ותאים עם סטיות כרומוזומליות X נמצאים.
בשנות ה-80 של המאה ה-20 פותחה שיטה ציטוגנטית הנקראת הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לדמיין ולאתר רצפים ספציפיים של חומצות גרעין על כרומוזומים מטא-פאזיים ובין-פאזיים10,11. טכניקה זו משתמשת בבדיקות DNA עם תווית פלואורסצנטית כדי להיקשר לרצף מסוים בכרומוזום, אשר לאחר מכן ניתן לדמיין באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
כיום, FISH נמצא בשימוש נרחב ככלי אבחון קליני ונחשב לתקן הזהב באיתור סטיות כרומוזומליות10. בתחום רפואת הרבייה, ניתוח FISH על זרע שימש כדי לקבל תובנה לגבי התוכן כרומוזומלי X של זרעונים אצל גברים עם סטיות כרומוזומליות מספריות או מבניות בתאים סומטיים12,13,14. מחקרים אלה הראו כי גברים עם סטיות כרומוזומליות היו בסיכון גבוה יותר להיות בעלי תדירות גבוהה יותר של זרעונים אנאופלואידים נוכחים בזרע שלהם בהשוואה לזכרים עם קריוטיפים נורמליים12,13,14.
בניגוד לזרעונים, מעט מאוד ידוע על התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה (כולל ביציות, תאי גרנולוסה/תקה ותאי סטרומה) אצל אנשים עם סטייה כרומוזומלית, כמו גם על ההשלכות האפשריות של אנופלואידיות של תאים אלה על פוטנציאל הרבייה שלהם. סיבה חשובה למידע המועט על הקריוטיפ של תאי השחלות בהשוואה לזרעונים היא העובדה שנשים צריכות לעבור הליך פולשני כגון ניקוב זקיק או ניתוח להשגת ביציות או רקמת קליפת השחלות. לכן, קשה להשיג גמטות נקביות למטרות מחקר.
כיום, מחקר התערבות תצפית מבוצע בהולנד כדי לחקור את היעילות של שימור בהקפאה של רקמת השחלות בנשים צעירות עם TS15. מקטע אחד של רקמת קליפת השחלות של המטופלת היה זמין לזיהוי התוכן כרומוזומלי X של תאי השחלה16,17. במסגרת המחקר פותחה שיטה חדשנית המבוססת על FISH של רקמת קליפת השחלות המנותקת כדי לקבוע אם קיימות סטיות כרומוזומליות בתאי שחלה בנקבות הנושאות סטייה כרומוזומלית בתאים סומטיים שאינם שחלתיים, כגון לימפוציטים או תאים בוקאליים. בנוסף, נקבעה גם השפעת האנאופלואידיות בתאי השחלה על פוליקולוגנזה. לשם כך שונה פרוטוקול FISH מבוסס המאפשר ניתוח של מקטעים היסטולוגיים ברקמת קליפת השחלות לאחר פוליקולוגנזה מלאכותית במהלך השתלת קסנו ארוכת טווח בעכברים מדוכאי חיסון. במחקר זה אנו מציגים שתי שיטות המבוססות על FISH לקביעת התוכן הכרומוזומלי X בתאי שחלה ברקמת קליפת השחלות הלא מושתלת ומושתלת בנקבות עם סטיות כרומוזומליות X, במטרה לשפר את המדע הבסיסי בנושא זה.

<table><tbody><tr><td>חומצה אצטית</td><td>Biosolve BV</td><td>0001070602BS</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 1200</td><td>Hettich אוניברסלי</td><td>4140</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז I</td><td>Sigma</td><td>131470</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>VWR</td><td>0631-0146</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>וקטור</td><td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>דולבקו s פוספט חוצץ מלח&nbsp;</td><td>Lonza</td><td>BE17-513Q</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Merck</td><td>108421</td><td></td></tr><tr><td>Eosin-Y</td><td>Sigma</td><td>1159350100</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>EMSURE</td><td>1009832500</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>טכנולוגיית חיים</td><td>10100147</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי למקטעים DM4 B</td><td>Leica Microsystems&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי A1</td><td>Zeiss AXIO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>בדיקות עם תווית פלואורסצנטית לתאים מנותקים</td><td>אבוט דיאגנוסטיקה</td><td>CEPX (DXZ1) 05J1023 CEP18 (D18Z1) 05J0818</td><td></td></tr><tr><td>בדיקות עם תווית פלואורסצנטית לקטעי רקמות</td><td>אבוט דיאגנוסטיקס</td><td>CEP X (DXZ1 05J08-023 CEP 18 (D18Z1)&nbsp; 05J10-028</td><td></td></tr><tr><td>פורמלדהיד</td><td>דבק 108337</td><td></td> סיגמא 252549 <td></td></tr><tr><td>גלוקוז</td><td>מרק</td><td></td> (Fixogum)Leica Microsystems LK071A המטוקסילין סיגמא 1159380025 מאגר הכלאה Abott Diagnostics 32-804826/06J67-001 תחנת הכלאה&nbsp;<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dako</td><td>S2451</td><td></td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>Merck</td><td>1003171000</td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לעיבוד תמונה תאי קליפת השחלה בודדים (Cytovision 7.7)</td><td>Leica Biosystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>תוכנה לעיבוד תמונה על חתכי פראפין&nbsp;</td><td>Leica Application Suitex (3.7.5.24914)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ אימונוהיטוכימיה</td><td>Dako</td><td>K802021-2</td><td></td></tr><tr><td>L15</td><td>Lonza</td><td>12-700Q</td><td></td></tr><tr><td>Liberase DH</td><td>Roche</td><td>05 401 151 001</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td>Zeiss מערב גרמניה</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום סולפט</td><td>Merck</td><td>A335586</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Honeywell</td><td>14262-1L</td><td></td></tr><tr><td>הרכבה בינונית</td><td>Vectashield, וקטור</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Nonidet P40</td><td>Sigma</td><td>7385-1L</td><td></td></tr><tr><td>פרפין</td><td>Poth Hile</td><td>2712.20.10</td><td></td></tr><tr><td>פפסין</td><td>סיגמא</td><td>P7000-25G</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>Gibco</td><td>11530546</td><td></td></tr><tr><td>פלסטיק פיפטה</td><td>CooperSurgical</td><td>7-72-4075/1</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי&nbsp;</td><td>Merck</td><td>1049361000</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Qiagen</td><td>19131</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוטום סיבוב HM 355S</td> אזמל <td>תרמו מדעי</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Dahlhausen</td><td>11.000.00.515</td><td></td></tr><tr><td>שקופית לדגים על תאים מנותקים</td><td>תרמו מדעי</td><td>J1810AM1JZ</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ביקרבונט</td><td>סיגמא</td><td>55761-500G</td><td></td></tr><tr><td>נתרן ציטראט סטנדרטי (SSC)</td> <td>פישר מדעי, Invitrogen</td><td>10515203</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ IX 70</td> פתרון אחזור מטרה <td>אולימפוס</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; &nbsp;</td><td>Dako</td><td>GV80511-2</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Sigma</td><td>T4799</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>ThermoFisher</td><td>85113</td><td></td></tr><tr><td>Xylene</td><td>BOOM</td><td>760518191000</td><td></td></tr></tbody></table>

חקר סטיות x כרומוזומליות בתאי שחלה באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרו

Exploring X Chromosomal Aberrations in Ovarian Cells by Using Fluorescence In Situ Hybridization

מיליוני אנשים ברחבי העולם מתמודדים עם נושאים הקשורים לפוריות. ירידה בפוריות, או אפילו אי פוריות, עשויה לנבוע מסיבות רבות ושונות, כולל הפרעות גנטיות, אשר הפרעות כרומוזומליות הן הנפוצות ביותר. הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) היא שיטה ידועה ונפוצה לאיתור סטיות כרומוזומליות בבני אדם. FISH משמש בעיקר לניתוח הפרעות כרומוזומליות בזרעונים של זכרים עם סטיות כרומוזומליות מספריות או מבניות. יתר על כן, טכניקה זו מיושמת לעתים קרובות גם אצל נשים כדי לזהות סטיות כרומוזומליות X הידועות כגורמות לדיסגנזה שחלתית. עם זאת, מידע על התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X בלימפוציטים ו / או תאים buccal עדיין חסר.
מטרת מחקר זה היא לקדם מחקר בסיסי לגבי סטיות כרומוזומליות X בנקבות, על ידי הצגת שתי שיטות המבוססות על FISH לזיהוי התוכן הכרומוזומלי X של תאי השחלה. ראשית, מתוארת שיטה לקביעת התוכן הכרומוזומלי X של תאי שחלה מבודדים (ביציות, תאי גרנולוזה ותאי סטרומה) ברקמת קליפת השחלות שלא הושתלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X. השיטה השנייה מכוונת להערכת ההשפעה של סטיות כרומוזומליות על פוליקולוגנזה על ידי קביעת התוכן הכרומוזומלי X של תאי שחלה של זקיקים משניים ואנטרליים שזה עתה נוצרו ברקמת השחלה, מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X לאחר השתלה ארוכת טווח בעכברים מדוכאי חיסון. שתי השיטות יכולות להיות מועילות במחקר עתידי כדי לקבל תובנה לגבי פוטנציאל הרבייה של נקבות עם סטיות כרומוזומליות X.

דגים על תאי שחלה מבודדים לפני ההשתלה רקמת קליפת השחלות בהקפאה מנקבות עם 45,X/46,XX (מטופלת A) או 45,X/46,XX/47,XXX (מטופלת B) TS שימשו להמחשת התוצאות באמצעות פרוטוקול זה. בחולה A, ל-50% מהלימפוציטים היה קריוטיפ 45,X ול-50% היה 46,XX. בחולה B, 38% מהלימפוציטים היו 45,X, 28% היו 46,XX ו-34% היו 47,XXX. בדיקות ספציפיות לצנטרומיר עבור כרומוזום X (ירוק) וכרומוזום 18 כביקורת (אדום) שימשו כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי גרנולוזה בודדים, תאי סטרומה וביציות שבודדו מרקמת קליפת השחלות של חולי TS ללא השתלת...

מאמר זה מציג שתי שיטות המבוססות על הכלאה פלואורסצנטית באתרו כדי לקבוע את התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה ברקמת קליפת השחלות הלא מושתלת ומושתלת מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X.

חקר סטיות X כרומוזומליות בתאי שחלה באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרו

Millions of people worldwide deal with issues concerning fertility. Reduced fertility, or even infertility, may be due to many different causes, including ...

ניתוח FISH של תאי שחלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X הוא טכניקה ייחודית כדי לקבל תובנה לגבי התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה בקבוצה ספציפית זו. טכניקות אלה יכולות להיות מועילות כדי ללמוד עוד על פוטנציאל הרבייה אצל נקבות עם סטיות כרומוזומליות X. חשוב לציין כי שתי השיטות נועדו להקל על מחקר עתידי, ואינן מיועדות לשמש ככלי אבחוני בפרקטיקה הקלינית.מי שידגימו את ההליך יהיו רונלד פיק, חוקר בכיר ממעבדת הפוריות שלנו, ומילאד אינטזר, אנליסט מהמחלקה הפתולוגית שלנו. כדי להתחיל, לחתוך את cryopreserved, או הפשיר רקמת קליפת השחלה לחתיכות קטנות של אחד אחד אחד מילימטר באמצעות אזמל. מעכלים אנזימטית את שברי הרקמה בארבעה ליטרים של L15 שחומם מראש במשך 75 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.פיפטה תערובת העיכול למעלה ולמטה כל 15 דקות. עצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת ארבעה מיליליטר של L15 קר בתוספת 10% סרום בקר עוברי, או FBS. שטפו את הרקמה המנותקת פעם אחת עם שמונה מיליליטר של מדיום L15 קר על ידי צנטריפוגה ב 500 גרם לפני השעיה מחדש של 500 מיקרוליטר של מדיום L15.העבירו את תרחיף התא המכיל בעיקר תאי סטרומה בודדים וזקיקים קטנים לצלחת פטרי מפלסטיק, ובחנו את התרחיף תחת מיקרוסקופ סטריאו. בחר את הזקיקים בגודל של פחות מ -50 מיקרומטר באופן ידני באמצעות פיפטה פלסטיק 75 מיקרומטר, והעבר אותם לטיפה של מדיום L15 בתוספת 10% FBS בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן להעביר את הזקיקים מטוהרים לתמיסה של 0.06% טריפסין, מיליגרם אחד למיליליטר EDTA, ומיליגרם אחד למיליליטר גלוקוז, ולדגור במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.לאחר הדגירה, להשיג תאי סטרומה השחלות מן תרחיף התא קליפת המוח באמצעות פיפטה פלסטיק 75 מיקרומטר. עבור הכלאה פלואורסצנטית באתר, או ניתוח FISH של תאי שחלה בודדים, להעביר את זקיקי השחלות המטופלים עם טריפסין/EDTA/גלוקוז, או תאי סטרומה לטיפות של חמישה מיקרוליטרים של 0.15 מילימולר אשלגן כלורי, ו -15 מיקרוליטר של DPBS על מגלשה, ולדגור במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. יבשו וקיבעו מראש את המגלשה ב-300 מיקרוליטר של 0.05 מילימולר אשלגן כלורי, 7.5% חומצה אצטית ו-22.5% מתנול למשך שתי דקות.מכסים את המגלשה בחומצה אצטית מתנול משולשת לאחד למשך שתי דקות לסיום הקיבוע. לאחר הקיבוע, לשטוף את הדגימה פעמיים SSC מוכן טרי ב 73 מעלות צלזיוס. כסו אותו ב-100 מיקרוליטר של 2% פרוטאינאז K ואטמו אותו בחלקת כיסוי.דוגרים על המגלשה במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתחנת ההכלאה. לאחר הדגירה, הסירו את חלקת הכיסוי ושטפו את המגלשה במשך חמש דקות ב-DPBS בטמפרטורת החדר תחת טלטול. תקן את הדגימה במשך חמש דקות עם 1% פורמלדהיד.לאחר מכן שטפו את המגלשה ב-DPBS, וייבשו אותה באופן סדרתי בהגדלת ריכוזי האתנול למשך שתי דקות כל אחת. יש לייבש את הדגימה באוויר לפני הכלאתה עם בדיקות המסומנות בפלואורסצנטית. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של CEPX, מיקרוליטר אחד של CEP18, ו -18 מיקרוליטר של חיץ ההכלאה לדגימה ואטם עם פתק כיסוי המודבק לשקופית.העבירו את המגלשה לתחנת ההכלאה לדנטורציה בטמפרטורה של 73 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות, ולאחר מכן הכלאה במהלך דגירה לילית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הכלאה, הסר את חלקת הכיסוי ואת כל הדבק שנותר מהמגלשה. שטפו את המגלשה ב-0.4X SSC, 0.3%Tween-20 ב-72 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ולאחר מכן דגירה למשך דקה אחת ב-2X SSC ו-0.1% Tween-20.יש לייבש את המגלשה כפי שהודגם ולייבש אותה באוויר בחושך לפני שתכסה אותה באמצעי הרכבה המכיל DAPI. הניחו את השקופית על מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני הניתוח במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לבצע הכלאה של מקטעי פרפין, בחר מקטעים חדשים לפני או אחרי המקטע המכיל זקיקים מרצועת הכלים של הפרפין.הרכיבו חלק אחד על מגלשת זכוכית, וייבשו אותו במשך 45 דקות על כיריים בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס. יש לפרק את החלק בקסילן למשך 10 דקות, לאחר מכן לטבול את המגלשה באתנול 99.5% ולשטוף במשך חמש דקות במי ברז. טפלו מראש במגלשה עם תמיסת שליפת המטרה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 96 מעלות צלזיוס.לאחר הקירור, שטפו את המגלשה במים מזוקקים. טפל בשקופית במשך חמש דקות עם חומצה הידרוכלורית מולרית 0.01, ואחריה עיכול פפסין במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. שטפו שוב את המגלשה בחומצה הידרוכלורית ולאחר מכן ב-PBS.תקן את השקופית ב- PBS פורמלין 1% למשך חמש דקות. לאחר מכן שטפו לזמן קצר את המגלשה ב-PBS, ושוב במים נטולי מינרלים לפני התייבשות באתנול 99.5%. החל חמישה מיקרוליטרים של בדיקה CEP18 ו- CEPX על השקופית שטופלה מראש.לאחר מכן יש למרוח כיסוי ולאטום את האזור בדבק צילום. הניחו את המגלשה בהכלאה לדנטורציה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והכלאה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את המגלשה פעמיים במשך חמש דקות כל אחת ב-SSC בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטפו במשך שתי דקות ודקה ב-0.3% Nonidet P-40 בטמפרטורה של 73 מעלות צלזיוס.שוב, שטפו את המגלשה ב-2X SSC ולאחר מכן שטפו אותה במים מזוקקים לפני ייבוש עם אתנול 99.5%. יבש את המגלשה באוויר והרכיב אותה בתווך הרכבה המכיל DAPI. רקמת קליפת השחלות בהקפאה בחולה א' הראתה 50% מהלימפוציטים, היה לה קריוטיפ 45, X ו-50% היו 46, XX.In חולה ב', 38% מהלימפוציטים היו 45, X, 28% היו 46, XX ו-34% היו 47, XXX.תאי סטרומה מסביב נותחו גם עבור תוכן כרומוזומלי X. עיכול אנזימטי של רקמת קליפת השחלות הביא להשעיה של תאים מנותקים ברובם, אך הותיר את הזקיקים הקדמוניים, המורכבים מביצית שלמה מוקפת בשכבה אחת של תאי גרנולוזיס. זקיקים קטנים סיפקו קשיים בפענוח אותות לאחר FISH, עקב התגבשות תאי הגרנולוזיס.עיכול נוסף של הזקיקים עם טריפסין לפני FISH הביא לכך שתאי גרנולוזיס בודדים התכווצו למורפולוגיה כדורית על פני השטח של הזקיקים. צביעת Hematoxylin eosin הראתה תקינות מורפולוגית של זקיקים משניים ואנטראליים ברקמת קליפת המוח השחלתית לאחר חמישה חודשים של השתלת קסנוגר. התוכן כרומוזומלי X של תאי גרנולוזיס של זקיקים אלה נקבע על ידי ניתוח FISH.קיבוע רקמת קליפת השחלות המושתלת בתמיסת Bouin הביא לאותות פלואורסצנטיים מטושטשים ומוסתרים במידה רבה בתאים פוליקולריים עקב אובך ירוק. לעומת זאת, רקמת קליפת המוח השחלתית המקובעת בפורמלדהיד סיפקה אותות פלואורסצנטיים מצוינים. האתגר העיקרי של פרוטוקול זה טמון בבידוד תאי השחלה והעיכול האנזימטי של הרקמה.חריגה מפרוטוקול זה עלולה לגרום לאובדן משמעותי של תאי שחלה במהלך התהליך, ויש להימנע מכך במיוחד אצל נקבות שכבר יש להן רזרבה שחלתית נמוכה. פרופיל ביטוי גנים נוסף יכול להיות מועיל כדי ללמוד יותר על ההשפעה של תאי שחלה אנאופלואידים על folliculogenesis, ומכאן תהליך של אי ספיקת שחלות מוקדמת אצל נשים עם סטיות כרומוזומליות X.

exploring-x-chromosomal-aberrations-ovarian-cells-using-fluorescence

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

זה וידאו מאמר זה מתאר, צעד אחר צעד, כיצד תהליך דגימת זרע כדי להשיג באיכות טובה...

פלואורסצנציה באתרו הכלאה (FISH) פרוטוקול של זרע אדם

Chromosomics: איתור של שינוי המספרי מבני 24 כרומוזומים כל אדם בו זמנית באמצעות Assay רומן דגים OctoChrome

שיטה כמותית לניתוח עיתוי שכפול כרומוזום מתוארת. השיטה מנצלת התאגדות BrdU בשילוב עם...

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

ניאון הכלאה באתרו (FISH) מאפשר זיהוי של חומצות גרעין בסביבה הטבעית שלהם בתוך תאים. אנחנו כאן מתארים פרוטוקול לזיהוי המשולב, בו זמני של RNA ו-DNA בדרך של דגים, אשר יכול לשמש כדי לחקור איון כרומוזום X בתאי גזע עובריים בעכבר.

DNA-RNA בשילוב פלורסנט<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (דגים) לחקר איון כרומוזום X בתאי גזע הבדיל נקבה עכבר עוברי

פיתחנו פרוטוקול פלואורסצנטי  ספציפי לגדיל (FISH) המותאם אישית בקלות בשילוב עם אימונופלואורסצנטיות. זה מאפשר בחינה מפורטת של דינמיקת RNA עם תובנה בו-זמנית לגבי מבנה הכרומטין, הארגון הגרעיני וויסות השעתוק ברמת התא הבודד.

המהיר פלורסנט באתר הכלאת פרוטוקול לXist RNA משולב עם Immunofluorescence של היסטון שינוי באיון כרומוזום X

הפרוטוקול הנוכחי מתאר את התועלת של הכלאה פלואורסצנטית מרובה באתרה (mFISH) וקריוטיפ ספקטרלי (SKY) בזיהוי סטיות יציבות בין-כרומוזומליות בתאי מח העצם של עכברים לאחר חשיפה לקרינה כוללת של הגוף.

איתור של סטיות יציבות אינטר-כרומוזומליות ידי קרינה נפוצה<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה (mFISH) ו ספקטרלית Karyotyping (SKY) בעכברים מוקרנים

כתב יד זה מציג שיטה מפורטת ליצירת X-כרומוזום הזרוע המחקרים וכל ביצוע קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) לבדוק את מצבה של אחותך כרומטידה לכידות ב- prometaphase, מפה של עצרתי  דרוזופילה oocytes. פרוטוקול זה מתאים לקביעת אם הזרוע meiotic לכידות הוא שלם או קטועים ב שונים אחרים.

באמצעות קרינה פלואורסצנטית בחיי עיר הכלאה (דגים) כדי לנטר את מצב היד לכידות ב- Prometaphase, מפה של אני דרוזופילה Oocytes

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לשיפור ההצלחה של פלואורסצנטיות בין פאזית בזיהוי הכלאה במקום על מריחות מח עצם מחולי מיאלומה נפוצים.

פלואורסצנטיות בין פאתית בהכלאה במקום היברידיות של מריחות מח עצם של מיאלומה נפוצה

במאמר זה אנו מתארים שיטה מבוססת אימונופלואורסנציה לכימות רמות הדנ"א החד-גדילי בתאים. שיטה יעילה וניתנת לשחזור זו יכולה לשמש לבחינת לחץ שכפול, תכונה נפוצה במספר סוגי סרטן השחלות. בנוסף, בדיקה זו תואמת צינור ניתוח אוטומטי, אשר מגביר עוד יותר את יעילותו.

כימות עקה שכפול בתאי סרטן השחלות באמצעות אימונופלואורסנציה של DNA חד-גדילי

Drosophila oogenesis ממשיכה להיות שימושית במיוחד בחקר התפשטות מיטוכונדריאלית ותורשה. כתב יד זה מתאר פרוטוקול מפורט המשמש לתיוג ה-DNA המיטוכונדריאלי המשכפל (mtDNA) בשחלות בוגרות של דרוזופילה עם 5-ethynyl-2'-deoxyuridine (EdU), המאפשר לחשוף מנגנונים הקשורים לתורשה מיטוכונדריאלית שהיו שנויים במחלוקת בעבר.

באתרו תיוג של דנ&quot;א מיטוכונדריאלי שכפול תסיסנית למבוגרים השחלות ידי edu מכתים

חקור שיטות FISH לניתוח תוכן כרומוזום X בתאי שחלה בנשים עם סטיות כרומוזומליות. טכניקות אלו מאפשרות הבנה מעמיקה של פוטנציאל רבייה בקבוצה זו ותומכות במחקר עתידי.

חקר סטיות X כרומוזומליות בתאי שחלה באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרו

גלה סרטונים נוספים