חקר סטיות X כרומוזומליות בתאי שחלה באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרו

ניתוח FISH של תאי שחלה מנקבות עם סטיות כרומוזומליות X הוא טכניקה ייחודית כדי לקבל תובנה לגבי התוכן כרומוזומלי X של תאי שחלה בקבוצה ספציפית זו. טכניקות אלה יכולות להיות מועילות כדי ללמוד עוד על פוטנציאל הרבייה אצל נקבות עם סטיות כרומוזומליות X. חשוב לציין כי שתי השיטות נועדו להקל על מחקר עתידי, ואינן מיועדות לשמש ככלי אבחוני בפרקטיקה הקלינית.

מי שידגימו את ההליך יהיו רונלד פיק, חוקר בכיר ממעבדת הפוריות שלנו, ומילאד אינטזר, אנליסט מהמחלקה הפתולוגית שלנו. כדי להתחיל, לחתוך את cryopreserved, או הפשיר רקמת קליפת השחלה לחתיכות קטנות של אחד אחד אחד מילימטר באמצעות אזמל. מעכלים אנזימטית את שברי הרקמה בארבעה ליטרים של L15 שחומם מראש במשך 75 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

פיפטה תערובת העיכול למעלה ולמטה כל 15 דקות. עצור את העיכול האנזימטי על ידי הוספת ארבעה מיליליטר של L15 קר בתוספת 10% סרום בקר עוברי, או FBS. שטפו את הרקמה המנותקת פעם אחת עם שמונה מיליליטר של מדיום L15 קר על ידי צנטריפוגה ב 500 גרם לפני השעיה מחדש של 500 מיקרוליטר של מדיום L15.

העבירו את תרחיף התא המכיל בעיקר תאי סטרומה בודדים וזקיקים קטנים לצלחת פטרי מפלסטיק, ובחנו את התרחיף תחת מיקרוסקופ סטריאו. בחר את הזקיקים בגודל של פחות מ -50 מיקרומטר באופן ידני באמצעות פיפטה פלסטיק 75 מיקרומטר, והעבר אותם לטיפה של מדיום L15 בתוספת 10% FBS בארבע מעלות צלזיוס. לאחר מכן להעביר את הזקיקים מטוהרים לתמיסה של 0.06% טריפסין, מיליגרם אחד למיליליטר EDTA, ומיליגרם אחד למיליליטר גלוקוז, ולדגור במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס.

לאחר הדגירה, להשיג תאי סטרומה השחלות מן תרחיף התא קליפת המוח באמצעות פיפטה פלסטיק 75 מיקרומטר. עבור הכלאה פלואורסצנטית באתר, או ניתוח FISH של תאי שחלה בודדים, להעביר את זקיקי השחלות המטופלים עם טריפסין/EDTA/גלוקוז, או תאי סטרומה לטיפות של חמישה מיקרוליטרים של 0.15 מילימולר אשלגן כלורי, ו -15 מיקרוליטר של DPBS על מגלשה, ולדגור במשך 20 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. יבשו וקיבעו מראש את המגלשה ב-300 מיקרוליטר של 0.05 מילימולר אשלגן כלורי, 7.5% חומצה אצטית ו-22.5% מתנול למשך שתי דקות.

מכסים את המגלשה בחומצה אצטית מתנול משולשת לאחד למשך שתי דקות לסיום הקיבוע. לאחר הקיבוע, לשטוף את הדגימה פעמיים SSC מוכן טרי ב 73 מעלות צלזיוס. כסו אותו ב-100 מיקרוליטר של 2% פרוטאינאז K ואטמו אותו בחלקת כיסוי.

דוגרים על המגלשה במשך 10 דקות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס בתחנת ההכלאה. לאחר הדגירה, הסירו את חלקת הכיסוי ושטפו את המגלשה במשך חמש דקות ב-DPBS בטמפרטורת החדר תחת טלטול. תקן את הדגימה במשך חמש דקות עם 1% פורמלדהיד.

לאחר מכן שטפו את המגלשה ב-DPBS, וייבשו אותה באופן סדרתי בהגדלת ריכוזי האתנול למשך שתי דקות כל אחת. יש לייבש את הדגימה באוויר לפני הכלאתה עם בדיקות המסומנות בפלואורסצנטית. לאחר מכן, הוסף מיקרוליטר אחד של CEPX, מיקרוליטר אחד של CEP18, ו -18 מיקרוליטר של חיץ ההכלאה לדגימה ואטם עם פתק כיסוי המודבק לשקופית.

העבירו את המגלשה לתחנת ההכלאה לדנטורציה בטמפרטורה של 73 מעלות צלזיוס למשך שלוש דקות, ולאחר מכן הכלאה במהלך דגירה לילית בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. לאחר הכלאה, הסר את חלקת הכיסוי ואת כל הדבק שנותר מהמגלשה. שטפו את המגלשה ב-0.4X SSC, 0.3%Tween-20 ב-72 מעלות צלזיוס למשך שתי דקות, ולאחר מכן דגירה למשך דקה אחת ב-2X SSC ו-0.1% Tween-20.

יש לייבש את המגלשה כפי שהודגם ולייבש אותה באוויר בחושך לפני שתכסה אותה באמצעי הרכבה המכיל DAPI. הניחו את השקופית על מינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לפני הניתוח במיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לבצע הכלאה של מקטעי פרפין, בחר מקטעים חדשים לפני או אחרי המקטע המכיל זקיקים מרצועת הכלים של הפרפין.

הרכיבו חלק אחד על מגלשת זכוכית, וייבשו אותו במשך 45 דקות על כיריים בטמפרטורה של 56 מעלות צלזיוס. יש לפרק את החלק בקסילן למשך 10 דקות, לאחר מכן לטבול את המגלשה באתנול 99.5% ולשטוף במשך חמש דקות במי ברז. טפלו מראש במגלשה עם תמיסת שליפת המטרה למשך 10 דקות בטמפרטורה של 96 מעלות צלזיוס.

לאחר הקירור, שטפו את המגלשה במים מזוקקים. טפל בשקופית במשך חמש דקות עם חומצה הידרוכלורית מולרית 0.01, ואחריה עיכול פפסין במשך 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. שטפו שוב את המגלשה בחומצה הידרוכלורית ולאחר מכן ב-PBS.

תקן את השקופית ב- PBS פורמלין 1% למשך חמש דקות. לאחר מכן שטפו לזמן קצר את המגלשה ב-PBS, ושוב במים נטולי מינרלים לפני התייבשות באתנול 99.5%. החל חמישה מיקרוליטרים של בדיקה CEP18 ו- CEPX על השקופית שטופלה מראש.

לאחר מכן יש למרוח כיסוי ולאטום את האזור בדבק צילום. הניחו את המגלשה בהכלאה לדנטורציה בטמפרטורה של 80 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות והכלאה למשך הלילה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס. למחרת, שטפו את המגלשה פעמיים במשך חמש דקות כל אחת ב-SSC בטמפרטורה של 42 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שטפו במשך שתי דקות ודקה ב-0.3% Nonidet P-40 בטמפרטורה של 73 מעלות צלזיוס.

שוב, שטפו את המגלשה ב-2X SSC ולאחר מכן שטפו אותה במים מזוקקים לפני ייבוש עם אתנול 99.5%. יבש את המגלשה באוויר והרכיב אותה בתווך הרכבה המכיל DAPI. רקמת קליפת השחלות בהקפאה בחולה א' הראתה 50% מהלימפוציטים, היה לה קריוטיפ 45, X ו-50% היו 46, XX.In חולה ב', 38% מהלימפוציטים היו 45, X, 28% היו 46, XX ו-34% היו 47, XXX.

תאי סטרומה מסביב נותחו גם עבור תוכן כרומוזומלי X. עיכול אנזימטי של רקמת קליפת השחלות הביא להשעיה של תאים מנותקים ברובם, אך הותיר את הזקיקים הקדמוניים, המורכבים מביצית שלמה מוקפת בשכבה אחת של תאי גרנולוזיס. זקיקים קטנים סיפקו קשיים בפענוח אותות לאחר FISH, עקב התגבשות תאי הגרנולוזיס.

עיכול נוסף של הזקיקים עם טריפסין לפני FISH הביא לכך שתאי גרנולוזיס בודדים התכווצו למורפולוגיה כדורית על פני השטח של הזקיקים. צביעת Hematoxylin eosin הראתה תקינות מורפולוגית של זקיקים משניים ואנטראליים ברקמת קליפת המוח השחלתית לאחר חמישה חודשים של השתלת קסנוגר. התוכן כרומוזומלי X של תאי גרנולוזיס של זקיקים אלה נקבע על ידי ניתוח FISH.

קיבוע רקמת קליפת השחלות המושתלת בתמיסת Bouin הביא לאותות פלואורסצנטיים מטושטשים ומוסתרים במידה רבה בתאים פוליקולריים עקב אובך ירוק. לעומת זאת, רקמת קליפת המוח השחלתית המקובעת בפורמלדהיד סיפקה אותות פלואורסצנטיים מצוינים. האתגר העיקרי של פרוטוקול זה טמון בבידוד תאי השחלה והעיכול האנזימטי של הרקמה.

חריגה מפרוטוקול זה עלולה לגרום לאובדן משמעותי של תאי שחלה במהלך התהליך, ויש להימנע מכך במיוחד אצל נקבות שכבר יש להן רזרבה שחלתית נמוכה. פרופיל ביטוי גנים נוסף יכול להיות מועיל כדי ללמוד יותר על ההשפעה של תאי שחלה אנאופלואידים על folliculogenesis, ומכאן תהליך של אי ספיקת שחלות מוקדמת אצל נשים עם סטיות כרומוזומליות X.