ניתוח תמונת ברקוד מרובה פרופיל חיסוני ואפיון מיפוי מרחבי באנליזה חד-תאית של דגימות רקמת פרפין

הנפח הגבוה של המידע הביולוגי המתקבל מניתוח תמונת ברקוד מולטיפלקס מאפשר למדענים להבין טוב יותר את המיקרו-סביבה של הגידול, ואת הפיזור המיוחד בתוך תאי הגידול. היתרון העיקרי של שיטה זו הוא שהיא נותנת לנו מידע מפורט הרבה יותר מאותה דגימת רקמה עם אפשרות לעשות פנוטיפ עמוק יותר של תאים בודדים. שיטה זו אפשרה לפאנלים הניתנים להתאמה אישית לחקור מיקרו-סביבה של גידולים כדי לגלות סמן ביולוגי מנבא ברקמה סרטנית לשימוש כטיפול מטרה חדש.

כדי להתחיל את צביעת הנוגדנים המצומדים של אוליגונוקלאוטידים, יש להשרות את החלקות הכיסוי בתמיסת פולי-ל-ליזין 0.1% למשך 24 שעות, בטמפרטורת החדר כדי להכין אותן למיקום הרקמה ולהיצמדותה. לאחר ניקוז תמיסת פולי-ל-ליזין, שטפו את החלקות הכיסוי במים טהורים במיוחד למשך 30 שניות. לאחר הכביסה, הסירו את החלקות הכיסוי מהמים האולטרה-טהורים והניחו אותן על מגבת ללא סיבים לייבוש למשך הלילה.

הניחו חלקים בעובי 5 מיקרון של הרקמה המעניינת על מרכז כיסוי טעון פולי-L-ליזין, והניחו להם להתייבש למשך הלילה. מחממים מחזיק מכסה בתנור בחום של 18 מעלות, למשך הלילה. הניחו את פתק הכיסוי המכיל חלקי רקמות במחזיק שחומם מראש.

לאחר אפייה בחום של 60 מעלות במשך 30 דקות, בדקו שהפרפין נמס מהרקמה. הניחו במהירות את מחזיק הכיסוי המכיל את הדגימה ברצף, בסדרה של תמיסות. לבסוף, הניחו את מחזיק הכיסוי במים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC למשך שני סבבים של חמש דקות כל אחד.

הכינו תא לחות על ידי הנחת מגבת נייר ספוגה במים בתחתית קופסת קצוות פיפטה ריקה. ממלאים סיר לחץ במים, מספיק כדי לכסות חצי גובה של 50 מיליליטר. מניחים 5 מיליליטר מתנול לדגימה בכד בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

יש לדלל את הנפח הדרוש של חיץ AR9 ל-1X עם דיאתיל פירוקרבונט, או מים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC. לאחר מכן, מלא זכוכית 50 מיליליטר עם כ 40 מיליליטר של חיץ AR9 מדולל. טבלו את הדגימה במחזיק הכיסוי בכד, וכסו לחלוטין את הכד ברדיד אלומיניום.

הניחו את הכד המכוסה ברדיד אלומיניום בסיר הלחץ המלא במים, ובשלו במהירות של כ-15 PSI במשך 20 דקות. לאחר מכן הסר את הכד ופתח בזהירות את רדיד האלומיניום. מצננים את הכד בטמפרטורת החדר כ-10 דקות.

הסר את מחזיק הכיסוי מהמאגר 1X AR9. יש לדגור עליו פעמיים במים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC למשך שתי דקות. בינתיים, שלפו את מאגר ההידרציה, מדלל הנוגדנים ותמיסות החסימה N, G, J ו-S מערכת צביעת ההדמיה המרובבת.

הניחו את דגימת החלקת הכיסוי ב-5 מיליליטר של חיץ ההידרציה פעמיים, למשך שתי דקות כל אחת. לאחר מכן הניחו את דגימת החלקת הכיסוי ב-5 מיליליטר של גוש מדלל נוגדני ההדמיה המרובה ודגרו במשך 20 עד 30 דקות בטמפרטורת החדר. במהלך הדגירה, להכין את קוקטייל נוגדנים.

לאחר הדגירה, הניחו את חלקת הכיסוי בתא הלחות שהוכן מראש. פיפטה 190 מיקרוליטר של קוקטייל הנוגדנים על דגימת ההחלקה, ולדגור בטמפרטורת החדר במשך שלוש שעות. לאחר מכן, לשטוף את הדגימה פעמיים, כל אחד עם 5 מיליליטר של בלוק דילול נוגדנים הדמיה multiplexed במשך שתי דקות.

כדי לקבע את הנוגדנים הקשורים לרקמה, יש לדגור על פתקי הכיסוי למשך 10 דקות בפורמלדהיד 16% מדולל ל-1.6% עם תמיסת אחסון, ולשטוף אותם שלוש פעמים עם PBS. לאחר הדגירה על הכיסוי מחליקים במשך חמש דקות מתנול, מצננים מראש ל-4 מעלות צלזיוס. לאחר השטיפה, יש לדגור שוב על החלקות הכיסוי למשך 20 דקות, ב-5 מיליליטר של מגיב הקיבוע המדולל ב-PBS, ולשטוף אותן שלוש פעמים עם PBS לפני האחסון.

הכינו את תערובת המאסטר של הכתב בעקבות הקומפוזיציה המוזכרת בטקסט. מלאו באר בצלחת בת 96 בארות ב-245 מיקרוליטר של תמיסה המכילה את תערובת המאסטר של הכתב ואת הפלואורופורים הברקודיים הספציפיים לאותו מחזור ניסוי. האיור מראה תצורת לוחית כתב המשמשת כאן לפאנל קרצינומה.

כדי להגן על הפלואורופורים הברקודיים, הדביקו כיסוי צלחת רדיד אלומיניום מעל לוחית הכתב בעלת 96 הקידוחים, והניחו את הצלחת בתוך מכשיר ההדמיה המרובב. כיול מוקד ההדמיה באמצעות ערוץ DAPI על ידי הנחת פתק כיסוי דגימה על במת המיקרוסקופ ופיפטציה ידנית של 700 מיקרוליטר של טיטרציה 1:1500 של תמיסת כתם גרעיני על הרקמה. כדי להכין את מכשיר ההדמיה המרובב, דללו את מאגר ההדמיה המרובב 10X ל-1X באמצעות מים אולטרה-טהורים שטופלו ב-DEPC, ומלאו בקבוקי מגיבים בתמיסות או בממסים מתאימים.

הגדר את כל הפרמטרים של המיקרוסקופ, ובחר את אזורי העניין בפתק כיסוי הדגימה לצילום. הזן את התכנון הניסיוני בתוכנת מנהל המכשירים. לחץ על הלחצן Experiment בתוכנת הבקרה, ובחלון Experiment Setup and Management לחץ על הלחצן New Template.

הקלד את שם הפרוייקט בשטח לצד לחצן פרוייקט והזן את מספר המחזורים הכולל. לחץ על כפתור הקצאת הערוץ, הקלד את המידע עבור כל מחזור בעמודות, כגון המחזור הנכון, מספרי בארות, מקומות מחסנית Z, שם הסמן, מחלקה וזמן חשיפה עבור כל מחזור. לאחר מכן התחל את הניסוי על-ידי לחיצה על התחל ניסוי ושמור את הניסוי.

לחץ על סמל QuPath במחשב ופתח את התוכנה. גרור את קובץ qptiff לחלון המציג. לחץ על לחצן בהירות וניגודיות כדי לפתוח את החלון ניגודיות בהירות.

סמן או בטל את הסימון של הסמן בעמודה שנבחרה כדי להציג או להסתיר את אות הסמן. לחץ על כפתור זום כדי להתאים כדי להגדיל או להקטין את אזור העניין. בעת צפייה באמצעות תוכנה לניתוח תמונות, התמונות ללא הפרדות צבע הציגו את כל הסמנים או הסמנים שנבחרו כרצונך.

נחשפו עוצמת האות, הטווח הדינמי והפיזור המרחבי של כל הסמנים. טכניקה זו אפשרה ניתוח של כל 26 הסמנים ברמה התת-תאית בקטע רקמה יחיד. לאחר תהליך ניתוח התמונה המרובה, על ידי גישות אינפורמטיות ניתן לעבד ולנתח את הנתונים החד-תאיים החד-ממדיים הגבוהים כדי להסיק תובנה ביולוגית וקלינית.

ניתוח תמונת ברקוד ריבוב הוא מתודולוגיה רבת עוצמה המאפשרת למדענים ליצור פרופיל של רקמת גידול ולענות על שאלת המחקר שלהם בהתאם לסמנים בפאנלים.