קביעת גבולות תרמיים עבור זואופלנקטון באמצעות בלוק חום
18 בנובמבר 2022
הפרוטוקול הנוכחי ממחיש את השימוש ברכיבים זמינים מסחרית ליצירת שיפוע תרמי יציב וליניארי. לאחר מכן ניתן להשתמש בשיפוע כזה כדי לקבוע את הגבול התרמי העליון של אורגניזמים פלנקטוניים, במיוחד זחלים חסרי חוליות.
ככל שהטמפרטורות העולמיות ממשיכות לעלות, כימות הגבולות התרמיים והקשר עם התאקלמות ואונטוגניה חיוניים לקביעת פגיעותם של מינים להתחממות עתידית. עבור אורגניזמים ימיים עם היסטוריית חיים מורכבת, קביעת גבולות תרמיים יכולה להיות מאתגרת מבחינה לוגיסטית. פרוטוקול זה מציג טביעת רגל קטנה, שיטה קלה לבנייה להערכת טמפרטורות קריטיות של אורגניזמים פלנקטוניים קטנים.
בעוד שהשיטה פותחה עבור פלנקטון קטן בגודל של פחות ממילימטר, ניתן לאמץ אותה עבור אורגניזמים ימיים גדולים יותר שיתאימו לבקבוקוני scintillation בנפח של כ-50 מיליליטר. מתחילים על ידי חיווט מחמם הרצועה אל rheostat. קדחו 60 חורים ברשת בגודל 6 על 10 כדי להכין את בלוק האלומיניום בגודל של 20.3 על 15.2 על חמישה סנטימטרים, וודאו שהחורים מרווחים שני סנטימטרים מהמרכז למרכז בשני הכיוונים.
קדחו שני חורים נוספים בין העמודה הראשונה והשנייה לבין העמודה התשיעית והעשירית, בהתאם לגודל של בדיקות בקר הטמפרטורה. כדי להחזיק את האלמנטים במקומם ולבודד את בלוק החום שהושלם, בנו מארז מיריעות אקריליות שקופות, תוך הקפדה על החלת שתי שכבות בצד האחורי של גוף החימום. בהרכבה הסופית, יש למרוח משחה תרמית כדי למקסם את מוליכות החום מגוף החימום לתוך הבלוק ומהבלוק לגוף הקירור.
חבר את אמבט המים עם צינורות טייגון והכנס את בדיקת התרמוסטט לתוך החורים בצד בלוק האלומיניום. בכל החורים הטחונים, מניחים צינורות מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר, מלאים במי ברז עד אפס מקום. הפעל את בקר הטמפרטורה והגדר את טמפרטורת החימום של הבדיקה אחת עד 35 עד 37 מעלות צלזיוס, ובדיקה שתיים עד 21.5 עד 22.5 מעלות צלזיוס.
סובבו את הריאוסטט כדי להפעיל את גוף החימום והגדירו אותו לבינוני. הפעל את אמבט המים והגדר את טמפרטורת הצ'ילר ל -15 מעלות צלזיוס. באמצעות צמד תרמי עם אלקטרודה מסוג K, בדוק את הטמפרטורה בתוך כל צינור מיקרו-צנטריפוגה כל 10 דקות לאחר מכן.
התאם את הערכים של נקודות הקצה על ידי שינוי ההגדרות של בקר הטמפרטורה ואמבט המים לפי הצורך. הפעילו את אמבט המים והמחמם וקבעו אותם ל-15 מעלות צלזיוס ו-37 מעלות צלזיוס בהתאמה, כדי ליצור שיפוע טמפרטורה מ-19.5 מעלות צלזיוס ל-37 מעלות צלזיוס. לאחר שצינורות המיקרו-צנטריפוגה ממוקמים בחורים טחונים והטמפרטורה של בלוק החום מגיעה, בדוק את הטמפרטורה בתוך כל צינור מיקרו-צנטריפוגה באמצעות צמד תרמי עם אלקטרודה מסוג K.
ושימו לב לטמפרטורות האלה. מלא צינור מיקרו-צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר במי ים, מסוננים דרך רשת של 0.45 מיקרומטר. רכז את התרבית של אורגניזם המחקר בסינון הפוך, כך שהאורגניזמים יישארו בתחתית הכוס.
שטפו את התרבית המרוכזת במי ים מסוננים, וחזרו על הסינון ההפוך פעם נוספת כדי לרכז את הדגימה. ספרו את האורגניזמים הפלנקטוניים הקטנים תחת מיקרוסקופ מנתח והעבירו מספר ידוע של אורגניזמים לצינורות מיקרו-צנטריפוגה מלאים למחצה באמצעות פיפטה של פסטר זכוכית. עכשיו להוסיף מי ים מסוננים עד הנפח הסופי בצינורות אלה מגיע מיליליטר אחד.
כעת הכניסו את הצינורות האלה בזוגות לתוך גוש החימום, החל מהקצה הקר כדי לאפשר לאורגניזמים להתחמם בהדרגה לטמפרטורת הניסוי הרצויה. המתן 10 דקות והעבר את זוגות צינורות המיקרו-צנטריפוגה לחורים הקדוחים הסמוכים בטמפרטורות חמות יותר. מניחים זוגות נוספים של צינורות מיקרו-צנטריפוגה בכל שורה בקצה הקר וממשיכים להסיט אותם לכיוון הקצה החם יותר בזוגות.
לאחר מילוי הבלוק כולו, דגרו אותו במשך שעתיים בטמפרטורה המיועדת. בתום תקופת הדגירה, מדוד את הטמפרטורה בכל צינור ורשום אותה. לאחר מכן העבירו את כל הצינורות למחזיקים המסומנים מראש ודגרו אותם בטמפרטורה שנקבעה מראש למשך שעה אחת כדי לאפשר התאוששות.
כדי למנות את חלק האורגניזם החי, העבירו את תכולתו של צינור מיקרו-צנטריפוגה בודד בצלחת פטרי בקוטר 35 מילימטר באמצעות פיפטה מזכוכית. תחת מיקרוסקופ מנתח, ספרו את האורגניזמים החיים והמתים ורשמו את המספרים. מספר האורגניזמים שנצפה צריך להתאים לאורגניזם שנלקח במקור.
אם לא, בדוק את הצד של צינורות המיקרו-צנטריפוגה וצלחת הפטרי, צור טבלת נתונים בפורמט CSV עם הכותרות מקבצות משתנה עניין, טמפרטורת הצינור במעלות צלזיוס, מספר האנשים החיים ומספר האנשים המתים. כדי להתאים את הנתונים עם רגרסיה לוגיסטית, השתמש במודל ליניארי כללי עם התפלגות בינומית. כדי להפעיל את המודל, הקלד מקור והשתמש בקובץ R, modelloop.r.
חשב את ערכי המנבא שבהם שרדו 50% מהפרטים, כדי לקבוע את הגבול התרמי העליון החציוני. באמצעות פרוטוקול זה נמדדה הניצולה של דולרי חול זחליים, שהיו בטווח טמפרטורות של 19 עד 37 מעלות צלזיוס, ביומיים, ארבעה ושישה ימים לאחר ההפריה. עם התפתחות הזחלים בדולרים, הגבול התרמי העליון עלה מ-28.6 מעלות צלזיוס ביומיים שלאחר ההפריה, ל-28.8 מעלות צלזיוס בארבעה ימים לאחר ההפריה, וכ-29 מעלות צלזיוס בשישה ימים לאחר ההפריה.
זמני הדגירה וההתאוששות הם ספציפיים למינים. חשוב לערוך בדיקה ראשונית כדי לוודא שהתזמון שנבחר מניב הערכה אמינה של חי לעומת מת.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה עוסק באתגר של כימות הגבולות התרמיים של אורגניזמים ימיים, תוך התמקדות בלארוות של חסרי חולחול, על רקע העלייה בטמפרטורות הגלובליות. הפרוטוקול מציג דרך ליצירת מדרג תרמי יציב באמצעות חומרים זמינים מסחרית, המאפשרים מדידה של טמפרטורות קריטיות ושיעורי הישרדות של אורגניזמים פלנקטוניים קטנים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מחקר
- מגבלות תרמיות של אורגניזמים ימיים
- השפעת ההתחממות הגלובלית על פגיעות מינים
- הסתגלות ואונטוגנזה של לרוות חסרי חוליות
רקע
- עליית הטמפרטורה הגלובלית והשלכותיה על החיים הימיים
- אתגרים לוגיסטיים בחקר גבולות תרמיים
- חשיבות ההבנה של אקלימציה בחובקי חוליות ימיים
שיטות שהשתמשו בהן
- בניית מדרג טמפרטורה באמצעות בלוק חימום ומבחנות למיקרו-צנטריפוגה
- מחקר של זחלי דולרי חול בתגובה לשינויים בטמפרטורה
- ניתוח רגרסיה לוגיסטית לצורך פרשנות נתונים
תוצאות עיקריות
- מדידת שיעור השרידות בטווח טמפרטורות של 19 עד 37 מעלות צלזיוס
- הגבול התרמי העליון של לרואות דולר חול עלה עם התפתחותן
- הערכה מהימנה של אורגניזמים חיים לעומת מתים באמצעות הפרוטוקול המוצע
מסקנות
- הפרוטוקול מודד ביעילות את הגבולות התרמיים של אורגניזמים פלנקטוניים קטנים
- מתודולוגיה זו היא קריטית למחקרים עתידיים על תגובותיהם של מינים ימיים לשינויי האקלים
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות הגבולות התרמיים של שלבי חיים פלנקטוניים הוא קריטי לניבוי פגיעות של מינים וצווארי בקבוק התפתחותיים תחת שינויי אקלים. פרוטוקול זה מאפשר מדידה מדויקת של ספי סף תרמיים עליונים באורגניזמים ימיים קטנים, ובכך תומך בהערכת סיכונים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בשלבי גילוי ראשוניים. גישה זו מספקת מידע לקבלת החלטות לגבי תיקי פיתוח על ידי הבהרת מגבלות ביולוגיות הרלוונטיות למחקר תרגומי ומחקר פרה-קליני.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקת סובלנות תרמית כגורם מכניסטי הקובע את חיוניות הפיתוח.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של נתיבי תגובה למעמקה במערכות מודל ימיות.
- מספק נקודות קצה כמותיות להפחתת סיכונים ביולוגיים ולביסוס רמת הביטחון במטרה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקל על הכנת בדיקות עקה תרמית סטנדרטיות הניתנות לשחזור עבור מערכות בנפח קטן.
- מספק תוצאות כמותיות של חיים/מוות המתאימות לתהליכי סריקה בהמשך הדרך.
- מאפשר הערכה ניתנת להרחבה, מבוססת פלטפורמה, של תגובות אורגניזמים למדרגי טמפרטורה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את נתוני הסבילות התרמית עם הפגיעות הספציפית לשלב ההתפתחותי לצורך רציפות תרגומית.
- תומכת בקידום מותאם-סיכון על ידי זיהוי ספי טמפרטורה קריטיים בשלבי חיים שונים.
- מספקת תובנה מכניסטית לגבי גורמי עקה סביבתיים הרלוונטיים לבחירת מודל פרה-קליני.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משתלבת ברצף שבין הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לבדיקה מונחית-היפותזה של גבולות תרמיים, ובכך היא תומכת הן בתיקוף מטרות בשלבים מוקדמים והן בהערכת סיכונים תרגומית.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות בנושאי הסתגלות תרמית וצווארי בקבוק התפתחותיים.
- סריקה: מספק פלטי חי/מת כמותיים וניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- אנליטיקה: מאפשר ניתוח של נתוני הישרדות המבוסס על רגרסיה לוגיסטית להשוואה סטטיסטית חזקה.
- מחקר תרגומי: מקשר נתונים ספציפיים לשלבי התפתחות להערכות פגיעות פרה-קליניות.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול מודולרי וניתן להרחבה, הניתן להתאמה למודלים ימיים ומائيים מגוונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בהישרדות התפתחותית תחת עקה תרמית.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של בדיקות תרמיות בנפח קטן ובתפוקה גבוהה לצורך הדירות.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס להחלטות של המשכה או הפסקה (go/no-go) על ידי הבהרת הסיכון הביולוגי בנקודות תפנית מוקדמות.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מודלים ומטרות מותאם-סיכון, בהתבסס על עמידות סביבתית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול באורגניזמים ימיים ובספירה כמותית של תאים חיים/מתים.
- נדרשת גישה למכשור של מדרג תרמי, מבחנות למיקרו-צנטריפוגה ומיקרוסקופ לדיסקציה.
- נדרש סטנדרטיזציה בין-צוותית של זמני אינקובציה והתאוששות כדי להבטיח תוצאות מהימנות.
- ניתן להתאמה לגדלי אורגניזמים שונים הנכנסים למבחנות של 50 mL, עם התאמות של הפרוטוקול לפי הצורך.
- בדיקות תזמון ראשוניות הן חיוניות כדי להבטיח הערכת חיות מדויקת עבור כל מין.
שאלות נפוצות בנושאי ביו-פארמה
Chapters in this video
0:04
Introduction
0:46
Fabrication of the Heat Block
1:45
Determination of Thermal Gradient Settings
2:47
Thermal Exposure and Live-Dead Enumeration
5:30
Computation of LT50
6:10
Results: Survivorship and Upper Thermal Limits of Larval Sand Dollars
6:48
Conclusion
