Name: טכניקות ושיטות תרבית תאים למניעת זיהום על ידי פטריות וחיידקים במעבדת המחקר לתרביות תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-07-07T13:40:00.000+00:00
Duration: 13 min 39 s
Description: למד טכניקות תרבית תאים למניעת זיהום על ידי פטריות, חיידקים ומיקופלזמה במעבדה. שיטות אלו מבטיחות תאים בריאים וחיים לחקר ביולוגי מדויק.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו התאפשרה הודות למימון מהמכון הרפואי הווארד יוז (HHMI). ברצוננו להודות לראש המעבדה שלנו, ג'ו צ'ן, על קריאת כתב היד ועל תמיכתה המתמשכת, לדונה טאלנט על העריכות וההערות המועילות שלה, ולג'ף הנפלד מהמחלקה לטכנולוגיית מידע באוניברסיטת רוקפלר על עזרתו ברכיב הווידאו של כתב יד זה.

1. הכנות 
<ol><li>כללי<ol><li>יש ללבוש מעיל מעבדה נקי המיועד ללבישה רק בחדר תרביות התאים ולא בחלקים אחרים של המעבדה. הערה: מעיל המעבדה אינו חייב להיות סטרילי.</li>
		<li>לבשו כפפות חדשות שלא נגעו במשטחים אחרים. ודאו שהכפפות מתאימות היטב. כפפות ללא ניטריל ללא אבקה הן הטובות ביותר. הערה: הכפפות אינן צריכות להיות סטריליות.</li>
		<li>כדי להתכונן לעבודה, רססו את הכפפות, שרוולי מעיל המעבדה ופנים ארון הבטיחות הביולוגי ב-70% EtOH. נגבו את משטח העבודה ואת לוח הזכוכית לייבוש במגבת נייר שאינה מותירה סיבים. הערה: שימוש ב-70% EtOH הורג חיידקים ביעילות הגבוהה ביותר16. מגבת הנייר לא צריכה להיות סטרילית.</li>
		<li>שמרו אמבטיות מים בתוך חדר תרביות התאים והשתמשו בהן רק לחימום מצעי תרבית או הפשרת תאים. יש לנקז ולשטוף את אמבטיות המים אחת לשבוע, בהתאם להוראות היצרן לניקוי.</li>
	</ol></li>
	<li>בתוך ארון הבטיחות הביולוגי<ol><li>להגביל את מספר הפריטים המובאים לארון. אין להפריע לזרימת האוויר בתוך ארון הבטיחות הביולוגי על ידי חסימת הגריל הקדמי או האחורי. הערה: ראו איור 1 לקבלת הסבר על האופן שבו האוויר זורם בתוך ארון.</li>
		<li>רססו את כל הפריטים שהונחו בתוך הארון ב-70% EtOH ונגבו אותם לייבוש. התחילו בריסוס החלק העליון של בקבוק המדיה ועבדו כלפי מטה. באופן דומה, עם מגבת נייר נקייה, לנגב אותו יבש, בהדרגה עובד את הדרך לתחתית. אל תחזור למעלה לכיוון הכובע.</li>
		<li>אם הארון גדול מספיק כדי להכיל פיפטות סרולוגיות, ניתן למקם אותן בפנים, אחרת ניתן לאחסן אותן בכלי קיבול המותקן בצד החיצוני של הארון. בדוק את כל צד של פיפטה עטופה עבור חורים, קרעים או נקבים באריזה לפני השימוש. אין לקרוע את העטיפה. במקום זאת, מקלפים בעדינות את קצות העטיפה, מכניסים את הפיפטה הסרולוגית לעזר פיפטה, ומסירים את העטיפה בתנועה נוזלית אחת.</li>
		<li>אין לרחף מעל בקבוקים פתוחים או צלוחיות; הושיטו יד מעל בקבוקים או צלוחיות פתוחים, או פתחו פריטים מעל צמרות של פריטים שכבר נפתחו בארון הבטיחות הביולוגי. הערה: זרימת האוויר בתוך הארון דוחפת כלפי מטה על משטח העבודה, כך שכל זיהום הקיים בשרוול, למשל, עלול להיכנס לתרביות התא.</li>
		<li>אין לשפוך נוזלים. במקום זאת, הוסיפו אותם באמצעות פיפטה סרולוגית. לאחר השלמת המדיה, מערבבים היטב את התכולה ומתחילים את הבקבוק. כמו כן, הקפד לכלול תווית עבור מה המדיה הושלמה עם.</li>
	</ol></li>
</ol>2. עבודה עם קווי תאים דבקים
<ol><li>אם יש צורך בבקבוק פלסטיק, רססו את כל השקית והניחו אותה בתוך הארון.</li>
	<li>השתמש פיפטות זכוכית autoclaved או פיפטות פלסטיק סטרילי חד פעמי כדי לשאוף את התקשורת או פתרונות כביסה. הסר בזהירות את מכסה המתכת ממיכל האחסון. בודדו פיפטה אחת מזכוכית על ידי ניעור עדין של המיכל בזווית. כאשר מגיעים למיכל, הימנעו מלגעת בפיטות אחרות. הערה: טפל בפיפטה שנבחרה מקצה אחד בלבד.</li>
	<li>החלף במהירות את הפקקים על הבקבוקים בהקדם האפשרי. הניחו את הכובעים על משטח העבודה הפוכים כך שהחישוק לא ייגע במשטח העבודה. אין לתפוס את הכובע מלמעלה או למטה; במקום זאת, געו בכובעים מהצדדים.</li>
	<li>בעת שאיפת נוזלים, השתמשו בבקבוק מלכודת ואקום הממוקם מחוץ לארון במיכל משני על הרצפה. הערה: אין לזרוק פסולת נוזלית לשקיות פסולת מסוכנות ביולוגית מכיוון שהשקיות ידלפו. פסולת תיווצר תוך כדי עבודה בתוך הארון. הזזת ידיים פנימה והחוצה מהארון לעתים קרובות מדי תפריע לזרימת האוויר. השאירו פסולת בתוך הארון באופן זמני. הניחו אותו בצד כדי שלא יפריע לעבודה.</li>
	<li>רססו בנדיבות את הכפפות ב-70% EtOH בכל פעם שהן מתייבשות. שפשפו את הידיים זו בזו כדי שהכפפות לא יטפטפו רטובות.</li>
	<li>אם פיפטה סרולוגית נוגעת בטעות במשהו בארון, אל תהססו לזרוק אותה. התחילו מחדש עם פיפטה סרולוגית נקייה במקום להשתמש בכזו שעלולה להיות מזוהמת.</li>
</ol>4. בדיקה ואחסון של תאים 
<ol><li>לפני הצבת התאים באינקובטור, בדקו כיצד הם נראים מתחת למיקרוסקופ. אם התאים הושעו ביסודיות, יש לראות תאים בודדים.</li>
	<li>אין לדבר, להתעטש, להשתעל או לנשום בכבדות לתוך האינקובטורים. פתחו וסגרו במהירות את דלתות האינקובטור. השארת דלתות פתוחות למשך זמן רב מהנדרש עלולה לאפשר למזהמים הנמצאים באוויר להיכנס לאינקובטורים. הערה: חבישת מסכה בזמן עבודה בחדר תרביות תאים יכולה לעזור מכיוון שמיקופלסמה עשויה להיות נוכחת בפה האנושי. הימנעו משימוש בטלפונים סלולריים בחדר תרבית התא, שכן דיבור אינו מומלץ.</li>
	<li>ודאו שהפקקים של כל הבקבוקים סגורים היטב לפני שאתם מוציאים את הבקבוקים מהארון.</li>
	<li>אחסנו את תרבית התאים בחושך בטמפרטורה של 4°C כאשר אינה בשימוש מכיוון שהיא רגישה לאור.</li>
	<li>רססו שוב את פנים הארון ב-70% EtOH לאחר סיום עבודת תרבית התאים ונגבו את המשטח יבש במגבת נייר. רוקנו את שקיות האשפה המסוכנות ביולוגית. חזור על תהליך זה והחלף את הכפפות בעת מעבר לקו תאים אחר.</li>
</ol>5. עבודה עם קווי תאי השעיה
<ol><li>עבור תאי תרחיף הגדלים בצלוחיות זכוכית, יש לוודא שהכפפות מרוססות היטב ב-70% EtOH, ואז נוגעים ברדיד האלומיניום עם הכפפות הרטובות ורססו רק את תחתית הבקבוק לפני הכנסתו לארון.</li>
	<li>בעת לקיחת דגימה לספירת תאים, הסר רק צינור אחד של 1.5 מ"ל מהמיכל שלו. אין לגעת בצינורות אחרים. הניחו את המכסה הפוך על משטח העבודה. אין לגעת בשפה הפנימית. טפל בו בזהירות מהצדדים והחלף אותו בסיום.</li>
	<li>הסר בזהירות את חתיכת רדיד אלומיניום מקופל כפול המכסה את כל הצוואר של הצלוחית. טפלו בבקבוק הזכוכית מלמטה בלבד – אל תיגעו בו מהצוואר – ברגע שנייר הכסף כבוי. השתמש פיפטה סרולוגית 1 מ"ל כדי לקחת דגימה לספירת תאים.</li>
	<li>אל תתנו לתקשורת לטפטף בצד הצלוחיות; אם כן, רססו מגבת נייר עם 70% EtOH ונקו אותה מיד.</li>
	<li>יש להדק את הפקקים ואת רדיד האלומיניום לפני הסרת בקבוקים או צלוחיות מארונות הבטיחות הביולוגיים.</li>
</ol>6. דגירה של תאים 
<ol><li>השתמש באינקובטורים נפרדים עבור סוגי תאים שונים כדי למנוע זיהום צולב של סוגי התאים השונים.</li>
</ol>7. איסוף פסולת נוזלית
<ol><li>אספו פסולת נוזלית בבקבוק מלכודת ואקום הממוקם מחוץ לארון על הרצפה במיכל משני שכותרתו 'פסולת'. הערה: הצינור מחובר למסנן ספיגת חלקיקים (HEPA) בעל יעילות גבוהה, המוחלף על בסיס חודשי.</li>
</ol>8. ניקוי
<ol><li>הסר את שקית הפסולת המסוכנת ביולוגית ושטוף את צלוחיות הזכוכית בהקדם האפשרי. הקפידו על פרוטוקול שטיפת זכוכית ליד הכיור. ראו קובץ משלים 1 לפרוטוקול הכביסה.</li>
	<li>בצעו אוטוקלאבל של כלי הזכוכית של תרבית התאים במקום לשלוח אותם למתקן שטיפת זכוכית. יש להפריד אותו מכלי זכוכית באזור המרכזי של המעבדה. הערה: תאי SF-9 משאירים שפה של תאים מתים בצד הצלוחיות אם הזכוכית אינה משופשפת היטב. ראה קובץ משלים 1 עבור פרוטוקול autoclave.</li>
</ol>9. ארגון 
<ol><li>ארגן את חדר תרביות התאים כך שכל האספקה תהיה ממוקמת באזור אחד, ובכך למזער את הצורך של חברי המעבדה לעזוב את החדר בחיפוש אחר אספקה.</li>
	<li>תייגו את כל בקבוקי הפלסטיק המשמשים לקצירת תאים ונעשה בהם שימוש חוזר בתרבית תאים לאחר מכן כ"לשימוש בתרבית תאים בלבד". השתמשו בבקבוקי תרבית התאים הייעודיים לסוג תא ספציפי אחד. אחסנו את הבקבוקים בחדר תרביות התאים לגישה נוחה.</li>
</ol>10. זיהוי זיהום חיידקים, פטריות ומיקופלסמה 
הערה: אי ביצוע זרימת העבודה לעיל עלול להוביל לזיהום חיידקי, פטריות ומיקופלסמה.
<ol><li>תמיד לפני תחילת העבודה, לצפות צלוחיות עבור עכירות כבדה, צמיחה נוספת בצורה של כדורים מטושטשים, הצטברות צפופה של תאים בצד, כל אלה הם אינדיקטורים של זיהום. הערה: עין מנוסה יכולה להבחין בין עכירות הנגרמת על ידי זיהום מיקרוביאלי לעומת התאים בפועל. בעוד התאים גורמים למדיה השקופה בדרך כלל להיראות עכורה, זיהום חיידקי גורם לעכירות כבדה בצבע לבן.<ol><li>זהו חזותית זיהום עובש על-ידי ציון המראה של כדורים עגולים ומטושטשים שצפים במדיה (ראו איור 2).</li>
		<li>זהו חזותית זיהום חיידקי אם המדיה עכורה, לבנה או סוערת (ראו איור 2).</li>
		<li>זהה זיהום מיקופלסמה על ידי ביצוע בדיקת מיקופלסמה חודשית. בדיקה אחת מבוססת PCR מורה למשתמשים לקחת דגימה של 1.5 מ"ל של תאים, לבצע ספירת תאים באמצעות 10 μL, לדלל ל 0.08 x 106 תאים / מ"ל, לסובב את התאים, lyse התאים באמצעות המאגר הכלול בערכה, ולהסתובב למטה בפעם האחרונה. הסופרנאטנט מודגר עם פריימרים המגבירים מגוון מיני מיקופלסמה. הפעל ג'ל DNA כדי לדמיין את הלהקות. המשמעות של היעדר פסים היא שמיקופלסמה אינה מזוהה. הערה: מזהם עיקרי זה יכול להימצא בפה האדם. מומלץ לבדוק זיהום מיקופלסמה בתאים לאחר הפשרתם ולפני השימוש בהם לניסויים. לאחר מכן, לפקח על התאים עבור זיהום mycoplasma פעם בחודש. חברות רבות מציעות ערכות בדיקת מיקופלסמה. בחר אחד מתאים.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol><li>Johnson, Z. L., Chen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+substrate+recognition+by+the+multidrug+resistance+protein+MRP1%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis of substrate recognition by the multidrug resistance protein MRP1.</a> Cell. 168 (6), 1075-1085 (2017).</li>
<li>Capes-Davis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+lines+as+biological+models%3A+practical+steps+for+more+reliable+research%5BTitle%5D)+AND+%22Chemical+Research+in+Toxicology%22%5BJournal%5D)">Cell lines as biological models: practical steps for more reliable research.</a> Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).</li>
<li>Segeritz, C. P., Vallier, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture%3A+growing+cells+as+model+systems+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Basic+Science+Methods+for+Clinical+Researchers%22%5BJournal%5D)">Cell culture: growing cells as model systems in vitro.</a> Basic Science Methods for Clinical Researchers. , 151-172 (2017).</li>
<li>Drexler, H. G., Uphoff, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mycoplasma+contamination+of+cell+cultures%3A+Incidence%2C+sources%2C+effects%2C+detection%2C+elimination%2C+prevention%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotechnology%22%5BJournal%5D)">Mycoplasma contamination of cell cultures: Incidence, sources, effects, detection, elimination, prevention.</a> Cytotechnology. 39 (2), 75-90 (2002).</li>
<li>Lincoln, C. K., Gabridge, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+contamination%3A+sources%2C+consequences%2C+prevention%2C+and+elimination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell culture contamination: sources, consequences, prevention, and elimination.</a> Methods in Cell Biology. 57, 49-65 (1998).</li>
<li>Nikfarjam, L., Farzaneh, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+and+detection+of+mycoplasma+contamination+in+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Journal%22%5BJournal%5D)">Prevention and detection of mycoplasma contamination in cell culture.</a> Cell Journal. 13 (4), 203-212 (2012).</li>
<li>Stacey, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+contamination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Cell culture contamination.</a> Methods in Molecular Biology. 731, 79-91 (2011).</li>
<li>Young, L., Sung, J., Stacey, G., Masters, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+Mycoplasma+in+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Detection of Mycoplasma in cell cultures.</a> Nature Protocols. 5 (5), 929-934 (2010).</li>
<li>Barth, O. M., Majerowicz, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+detection+by+transmission+electron+microscopy+of+mycoplasma+contamination+in+sera+and+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Memorias+do+Instituto+Oswaldo+Cruz%22%5BJournal%5D)">Rapid detection by transmission electron microscopy of mycoplasma contamination in sera and cell cultures.</a> Memorias do Instituto Oswaldo Cruz. 83 (1), 63-66 (1988).</li>
<li>Mirabelli, P., Coppola, L., Salvatore, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+are+useful+model+systems+for+medical+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines are useful model systems for medical research.</a> Cancers. 11 (8), 1098(2019).</li>
<li>Gabelli, S., Zhao, C., Oberst, J. A cell culture master class: What your cells wish they could tell you. Science. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you">https://www.science.org/content/webinar/cell-culture-master-class-your-cells-wish-they-could-tell-you</a> (2020).</li>
<li>Langdon, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+culture+contamination%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Cell culture contamination: an overview.</a> Methods in Molecular Medicine. 88, 309-317 (2004).</li>
<li>Babic, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meta-research%3A+Incidences+of+problematic+cell+lines+are+lower+in+papers+that+use+RRIDs+to+identify+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Meta-research: Incidences of problematic cell lines are lower in papers that use RRIDs to identify cell lines.</a> eLife. 8, e41676(2019).</li>
<li>Visconti, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+tandem+repeat+profiling+for+the+authentication+of+cancer+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Cancer%22%5BJournal%5D)">Short tandem repeat profiling for the authentication of cancer stem-like cells.</a> International Journal of Cancer. 148 (6), 1489-1498 (2021).</li>
<li>Horbach, S. P. J. M., Halffman, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ghosts+of+HeLa%3A+How+cell+line+misidentification+contaminates+the+scientific+literature%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The ghosts of HeLa: How cell line misidentification contaminates the scientific literature.</a> PLoS One. 12 (10), 0186281(2017).</li>
<li>Why 70% isopropyl alcohol is a better disinfectant than 99% isopropyl alcohol when it comes to Covid-19. MunGlobal. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference,potency%20of%20its%20antimicrobial%20properties">https://munglobal.com.au/resources/knowledge-base/pathogens/why-70-isopropyl-alcohol-is-a-better-disinfectant-than-99-isopropyl-alcohol/#:~:text=Due%20to%20the%20concentration%20difference,potency%20of%20its%20antimicrobial%20properties</a> (2023).</li>
<li>United States Department of Agriculture. Processing and Safety. Food Safety Publications. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf">https://www.ars.usda.gov/ARSUserFiles/60701000/FoodSafetyPublications/p328.pdf</a> (2004).</li>
<li>Sterilizing Practices. Centers for Disease Control and Prevention. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html">https://www.cdc.gov/infectioncontrol/guidelines/disinfection/sterilization/sterilizing-practices.html</a> (2023).</li>
<li>Coté, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+technique+for+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Aseptic technique for cell culture.</a> Current Protocols in Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1.3 (2001).</li>
<li>Uphoff, C. C., Drexler, H. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eradication+of+Mycoplasma+contamination+from+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Eradication of Mycoplasma contamination from cell cultures.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 106, 1-12 (2014).</li>
<li>Bykowski, T., Stevenson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aseptic+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Aseptic technique.</a> Current Protocols in Microbiology. 56 (1), e98(2020).</li>
<li>Penning, S. D. How a Class II, Type A2 Biosafety Cabinet Works. Nuaire. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article">https://www.nuaire.com/resources/class-ii-type-a2-biosafety-cabinet-how-it-works-article</a> (2020).</li>
<li>Phelan, K., May, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+cell+tissue+culture+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Pharmacology%22%5BJournal%5D)">Mammalian cell tissue culture techniques.</a> Current Protocols in Pharmacology. 73, 1-23 (2016).</li>
</ol>

למחבר אין אינטרסים מנוגדים.

בעוד זיהום הוא אחד החששות העיקריים בעת ביצוע עבודת תרבית תאים, הפרקטיקות והטכניקות המתוארות בכתב יד זה יסייעו להפחית את הסיכונים. השלבים הקריטיים כוללים לבישת מעיל מעבדה נקי, המשמש רק בחדר תרביות התא, שימוש בכפפות נקיות ונטולות אבקה המרוססות ב-70% EtOH לעתים קרובות ומוחלפות בעת מעבר בין קווי תאים, עידוד כל אדם לא לשתף בקבוקי מדיה, ניקוי יסודי של הארון לפני ואחרי סיום העבודה, פירוק מסודר של פיפטות סרולוגיות, הימנעות ממגע קרוב וממושך עם בקבוקים פתוחים או צלוחיות, אי שיתוף בקבוקי מדיה בין קווי תאים מרובים, ופתיחה וסגירה מה...

לתרבית תאים שימושים רבים במעבדת המחקר. מאז ראשית תרביות התאים בתחילת המאה ה-20, קווי תאים סייעו לקדם את המדע. לקווי תאים יש מספר יתרונות; קווי תאים שונים יכולים לסייע לחוקרים לחקור ביולוגיה של התא, לייצר baculovirus למחקרים נוספים, או לייצר כמויות גדולות של חלבון מעניין, אם לציין כמה1. שימושים נוספים כוללים חקר צמיחת רקמות, סיוע בקידום פיתוח חיסונים, מחקר טוקסיקולוגי, חקר תפקיד הגנים באורגניזמים בריאים ובמודלים חולים, וייצור קווי תאים היברידיים 2,3. קווי תאים יכולים גם לאפשר ייצור תרופות3. טכניקות אספטיות נכונות נחוצות בעת עבודה עם קווי תאים; הפרקטיקות והטכניקות המתוארות בכתב יד זה ישימות למעבדות מחקר שבהן מתבצעת עבודת תרבית תאים. הגדרות מעבדה אחרות אינן נדונות.
זיהום הוא לעתים קרובות הדאגה העיקרית בעת ביצוע עבודת תרבית תאים. בהקשר של מאמר זה, זיהום מתייחס בדרך כלל לפטריות וחיידקים. המטרה הכוללת של השיטה המתוארת במאמר זה היא לתאר ביסודיות את שיטות העבודה המומלצות למניעת זיהום. כל חברי המעבדה צריכים לדבוק בפרקטיקות אלה כאשר הם עובדים בחדר תרביות תאים של מעבדת מחקר. מעבדות צריכות להבטיח שכל העובדים הם משתתפים פעילים בשימוש בשיטות עבודה מומלצות אלה למניעת זיהום. הידע של שיטות העבודה והטכניקות הנכונות יסייע להבטיח שתרביות תאים יישארו בנות קיימא, בריאות וללא זיהום. פיתוח טכניקה זו מבוסס על מחקר הספרות, שבע שנות ניסיון בעבודה עם תרביות תאים, והצורך בשיטה שגם עובדים מתחילים וגם מנוסים בתרביות תאים יכולים להתייחס אליה על בסיס שנתי.
יש צורך בטכניקה ברורה וסטנדרטית שכל מעבדות המחקר לתרביות תאים צריכות לעקוב אחריה. רוב הספרות על זיהום תרביות תאים דנה בזיהוי מיקופלסמה, טכניקות אספטיות, מקורות זיהום, חיסול מזהמים ומניעה על ידי שימוש באנטיביוטיקה ובדיקות קבועות 4,5,6,7,8. בעוד שמידע זה מועיל, אין בספרות סרטונים המדגימים את טכניקות תרבית התאים הנכונות שיש לעקוב אחריהן. היתרון של הפרקטיקות המוצגות על פני טכניקות חלופיות הוא התמקדות במניעת זיהום לפני שהוא קורה, ולא באיתור ותיקון טעויות מאוחר יותר. יתר על כן, הדגמה יסודית של טכניקות אספטיות, דיון על מניעת צמיחת פטריות וחיידקים, ומידע לגבי זרימת האוויר בארון הבטיחות הביולוגית הם בעלי ערך עבור עובדי תרביות תאים מתחילים ומנוסים כאחד.
חיידקים ופטריות הם שני סוגי המזהמים הנפוצים ביותר. בתוך קטגוריית החיידקים, מיקופלסמה מהווה דאגה עיקרית בשל גודלה הקטן ויכולתה להתרבות מבלי שיבחינו בה. הם אורגניזמים המשכפלים את עצמם ללא דופן תא קשיחה, המסתמכים על תאים איקריוטים כדי לגדול. יש להם יכולות מטבוליות מופחתות והם יכולים להתרבות מאוד תוך שהם נשארים בלתי מזוהים בבדיקה חזותית שגרתית של תרביות תאים וניתוח מיקרוסקופי רגיל, אם כי מיקרוסקופ אלקטרונים שידור יכול לזהות מיקופלסמה 9,10. יתר על כן, הם יכולים לעבור דרך מסננים מיקרוביולוגיים10. מדיום תרבית תאים מספק מיקופלסמה עם חומרים מזינים, אם כי למרבה הצער תוספת מדיה עם אנטיביוטיקה אינה משפיעה על מיקופלסמה10. יש לציין כי, באופן כללי, אין צורך להשלים את התקשורת עם אנטיביוטיקה; טכניקות נכונות צריכות להספיק כדי לשמור על זיהום במפרץ. זיהום במיקופלסמה אינו מוביל למוות תאי מיידי, אך הוא מדאיג את החוקרים מכיוון שהוא משפיע על שחזור הנתונים ואיכותם.
כל אנשי המעבדה צריכים להקפיד על שיטות תרבית תאים טובות. תרביות יש לבדוק מיקופלסמה לאחר שנרכשו לאחרונה, בזמן שהן גדלות כעת, לפני שימור בהקפאה, וכאשר הן מופשרות מחנקן נוזלי 2,10. בדיקות שונות זמינות בשוק באמצעות תגובת שרשרת פולימראז (PCR), בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזים (ELISA), או immunostaining. 3 הספרות מצביעה על כך ש"מבודדים אנושיים מייצגים אחוז גדול ממזהמי המיקופלסמה הנמצאים בתרביות תאים"5. למרות שתוארו יותר מ-200 מיני מיקופלסמה, כשישה מהם אחראים לרוב הזיהומים. ששת המינים הללו הם M. arginini, M. fermentans, M. hominis, M. hyorhinis, M. orale ו-Acholeplasma laidlawii10. כמו עם סוגים אחרים של זיהום, אוויר ואירוסולים מביאים אותם לתוך תרביות תאים5. הדבר מהדהד במאמרים אחרים, שכן "המפעיל האנושי הוא בעל הפוטנציאל לסכנה הגדולה ביותר במעבדה"7. למרות שזה נעשה באמצעות טעות אנוש, הסיכון ניתן לבטל אם הליך סטנדרטי הוא אחריו. שפיכה מכוח אדם אינה מוגבלת רק לזיהום מיקופלסמה; תרביות תאים במעבדה אחת נגועות בדרך כלל באותו מין מיקופלסמה, דבר המצביע על כך שהזיהום מתפשט מבקבוק אחד למשנהו עקב טכניקות לא נכונות של תרביות תאים10.
מניעת זיהום צולב היא גם סיבה נוספת מדוע יש לעקוב אחר טכניקות תרבית תאים נכונות. יצוין כי לפחות 15%-18% מקווי התאים ברחבי העולם עשויים להיות מזוהמים צולבים או מזוהים באופן שגוי11,12. בנוסף לבדיקת קווי תאים לזיהום מיקופלסמה, יש לבדוק אותם גם לזיהום צולב10. עבור קווי תאים אנושיים, אימות קו התא באמצעות טכניקה זולה מבוססת DNA הנקראת פרופיל חזרה טנדם קצר (STR) הוא תקן הייחוס הבינלאומי הנוכחי, מכיוון שזו דרך קלה לאשר את זהות קו התא 2,10,13,14. STR יכול לזהות קווי תאים עם תווית שגויה או צולבת, אך הוא אינו יכול לזהות מקור רקמה שגוי10,13,14. תוקפם של נתוני מחקר עלול להיפגע אם קווי תאים מסומנים באופן שגוי, מזוהים באופן שגוי או מזוהמים13. בדומה לסוגים אחרים של זיהום, זיהום צולב יכול להתרחש עקב טכניקה לקויה הגורמת להתפשטות אירוסולים, מגע מוטעה המוביל לסוג תא שגוי להיכנס לצלוחית, או שימוש באותו בקבוק מדיה וריאגנטים עם קווי תאים שונים10. אין לשתף בקבוקי מדיה; שיתוף בקבוק אחד של מדיה בין שני קווי תאים שונים יכול לאפשר לאוכלוסיות תאים אלה להיות מעורבבות, מה שמוביל את סוג התא הגדל מהר יותר להשתלט לחלוטין על הצלוחית. החלפה זו אינה מורגשת ומובילה לתיוג שגוי ולזיהוי שגוי2. קו תא יכול גם להיות מוטעה אחר אם תרביות מתבלבלות במהלך טיפול או תיוג10. יש להקדיש תשומת לב רבה לשמירה על ריאגנטים, מדיה וצלוחיות בנפרד זה מזה. לכל חבר מעבדה צריכים להיות בקבוקי מדיה משלו; אין לשתף בין חברי המעבדה. את קווי הסלולר עצמם יש לרכוש מבנק סלולרי מוסמך וספק. מעבדות לא צריכות לחלוק תאים. מחקרים מראים כי למרות שבדיקות STR ומיקופלסמה נמצאות בשימוש קבוע, מחקרים רבים בספרות כבר השתמשו בקווי תאים מזוהים או מזוהמים15. סינון המחקר כדי למצוא את המאמרים הבעייתיים הללו וליידע את הקוראים בדיעבד בעניין זה הוא מסורבל. מניעה היא הדרך הטובה ביותר להבטיח בעיה זו לא מתרחשת מלכתחילה.
הפעולה הפשוטה של ריסוס פריטים עם 70% EtOH יכולה להרוג אורגניזמים; 70% EtOH פועל על ידי דנטורציה של חלבונים והמסת שומנים באורגניזמים המזהמים הנפוצים ביותר, כולל חיידקים ופטריות16. מחקרים הראו כי 70% הוא הריכוז היעיל ביותר; חלבונים פני השטח אינם נקרשים במהירות עם 70% EtOH כך שהם יכולים להיכנס לתא, בעוד המים שהוא מכיל נחוצים לתהליך דנטורציה של חלבונים. בשל הפרש הריכוזים של מים ואלכוהול משני צדי דופן התא, 70% EtOH נכנס לתא כדי לנטרל חלבונים אנזימטיים ומבניים. אם צמיחת עובש נצפתה בצלוחיות, יש לטהר את האינקובטור כולו על ידי ריסוס תחילה עם 70% EtOH וניגובו יבש, ולאחר מכן דגירה של 16 שעות לילה ב 60 ° C17. זה הורג את רוב העובש וכל חיידקים.
היתרון העיקרי של שיטות מניעה על פני טכניקות חלופיות של חיסול זיהום לאחר התרחשותו הוא שעל ידי מניעת זיהום בשלב מוקדם, עובדי מעבדה יכולים להיות בטוחים שתרביות התאים שלהם בריאות ולא יהיו עלויות גבוהות הקשורות לטיהור אינקובטורים או השלכת תרביות תאים. סילוק מזהמים מיקופלסמה לאחר, למשל, אינו יעיל7. אם ניקח את הזמן בשלב מוקדם כדי להבטיח שאנשי המעבדה מאומנים כראוי, חדר תרביות התאים יהיה עצמאי, ונעשה שימוש בהליך סטנדרטי יחסוך זמן וכסף.

<table><tbody><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14-190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM F-12 Media</td><td>ATCC</td><td>30-2006</td><td></td></tr><tr><td>בקבוק זכוכית מבולבל</td><td>Pyrex&nbsp;</td><td>09-552-40</td><td></td></tr><tr><td>פיפטות זכוכית</td><td>פישר&nbsp;</td><td>13-678-6B</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה אייד</td><td>דראמונד</td><td>13-681-15A&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td></td><td>פיפטה סרולוגית קורנינג</td><td>07-200-573</td><td></td></tr><tr><td>T75 בקבוק</td><td>קורנינג</td><td>07-202-004</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>גיבקו</td><td>25-300-054</td><td></td></tr><tr><td>*הפריטים עשויים להשתנות מכיוון שסרטון זה עוסק בטכניקות</td><td></td><td></td><td></td> כלליות של תרביות תאים</tr></tbody></table>

טכניקות ושיטות תרבית תאים למניעת זיהום על ידי פטריות וחיידקים במעבדת המחקר לתרביות תאים

Cell Culture Techniques and Practices to Avoid Contamination by Fungi and Bacteria in the Research Cell Culture Laboratory

תרבית תאים היא מיומנות עדינה הנחוצה לגידול תאי אדם, בעלי חיים וחרקים, או רקמות אחרות, בסביבה מבוקרת. מטרת הפרוטוקול היא להדגיש את הטכניקות הנכונות המשמשות במעבדת מחקר למניעת זיהום מפטריות וחיידקים. דגש מיוחד מושם על הימנעות מזיהום מיקופלסמה, דאגה מרכזית בחדר תרביות התאים בשל גודלו הקטן ועמידותו לרוב האנטיביוטיקות המשמשות לתרביות תאים. אותן טכניקות מבטיחות צמיחה מתמשכת ושומרות על תאים בריאים. עבור משתמשים חדשים ומנוסים בתרביות תאים כאחד, חשוב לדבוק באופן עקבי בשיטות עבודה מומלצות אלה כדי להפחית את הסיכון לזיהום. פעם בשנה, מעבדות צריכות לבחון שיטות עבודה מומלצות לתרביות תאים ומעקב עם דיון או הכשרה נוספת במידת הצורך. נקיטת פעולה מוקדמת למניעת זיהום מלכתחילה תחסוך זמן וכסף, בהשוואה לניקוי לאחר התרחשות הזיהום. שיטות עבודה מומלצות אוניברסליות שומרות על תרביות תאים בריאות, ובכך מפחיתות את הצורך להפשיר תאים חדשים כל הזמן, לרכוש מדיה יקרה של תרביות תאים, ולהפחית את כמות הטיהור וההשבתה של האינקובטור.

אם לא מקפידים על הטכניקות והפרקטיקות הנכונות של תרביות תאים המתוארות במאמר זה, עלול להתרחש זיהום על ידי פטריות וחיידקים במעבדת תרביות תאי המחקר. איור 2 מראה צלוחיות שמכילות זיהום גם בתרביות המתרחפות וגם בתרביות הדבקות.
כאשר לא עוקבים אחר טכניקות אספטיות, זיהום עובש עלול להתרחש 2-3 ימים מאוחר יותר. כדורים מטושטשים עגולים הצפים במדיה מורגשים בתאי תרחיף, בעוד צמיחת עובש בתאים מחוברים ניתן לראות כתמים גדולים, לא סדירים, לבנים או ירוקים.
עבו...

פרוטוקול זה מציג טכניקות ושיטות חיוניות לתרביות תאים שישמשו במעבדת המחקר לתרביות תאים כדי למנוע זיהום על ידי פטריות וחיידקים. בתוך קטגוריית החיידקים, יושם דגש מיוחד על מניעת זיהום מיקופלסמה.

Cell culture is a delicate skill necessary for growing human, animal, and insect cells, or other tissues, in a controlled environment. The goal of the ...

תרבית תאים היא מיומנות עדינה הנחוצה לגידול סוגים שונים של תאים ורקמות בתנאי מעבדה מבוקרים. החשש העיקרי בעת ביצוע עבודת תרבית תאים הוא זיהום. זיהום זה יכול לבוא בצורה של חיידקים, עובש או מיקופלסמה.הטכניקות והפרקטיקות המתוארות כולן בסרטון זה יבטיחו שהתאים שלכם יישארו בני קיימא, בריאים וללא זיהום. יש להקפיד על נהלים אלה, וכל אנשי המעבדה צריכים לקבל הכשרה לפחות פעם בשנה. לפני תחילת העבודה יש ללבוש מעיל מעבדה נקי המיועד לשימוש בחדר תרביות התאים בלבד.לבשו כפפות חדשות שלא נגעו במשטחים אחרים. ודאו שהכפפות מתאימות היטב. כפפות ללא אבקת ניטריל הן הטובות ביותר.מעיל המעבדה והכפפות אינם צריכים להיות סטריליים. כדי להתכונן לעבודה, יש לרסס כפפות, שרוולי מעיל מעבדה ואת פנים ארון הבטיחות הביולוגי עם 70% אתנול. רססו את משטח העבודה, הצדדים, הגב, כל הפריטים בארון ואת לוח הזכוכית הקדמי, הן מבפנים והן מבחוץ.נגבו את משטח העבודה ואת לוח הזכוכית לייבוש במגבת נייר שאינה מותירה סיבים. הקדישו זמן לסידור סביבת העבודה בתוך הארון. יש לשמור אמבטיות מים בתוך חדר תרביות התאים ולהשתמש בהן רק למטרות תרבית תאים, כגון מדיה מחממת או הפשרת תאים.אמבטיות המים יש לנקז ולשטוף פעם בשבוע. הגבילו את כמות הפריטים המוכנסים לארון ואל תפריעו לזרימת האוויר בתוך ארון הבטיחות הביולוגי על ידי חסימת הגריל הקדמי או האחורי. רססו את כל הפריטים שהונחו בתוך הארון באתנול 70% ונגבו אותם לייבוש.התחילו בריסוס החלק העליון של בקבוק המדיה ועשו את דרככם למטה. בעזרת מגבת נייר נקייה, התחילו מהחלק העליון של בקבוק המדיה כדי לנגב אותו לייבוש, ובהדרגה עשו את דרככם לתחתית. אל תחזרו למעלה לכיוון הכובע.הדרך שבה ארונות אלה עובדים היא שהם מושכים אוויר מהחדר ומהארון עצמו דרך הגריל הקדמי והאחורי. האוויר הולך לכיוון החלק האחורי של הארון ועד למעלה. שם, אוויר מזוהם עובר דרך ערימה של פילטרים, וחלק מהאוויר הנקי המסונן נדחף למטה על אזור העבודה בארון.אם הארון גדול מספיק כדי להכיל פיפטות סרולוגיות, ניתן למקם אותן בפנים, אחרת, ניתן לאחסן אותן בכלי קיבול המותקן בחלק החיצוני של הארון. מומלץ לבדוק לפני השימוש חורים, קרעים או נקבים באריזה משני צדי הפיפטה. אין לקרוע את העטיפה.במקום זאת, קלפו בעדינות את קצות העטיפה. מכניסים את הפיפט הסרולוגי לעזר פיפטה ומסירים את העטיפה בתנועת נוזל אחת. אין לרחף מעל בקבוקים או צלוחיות פתוחים.לא מומלץ להושיט יד מעל בקבוק פתוח או צלוחיות פתוחות, או לעבוד מעל צלוחיות פתוחות. זרימת האוויר בתוך הארונות דוחפת כלפי מטה את כל מה שנמצא בפנים. הושטת יד תאפשר לשרוול או לכפפה שלך להיות מעל פריטים שעלולים לדחוף למטה כל זיהום שנמצא בשרוול שלך, למשל, לתוך תרבית התאים שלך.במידת האפשר, אין לשפוך נוזלים. במקום זאת, הוסיפו אותם באמצעות פיפטה סרולוגית. מערבבים היטב את התכולה ומתחילים את הבקבוק.רשמו מה התקשורת משלימה. אם אתם עובדים עם תרביות דבק וזקוקים לבקבוק פלסטיק, רססו את כל האריזה והכניסו אותה פנימה. בכל פעם שהכפפות שלכם התייבשו, רססו אותן שוב באתנול.כאשר עובדים עם קו תאים דבק, השתמש פיפטות זכוכית autoclaved או פיפטות פלסטיק סטרילי חד פעמי כדי לשאוף מדיה או פתרונות כביסה. הסר בזהירות את מכסה המתכת ממיכל האחסון. בודדו פיפטה אחת מזכוכית על ידי ניעור עדין של המיכל בזווית.כאשר מגיעים למיכל, הימנעו מלגעת בפיטות אחרות. טפל בפיפטה שנבחרה מקצה אחד בלבד. החליפו במהירות את הפקקים על בקבוקים וצלוחיות בהקדם האפשרי.הניחו מכסים על משטח העבודה הפוך כדי שהחישוק לא ייגע במשטח העבודה. אין לתפוס את הכובע מלמעלה או מלמטה. במקום זאת, געו בכובעים מהצדדים.בעת שאיפת נוזלים, השתמשו בבקבוק מלכודת ואקום הממוקם מחוץ לארון במיכל משני על הרצפה. פסולת תיווצר תוך כדי עבודה בתוך הארון. מכיוון שהזזת ידיים פנימה והחוצה מהארון לעתים קרובות מדי תפריע לזרימת האוויר, זה בסדר להשאיר באופן זמני פסולת בתוך הארון.הניחו אותו בצד כדי שלא יפריע לעבודתכם. רססו בנדיבות כפפות עם 70% אתנול בכל פעם שהן מתייבשות. שפשפו את הידיים זו בזו כדי שלא יטפטפו רטובות.הערה מהירה על פיפטות סרולוגיות. אם הם נוגעים בטעות במשהו אחר במכסה המנוע, אל תהססו לזרוק אותם החוצה. עדיף להתחיל טרי עם פיפטה סרולוגית נקייה במקום להשתמש בכזו שעלולה להיות מזוהמת.לפני הצבת התאים באינקובטור, בדקו כיצד הם נראים מתחת למיקרוסקופ. תאים בודדים יש לצפות. זה מצביע על כך שהתאים הושעו מחדש ביסודיות.אין לדבר, להתעטש, להשתעל או לנשום בכבדות לתוך האינקובטורים. פתיחה וסגירה מהירה של דלתות האינקובטור. השארתם פתוחים זמן רב מהנדרש עלולה לאפשר למזהמים הנמצאים באוויר להיכנס לאינקובטורים.ודאו שהפקקים של כל הבקבוקים סגורים היטב לפני שאתם מוציאים אותם מהארון. המדיה רגישה לאור. יש לאחסן אותו בחושך בארבע מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש.רססו שוב את פנים הארון באתנול 70% לאחר סיום עבודת תרבית התאים ונגבו את פני השטח יבשים במגבת נייר. רוקנו את שקית הפסולת המסוכנת ביולוגית. חזור על תהליך זה והחלף כפפות בעת מעבר לקו תאים אחר.כאשר עובדים עם תרביות מתלים הגדלות בצלוחיות זכוכית, יש לוודא שהכפפות רטובות. געו ברדיד האלומיניום עם הכפפות הרטובות שלכם ואז רססו רק את תחתית הבקבוק לפני הכנסתו לארון הבטיחות הביולוגי. בעת לקיחת דגימה לספירת תאים, הסר רק צינור אחד של 1.5 מ"ל מהמיכל שלו.אין לגעת בצינורות האחרים. הניחו את המכסה הפוך על משטח העבודה. אין לגעת בשפה הפנימית.טפל בו בזהירות מהצדדים והחלף אותו לאחר שתסיים. בעת טיפול בתאי השעיה וצלוחיות זכוכית, הסר בזהירות את חתיכת רדיד האלומיניום המקופלת הכפולה המכסה את כל צוואר הצלוחית. משכו בעדינות את כל ארבע הפינות והניחו את נייר הכסף הפוך על משטח העבודה.טפלו בבקבוק הזכוכית מלמטה בלבד. אין לגעת בו מהצוואר ברגע שנייר הכסף כבוי. השתמש פיפטה סרולוגית 1 מ"ל כדי לקחת דגימה לספירת תאים.אל תתנו לתקשורת לטפטף במורד הצד של צלוחיות. אם כן, רססו מגבת נייר עם 70% אתנול ונקו אותה מיד. ודא שהפקקים או רדיד האלומיניום מהודקים לפני הסרת בקבוקים או צלוחיות מארונות הבטיחות הביולוגיים.השתמש באינקובטורים נפרדים עבור סוגי תאים שונים. זה ימנע זיהום צולב של סוגי תאים שונים. מומלץ להניח את בקבוק מלכודת הוואקום לאיסוף פסולת נוזלית מחוץ לארון על הרצפה במיכל משני המסומן כפסולת.הצינור מחובר לפילטר אשר מוחלף על בסיס חודשי. הצינור נכנס דרך הצד של הארון. הסר את האשפה המסוכנת ביולוגית לאחר סיום העבודה.שמרו פרוטוקול שטיפת זכוכית על הקיר ליד הכיור. ראשית, השרו את התאים שהושלכו באקונומיקה של 10% למשך כחמש דקות. לאחר מכן השליכו את תערובת האקונומיקה ושטפו היטב את הבקבוק במים.מוסיפים סבון עם מים, מקרצפים אותו עם מברשת היטב, שוטפים עם עוד מים. ואז השלב האחרון הוא לשטוף את כלי הזכוכית עם מי DI על הברז בצד ימין. לשטוף צלוחיות זכוכית בהקדם האפשרי, לקרצף את כלי זכוכית היטב.תאי Sf9 יעזבו את שפת התאים המתים אם לא מקרצפים אותה כראוי. השתמשו בצלוחיות אלה רק לתרבית תאים, כלי זכוכית לתרבית תאים אוטוקלאביים במקום לשלוח אותם למתקן שטיפת זכוכית. השתמש במחזור הוואקום על autoclave במשך 40 דקות זמן מעוקר ו 40 דקות זמן יבש.יש להפריד אותו מכלי זכוכית באזור המרכזי של המעבדה. ארגן את חדר תרביות התאים כך שכל האספקה תהיה באזור אחד, ובכך למזער את הצורך של חברי המעבדה לצאת מחדר תרביות התאים בחיפוש אחר אספקה. יש לסמן את כל בקבוקי הפלסטיק המשמשים לקצירת תאים ולאחר מכן נעשה בהם שימוש חוזר בתרבית תאים, לשימוש בתרבית תאים בלבד.השתמשו בבקבוקי תרבית התאים הייעודיים לסוג תא ספציפי אחד. אחסנו בקבוקים אלה בחדר תרביות התאים לגישה נוחה. עבור תרבויות הגדלות בתרחיף, עובש יוכר ככדורים צפים בתקשורת.באשר לזיהום חיידקי, זה יהפוך את התקשורת לבנה ועכורה. באופן דומה, עבור תאים דבקים, זיהום עובש יכול להיות מזוהה בקלות כמו כתמים מטושטשים. זיהום חיידקי יהפוך את המדיה הצלולה בדרך כלל, לבנה ועכורה.מינים רבים של מיקופלסמה ניתנים לזיהוי אמין באמצעות בדיקה מבוססת PCR. הרצועה משמאל מראה את תקני המשקל המולקולרי של הדנ"א. ארבעת הפסים מימין הם פקדים חיוביים.לא מופיעים פסים תחת סוגי תאים שנבדקו מכיוון שמיקופלסמה לא זוהתה. מדיה של תרביות תאים תשנה את צבעה מאדום לצהוב אם קיימים מחווני pH. הצבע הצהוב מציין שה- pH נמוך ויש להחליף את המדיה.אם גידולים אחרים או צורות תאים נצפים תחת מיקרוסקופ האור בעת ביצוע ספירת תאים, אז זה עשוי להיות אינדיקטור של זיהום. שים לב, כי ניקוי יסודי של ההמוציטומטר צריך להיעשות לפני ספירת התאים כמו סוג זה של פסולת עשוי להיות נוכח רק על ההמוציטומטר ולא בתרבית התא עצמה. בעוד זיהום הוא אחד החששות העיקריים בעת ביצוע עבודת תרבית תאים, סיכונים אלה ניתן להפחית על ידי ביצוע שיטות וטכניקות המתוארות בסרטון זה.אם בדיקת מיקופלסמה חודשית מבוצעת מדי חודש, אנשי המעבדה מאומנים על בסיס שנתי ושיטות אלה נשמרות בקפדנות, אז התאים שלך יישארו בריאים וללא זיהום. זה גם יעזור להפחית את העלויות הכרוכות ברכישת מדיה יקרה של תרביות תאים, רכישת תאים חדשים, וזה יפחית את זמן ההשבתה של טיהור האינקובטור. זכרו, המפתח לתרבית תאים מוצלחת הוא פעולה מוקדמת על מנת למנוע זיהום מלכתחילה.

cell-culture-techniques-practices-to-avoid-contamination-fungi

Research

JoVE Journal

Biology

ביולוגיה

ככל שהתאים להגיע confluency, הם חייבים להיות subcultured או passaged. סרט הווידאו הזה תדגים נוהל subculturing הן חסיד ותאי ההשעיה.

Trypsinizing ו Subculturing בתאי יונקים

כאשר עובד במעבדה, חובה לצמצם מקורות זיהום. הטכניקה אספטי מתייחס נהלים המאפשרים העברה של תרבויות ריאגנטים תוך הימנעות ממגע עם משטחים לא סטריליים. בטפי להחדרת נוזלים סרולוגית ו micropipettors משמשים למדידת כמויות מדויקות מבלי להתפשר על עקרות של פתרונות המשמשים בניסויים.

טכניקות מעבדה אספטיים: העברות נפח עם טפטפות ו Micropipettors סרולוגיות

כאשר עובדים עם התקשורת ריאגנטים המשמשים מיקרואורגניזמים תרבות, הטכניקה aseptic חייב להיות מתורגל כדי להבטיח זיהום ממוזער. מגוון שיטות ציפוי משמשים באופן שגרתי כדי לבודד, להפיץ, או חיידקים למנות ו הפאג, אשר כולם לשלב נהלים השומרים על עקרות של חומרים ניסיוניים.

טכניקות מעבדה אספטיים: שיטות ציפוי

כאן אנו מציגים פרוטוקול להפיץ תאי vitripennis Homalodisca וHoCV-1 במבחנה. בינוני הוסר מHoCV-1 תרבויות חיוביות וRNA שחולץ כל שעה 24 ל168 שעה. שרידות תא הייתה לכמת ידי מכתים trypan הכחול. חלקיקי נגיף שלמים חולצו לאחר פגיעה. RNA שחולץ היה לכמת ידי qRT-PCR.

רביה של<em&gt; וירוס-01 coagulata Homalodisca</em&gt; דרך<em&gt; Homalodisca vitripennis</em&gt; תרבות תא

להלן פרוטוקול לגידול תאי גזע פלוריפוטנטיים (PSC) ותאי גזע עצביים (NSC) במערכת תרבית תאים סגורה המאפשרת סטריליות ושחזור מקסימליים, ומחליפה את ארון הבטיחות הביולוגית והחממה המסורתיים. ציוד זה עומד בהנחיות שיטות ייצור קליניות טובות (cGMP) ושיטות מעבדה קליניות טובות (cGLP).

Culturing האדם pluripotent ואת עצבי תאי גזע מערכת תרבית תאים סגורות למחקר בסיסי פרה

נייר זה מפרט פרוטוקול להכנת תרבות שיתוף של תאים cryptococcal ו אמבות כי הוא למד באמצעות עדיין, תמונות פלורסנט ברזולוציה גבוהה שידור תמונות מיקרוסקופ אלקטרונים. מומחש כאן היא הדרך שבה נתונים כמותיים יכולים להשלים מידע איכותי כזה.

שימוש משלים של טכניקות מיקרוסקופיים וקריאה פלואורסצנטית ללמוד קריפטוקוקוס-אמבה אינטראקציות

בשל האטימות של האדמה, לא ניתן לדמיין בקלות אינטראקציות בין המיקרובים המרכיבים אותה עם רזולוציה תאית. כאן מוצגים שני כלים מיקרופלואידיים, המציעים הזדמנויות חדשות לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות. המכשירים הם רב-תכליתיים ופשוטים לשימוש, ומאפשרים שליטה מרחבית-טמפורלית גבוהה והדמיה ברזולוציה גבוהה ברמה התאית.

כלים מיקרופלואידיים לחקר אינטראקציות פטרייתיות-מיקרוביאליות ברמה התאית

הפרוטוקול מסכם את שיטות העבודה המומלצות למזעור העומס הביולוגי המיקרוביאלי בסביבת חדר נקי וכולל אסטרטגיות כגון ניטור סביבתי, ניטור תהליכים ובדיקת סטריליות מוצרים. הוא רלוונטי למתקני ייצור ובדיקה הנדרשים לעמוד בתקני פרקטיקה של רקמות טובות ובתקני שיטות ייצור טובות הנוכחיים.

אסטרטגיות בקרה וניטור מיקרוביאליות עבור סביבות חדרים נקיים וטיפולים תאיים

כאן אנו מדגימים כיצד במעבדה שלנו מתחיל גוונים תא גזע עובריים אנושיים תרבות קו ממלאי קפוא.

ES תאים אנושיים: תרבות החל מ תאים קפואים

תא כותרת Encapsulation על ידי טיפות

למד טכניקות תרבית תאים למניעת זיהום על ידי פטריות, חיידקים ומיקופלזמה במעבדה. שיטות אלו מבטיחות תאים בריאים וחיים לחקר ביולוגי מדויק.

טכניקות ושיטות תרבית תאים למניעת זיהום על ידי פטריות וחיידקים במעבדת המחקר לתרביות תאים

גלה סרטונים נוספים