טכניקות ושיטות תרבית תאים למניעת זיהום על ידי פטריות וחיידקים במעבדת המחקר לתרביות תאים

תרבית תאים היא מיומנות עדינה הנחוצה לגידול סוגים שונים של תאים ורקמות בתנאי מעבדה מבוקרים. החשש העיקרי בעת ביצוע עבודת תרבית תאים הוא זיהום. זיהום זה יכול לבוא בצורה של חיידקים, עובש או מיקופלסמה.

הטכניקות והפרקטיקות המתוארות כולן בסרטון זה יבטיחו שהתאים שלכם יישארו בני קיימא, בריאים וללא זיהום. יש להקפיד על נהלים אלה, וכל אנשי המעבדה צריכים לקבל הכשרה לפחות פעם בשנה. לפני תחילת העבודה יש ללבוש מעיל מעבדה נקי המיועד לשימוש בחדר תרביות התאים בלבד.

לבשו כפפות חדשות שלא נגעו במשטחים אחרים. ודאו שהכפפות מתאימות היטב. כפפות ללא אבקת ניטריל הן הטובות ביותר.

מעיל המעבדה והכפפות אינם צריכים להיות סטריליים. כדי להתכונן לעבודה, יש לרסס כפפות, שרוולי מעיל מעבדה ואת פנים ארון הבטיחות הביולוגי עם 70% אתנול. רססו את משטח העבודה, הצדדים, הגב, כל הפריטים בארון ואת לוח הזכוכית הקדמי, הן מבפנים והן מבחוץ.

נגבו את משטח העבודה ואת לוח הזכוכית לייבוש במגבת נייר שאינה מותירה סיבים. הקדישו זמן לסידור סביבת העבודה בתוך הארון. יש לשמור אמבטיות מים בתוך חדר תרביות התאים ולהשתמש בהן רק למטרות תרבית תאים, כגון מדיה מחממת או הפשרת תאים.

אמבטיות המים יש לנקז ולשטוף פעם בשבוע. הגבילו את כמות הפריטים המוכנסים לארון ואל תפריעו לזרימת האוויר בתוך ארון הבטיחות הביולוגי על ידי חסימת הגריל הקדמי או האחורי. רססו את כל הפריטים שהונחו בתוך הארון באתנול 70% ונגבו אותם לייבוש.

התחילו בריסוס החלק העליון של בקבוק המדיה ועשו את דרככם למטה. בעזרת מגבת נייר נקייה, התחילו מהחלק העליון של בקבוק המדיה כדי לנגב אותו לייבוש, ובהדרגה עשו את דרככם לתחתית. אל תחזרו למעלה לכיוון הכובע.

הדרך שבה ארונות אלה עובדים היא שהם מושכים אוויר מהחדר ומהארון עצמו דרך הגריל הקדמי והאחורי. האוויר הולך לכיוון החלק האחורי של הארון ועד למעלה. שם, אוויר מזוהם עובר דרך ערימה של פילטרים, וחלק מהאוויר הנקי המסונן נדחף למטה על אזור העבודה בארון.

אם הארון גדול מספיק כדי להכיל פיפטות סרולוגיות, ניתן למקם אותן בפנים, אחרת, ניתן לאחסן אותן בכלי קיבול המותקן בחלק החיצוני של הארון. מומלץ לבדוק לפני השימוש חורים, קרעים או נקבים באריזה משני צדי הפיפטה. אין לקרוע את העטיפה.

במקום זאת, קלפו בעדינות את קצות העטיפה. מכניסים את הפיפט הסרולוגי לעזר פיפטה ומסירים את העטיפה בתנועת נוזל אחת. אין לרחף מעל בקבוקים או צלוחיות פתוחים.

לא מומלץ להושיט יד מעל בקבוק פתוח או צלוחיות פתוחות, או לעבוד מעל צלוחיות פתוחות. זרימת האוויר בתוך הארונות דוחפת כלפי מטה את כל מה שנמצא בפנים. הושטת יד תאפשר לשרוול או לכפפה שלך להיות מעל פריטים שעלולים לדחוף למטה כל זיהום שנמצא בשרוול שלך, למשל, לתוך תרבית התאים שלך.

במידת האפשר, אין לשפוך נוזלים. במקום זאת, הוסיפו אותם באמצעות פיפטה סרולוגית. מערבבים היטב את התכולה ומתחילים את הבקבוק.

רשמו מה התקשורת משלימה. אם אתם עובדים עם תרביות דבק וזקוקים לבקבוק פלסטיק, רססו את כל האריזה והכניסו אותה פנימה. בכל פעם שהכפפות שלכם התייבשו, רססו אותן שוב באתנול.

כאשר עובדים עם קו תאים דבק, השתמש פיפטות זכוכית autoclaved או פיפטות פלסטיק סטרילי חד פעמי כדי לשאוף מדיה או פתרונות כביסה. הסר בזהירות את מכסה המתכת ממיכל האחסון. בודדו פיפטה אחת מזכוכית על ידי ניעור עדין של המיכל בזווית.

כאשר מגיעים למיכל, הימנעו מלגעת בפיטות אחרות. טפל בפיפטה שנבחרה מקצה אחד בלבד. החליפו במהירות את הפקקים על בקבוקים וצלוחיות בהקדם האפשרי.

הניחו מכסים על משטח העבודה הפוך כדי שהחישוק לא ייגע במשטח העבודה. אין לתפוס את הכובע מלמעלה או מלמטה. במקום זאת, געו בכובעים מהצדדים.

בעת שאיפת נוזלים, השתמשו בבקבוק מלכודת ואקום הממוקם מחוץ לארון במיכל משני על הרצפה. פסולת תיווצר תוך כדי עבודה בתוך הארון. מכיוון שהזזת ידיים פנימה והחוצה מהארון לעתים קרובות מדי תפריע לזרימת האוויר, זה בסדר להשאיר באופן זמני פסולת בתוך הארון.

הניחו אותו בצד כדי שלא יפריע לעבודתכם. רססו בנדיבות כפפות עם 70% אתנול בכל פעם שהן מתייבשות. שפשפו את הידיים זו בזו כדי שלא יטפטפו רטובות.

הערה מהירה על פיפטות סרולוגיות. אם הם נוגעים בטעות במשהו אחר במכסה המנוע, אל תהססו לזרוק אותם החוצה. עדיף להתחיל טרי עם פיפטה סרולוגית נקייה במקום להשתמש בכזו שעלולה להיות מזוהמת.

לפני הצבת התאים באינקובטור, בדקו כיצד הם נראים מתחת למיקרוסקופ. תאים בודדים יש לצפות. זה מצביע על כך שהתאים הושעו מחדש ביסודיות.

אין לדבר, להתעטש, להשתעל או לנשום בכבדות לתוך האינקובטורים. פתיחה וסגירה מהירה של דלתות האינקובטור. השארתם פתוחים זמן רב מהנדרש עלולה לאפשר למזהמים הנמצאים באוויר להיכנס לאינקובטורים.

ודאו שהפקקים של כל הבקבוקים סגורים היטב לפני שאתם מוציאים אותם מהארון. המדיה רגישה לאור. יש לאחסן אותו בחושך בארבע מעלות צלזיוס כאשר אינו בשימוש.

רססו שוב את פנים הארון באתנול 70% לאחר סיום עבודת תרבית התאים ונגבו את פני השטח יבשים במגבת נייר. רוקנו את שקית הפסולת המסוכנת ביולוגית. חזור על תהליך זה והחלף כפפות בעת מעבר לקו תאים אחר.

כאשר עובדים עם תרביות מתלים הגדלות בצלוחיות זכוכית, יש לוודא שהכפפות רטובות. געו ברדיד האלומיניום עם הכפפות הרטובות שלכם ואז רססו רק את תחתית הבקבוק לפני הכנסתו לארון הבטיחות הביולוגי. בעת לקיחת דגימה לספירת תאים, הסר רק צינור אחד של 1.5 מ"ל מהמיכל שלו.

אין לגעת בצינורות האחרים. הניחו את המכסה הפוך על משטח העבודה. אין לגעת בשפה הפנימית.

טפל בו בזהירות מהצדדים והחלף אותו לאחר שתסיים. בעת טיפול בתאי השעיה וצלוחיות זכוכית, הסר בזהירות את חתיכת רדיד האלומיניום המקופלת הכפולה המכסה את כל צוואר הצלוחית. משכו בעדינות את כל ארבע הפינות והניחו את נייר הכסף הפוך על משטח העבודה.

טפלו בבקבוק הזכוכית מלמטה בלבד. אין לגעת בו מהצוואר ברגע שנייר הכסף כבוי. השתמש פיפטה סרולוגית 1 מ"ל כדי לקחת דגימה לספירת תאים.

אל תתנו לתקשורת לטפטף במורד הצד של צלוחיות. אם כן, רססו מגבת נייר עם 70% אתנול ונקו אותה מיד. ודא שהפקקים או רדיד האלומיניום מהודקים לפני הסרת בקבוקים או צלוחיות מארונות הבטיחות הביולוגיים.

השתמש באינקובטורים נפרדים עבור סוגי תאים שונים. זה ימנע זיהום צולב של סוגי תאים שונים. מומלץ להניח את בקבוק מלכודת הוואקום לאיסוף פסולת נוזלית מחוץ לארון על הרצפה במיכל משני המסומן כפסולת.

הצינור מחובר לפילטר אשר מוחלף על בסיס חודשי. הצינור נכנס דרך הצד של הארון. הסר את האשפה המסוכנת ביולוגית לאחר סיום העבודה.

שמרו פרוטוקול שטיפת זכוכית על הקיר ליד הכיור. ראשית, השרו את התאים שהושלכו באקונומיקה של 10% למשך כחמש דקות. לאחר מכן השליכו את תערובת האקונומיקה ושטפו היטב את הבקבוק במים.

מוסיפים סבון עם מים, מקרצפים אותו עם מברשת היטב, שוטפים עם עוד מים. ואז השלב האחרון הוא לשטוף את כלי הזכוכית עם מי DI על הברז בצד ימין. לשטוף צלוחיות זכוכית בהקדם האפשרי, לקרצף את כלי זכוכית היטב.

תאי Sf9 יעזבו את שפת התאים המתים אם לא מקרצפים אותה כראוי. השתמשו בצלוחיות אלה רק לתרבית תאים, כלי זכוכית לתרבית תאים אוטוקלאביים במקום לשלוח אותם למתקן שטיפת זכוכית. השתמש במחזור הוואקום על autoclave במשך 40 דקות זמן מעוקר ו 40 דקות זמן יבש.

יש להפריד אותו מכלי זכוכית באזור המרכזי של המעבדה. ארגן את חדר תרביות התאים כך שכל האספקה תהיה באזור אחד, ובכך למזער את הצורך של חברי המעבדה לצאת מחדר תרביות התאים בחיפוש אחר אספקה. יש לסמן את כל בקבוקי הפלסטיק המשמשים לקצירת תאים ולאחר מכן נעשה בהם שימוש חוזר בתרבית תאים, לשימוש בתרבית תאים בלבד.

השתמשו בבקבוקי תרבית התאים הייעודיים לסוג תא ספציפי אחד. אחסנו בקבוקים אלה בחדר תרביות התאים לגישה נוחה. עבור תרבויות הגדלות בתרחיף, עובש יוכר ככדורים צפים בתקשורת.

באשר לזיהום חיידקי, זה יהפוך את התקשורת לבנה ועכורה. באופן דומה, עבור תאים דבקים, זיהום עובש יכול להיות מזוהה בקלות כמו כתמים מטושטשים. זיהום חיידקי יהפוך את המדיה הצלולה בדרך כלל, לבנה ועכורה.

מינים רבים של מיקופלסמה ניתנים לזיהוי אמין באמצעות בדיקה מבוססת PCR. הרצועה משמאל מראה את תקני המשקל המולקולרי של הדנ"א. ארבעת הפסים מימין הם פקדים חיוביים.

לא מופיעים פסים תחת סוגי תאים שנבדקו מכיוון שמיקופלסמה לא זוהתה. מדיה של תרביות תאים תשנה את צבעה מאדום לצהוב אם קיימים מחווני pH. הצבע הצהוב מציין שה- pH נמוך ויש להחליף את המדיה.

אם גידולים אחרים או צורות תאים נצפים תחת מיקרוסקופ האור בעת ביצוע ספירת תאים, אז זה עשוי להיות אינדיקטור של זיהום. שים לב, כי ניקוי יסודי של ההמוציטומטר צריך להיעשות לפני ספירת התאים כמו סוג זה של פסולת עשוי להיות נוכח רק על ההמוציטומטר ולא בתרבית התא עצמה. בעוד זיהום הוא אחד החששות העיקריים בעת ביצוע עבודת תרבית תאים, סיכונים אלה ניתן להפחית על ידי ביצוע שיטות וטכניקות המתוארות בסרטון זה.

אם בדיקת מיקופלסמה חודשית מבוצעת מדי חודש, אנשי המעבדה מאומנים על בסיס שנתי ושיטות אלה נשמרות בקפדנות, אז התאים שלך יישארו בריאים וללא זיהום. זה גם יעזור להפחית את העלויות הכרוכות ברכישת מדיה יקרה של תרביות תאים, רכישת תאים חדשים, וזה יפחית את זמן ההשבתה של טיהור האינקובטור. זכרו, המפתח לתרבית תאים מוצלחת הוא פעולה מוקדמת על מנת למנוע זיהום מלכתחילה.